CN103656618A - 治疗皮肤创伤的多肽纳米纤维凝胶制剂、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种治疗皮肤创伤的多肽纳米纤维凝胶，由多肽混合溶液与等体积的含有二价阳离子的DMEM/F12细胞培养基溶液混合，引发多肽自组装制成，其特征在于，所述多肽混合溶液含有：A肽(RADARADARADARADA，RADA16-1)：13.0～16.3％；B肽(HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG-CONH₂)：44.2～56.4％；C肽(CDDYYYGFGCNKFCRPR)：27.5～34.3％。本发明的多肽纳米纤维凝胶对于促进烧伤创面愈合及皮肤和组织附属物的再生和修复，起着非常显著的效果。

Description

治疗皮肤创伤的多肽纳米纤维凝胶制剂、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种治疗皮肤创伤的多肽纳米纤维凝胶及其制备方法。 

背景技术

皮烧伤在工程建设、工业生产和日常生活中都是常见的创伤，一般以热力烧伤(包括热液，如水、汤、油等、蒸汽、高温气体、火焰、炽热金属或塑料液体和固体，钢水、钢锭或高温塑料等)为主。随着现代工农业生产技术的发展，化学和电子烧伤亦呈上升的趋势。在森林为灾、易燃易爆物燃烧爆炸、公共场所失为等等均可造成成批的烧伤伤员。据第三军医大学烧伤研究所报告，每年百万人中约有5000～10000万人烧伤。严重烧伤的病人治疗时间较长、并发症多、残废率高，特别是深度烧伤往往导致痊愈后留有不同程度的瘢痕，有的甚至毁容，严重的情况可以造成组织活动受限，功能丧失，即使后期手术整形纠正也存在功能障碍，特别是颜面部深度烧伤的病人，由于毁容使病人最终精神和肉体上承受极大的痛苦。因此，寻找一种理想敷料能尽快的覆盖创面，避免感染，从而起到促进创面表皮生长，恢复皮肤功能，减少创面瘢痕，进一步避免多脏器功能衰竭，具有重要的临床意义。 

现有技术中，各类抗菌素软膏、霜剂或粉剂作为外用敷料被广泛用于人体表面创伤，但是单一的或复合的抗菌素外用敷料仅能用于控制创面的继发性感染，而不能主动促进皮肤上表皮细胞在创面上快速生长，不具有使创面快速愈合的生物作用，且抗菌素的过多使用会造成耐药性。 

理想生物敷料应具备生物相容性好，无毒性和无抗原性，能促进创面愈合的功能，对细菌具有屏障作用，可以抵御细菌的入侵，防止感染。黄国宝在《藻酸盐敷料治疗难愈性烧伤创面的研究》中指出，该生物敷料能增强创面表皮细胞的再生能力、加快表皮细胞移动、促进难愈创面的愈合；细菌纤维素类敷料特有的微型纤丝结构决定了它作为创面敷料时就具有无免疫原性，能调节创面氧张力，促进毛细血管形成，具有良好的透水透气性，其机制是细菌纤维素膜表面含有纳米级的孔隙，既可使抗生素透过从而进入到创面中，又可作为物理屏障防止外部感染，能与创面紧密粘合，减少创面感染；蜂蜜生物敷料是一种新型敷料，具有良好的抗菌性，在极低浓度条件下依然能抑制金黄色葡萄球菌的生长。 在难愈创面上使用蜂蜜生物敷料不仅能够减少自体皮肤的移植，而且能减少抗生素的使用。 

已有报道指出生物活性多肽具有促进细胞分裂分化、促进表皮愈合、增加细胞外基质的合成与分泌、促进皮肤毛细血管网及小血管形成等多种生物学作用。然后，通过使用多条肽链，使其自助装后，制成能够治疗皮肤创伤的多肽纳米纤维凝胶却未见报道。 

源于自然界中广泛存在的蛋白质自组装现象，近年来多肽的自组装逐渐成为材料学和生物医学等领域的研究热点。通过合理调控多肽的分子结构以及改变外界的环境，多肽分子可以利用氢键、疏水性作用、π-π堆积作用等非共价键力自发或触发地自组装形成形态与结构特异的组装体。由于多肽自身具有良好的生物相容性和可控的降解性能，以及可以控制药物的释放，在治疗治疗皮肤创伤时将比现有的同类药物将具有更大的优势。 

自组装短肽(Self-assembly of peptides，简称SAP)RADA16-1是一种含16个氨基酸的小分子多肽，其序列为RADARADARADARADA，在国际公开号WO2005/014615A2中简要描述了该短肽对切割伤创面具有修复功能，而在中国专利CN101036780A中公开了该自组装短肽在制备治疗烧伤创面的药物中的应用，但是却没有公开该短肽可与其他肽链一起使用，有协同加强的作用，也没有给出相关的任何启示。美国专利US2012269830(A1)公开了多肽HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG-CONH₂序列，但是对该序列的功能及作用未给出任何描述或启示。多肽CDDYYYGFGCNKFCRPR序列是Notch配体序列，Notch信号通路是进化中高度保守的信号转导通路，其调控细胞增殖、分化和凋亡的功能几乎涉及所有组织和器官。该通路由Notch受体、配体和CSL蛋白3部分组成。Jagged-1是notch配体的受体，这种肽序列CDDYYYGFGCNKFCRPR能模拟全长Jagged-1的功能，作为激动剂激活Notch信号通路。虽然对Notch配体的研究已经很多，但是却没有将其作为多肽纳米纤维凝胶用于治疗皮肤创伤的报道。 

发明内容

一般治疗创伤药物需要具备的功能有：防止水分和体液的散失，抵御细菌的感染，与创面贴合性好，但不应与创面粘结以免更换敷料时带来二次损伤，透气性好，生物相容性好。但是，本发明的立项目的是研究一种制剂，除了具备上述一般功能之外，还具有促进伤口的自愈合功能。 

本发明的目的在于提供一种治疗皮肤创伤的多肽纳米纤维凝胶。经发明人的潜心研究发现，将以下三条肽链： 

肽链A：RADARADARADARADA(SEQ ID NO：1)13.0～16.3％； 

肽链B：HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO：2)44.2～56.4％； 

肽链C：CDDYYYGFGCNKFCRPR(SEQ ID NO：3)27.5～34.3％ 

按照上述浓度配制成溶液，并调节PH至9.0后，加入等量含有二价阳离子的DMEM/F12细胞培养基溶液引发自组装后，制成多肽纳米纤维凝胶，通过动物实验惊奇地发现：自组装的多肽纳米纤维凝胶对于促进烧伤创面愈合及皮肤和组织附属物的再生和修复，起着非常显著的效果。 

本发明的多肽纳米纤维凝胶，在创伤修复中能够很好地促进皮肤及其它组织细胞的生长和增殖，能够调控各种细胞因子的正常表达，从而加速创面的自愈合，提高创面修复的质量。另外，本发明的多肽纳米纤维凝胶能够保持创面的润湿环境、从而有利于创面的愈合并减少瘢痕的形成。 

本发明人经进一步地深入研究，发现在制备上述多肽纳米纤维凝胶的多肽混合液时，将上述肽链的质量浓度调整到以下范围：肽链A13.0～16.3％；肽链B44.2～56.4％；肽链C27.5～34.3％，其治疗效果将显著。 

上述肽链的质量浓度更优选范围是：肽链A13.7～15.5％；肽链B47.8～53.1％；肽链C30.4～33.7％。 

其中，最佳质量浓度为：肽链A14.9％；肽链B55.2％；肽链C32.8％。 

附图说明

图1是生物相容性检测曲线图。 

图2是对小鼠成纤维细胞起促进作用的生长曲线图。 

具体实施方式

以下将详细描述本发明的具体实施方式和实施例，这些实施例是一些优选例，目的是为了帮助理解本发明，而不是限定本发明的范围，按照本发明的技术方案，以下实施例还能列举更多，本发明并不限于这些实施例，根据申请人大量的实验结果证明，在本发明所提出的浓度范围之内，均可以达到本发明的目的，本领域技术人员根据本发明所公开的内容，对本发明作出的一些非本质的改进和调整，均属于本发明的保护范围。 

1.多肽纳米纤维凝胶的制备 

取三条多肽按一定的比例混合后加入无菌的NaOH(0.1mol/L)和双蒸水，所加入NaOH(0.1mol/L)和双蒸水的量分别为总容量的1/3量，然后放置在37℃，30min，溶解成为澄清液体，调节PH至9.0。然后加入双蒸水定容至总容量。 

将已经溶解的多肽混合物取200μl，加入200μl含有二价阳离子的DMEM/F12细胞培养基溶液引发自组装，自组装完成后调节PH至7.0。 

用透射电子显微镜对自组装的多肽纳米纤维凝胶进行检测和图像分析。 

以上试剂可选用任何一种合格的市贩试剂。 

2.自组装的多肽纳米纤维凝胶的生物相容性检测： 

①细胞准备：小鼠成纤维细胞株用含体积为0.1的胎牛血清DMEM培养基培养。消化后制备细胞悬液，加入96孔细胞培养板，每孔加入100μl细胞悬液，含有1×104个细胞放入37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时。 

②加入自组装的多肽纳米纤维凝胶，反复吹打后形成均匀的混悬液，加入含体积为0.1的胎牛血清DMEM培养基培养稀释调整浓度。取稀释的自组装多肽纳米纤维凝胶加入到接种的小鼠成纤维细胞的96孔板中，每孔加入10μl，形成5组浓度梯度。加好后放入37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时，倒置显微镜观测细胞形态。 

③生物细胞活性检测：在上述孔板加入CCK-8溶液10μl，避光放置37℃培养箱中培养4小时。取出用酶标仪读取A值，激发光波长为450nm。观察各组A值差异。 

3.体外实验检测自组装多肽纳米纤维凝胶对成纤维细胞生长的促进作用： 

购买小鼠成纤维细胞株用含体积为0.1的胎牛血清DMEM培养基培养。消化后制备细胞悬液，加入96孔细胞培养板，每孔加入100μl细胞悬液，含有1×104个细胞放入37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时。去上清液加入配好的自组装多肽纳米纤维凝胶每孔加入10μl，并设空白对照和阳性对照组。加好后放入37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时，倒置显微镜观测细胞形态和酶仪检测。 

4.体内动物实验探讨自组装的多肽纳米纤维凝胶是否具有促进烧伤创面愈合及皮肤和组织附属物的再生和修复作用： 

动物模型制备： 

①热源(热源为烧瓶而非铜棒)直径2cm长15cm的烧瓶1个，加入25ml水，内置一个有100℃刻度的温度计，此时烧瓶底的压力为1.872kPa，烧瓶可备多个。普通电热水壶1个。 

②脱毛：5％戊巴比妥钠4mg/20g，腹腔内注射麻醉，剪除背部长毛，硫化钡脱毛剂均匀涂于背部，片刻后清除毛发，清水洗净脱毛区。24h后同样麻醉，行烫伤创面制备。 

③烫伤；实验环境温度为25℃。将烧瓶放入电热水壶中，加热至烧瓶内温度为95℃时取出带有温度计的烧瓶，在温度为90℃时，轻放在小鼠背部皮肤上，烫伤时间为15s，然后将大鼠置室温25℃的环境中分笼饲养，自由进食水。在伤后48h观察大鼠伤后创面外观情况，同时取创面的皮肤标本，常规固定，HE染色，进行光镜组织学观察，检查此时表皮烧伤程度是否符合深二度烧伤创面。 

烧伤深二度的肉眼观察为烫伤后创面皮肤立即变白，轻度肿胀，光泽差，肉眼可明显区分烫伤部位与正常区域。48h可见与创面相同的痂。组织学病理切片显示：表皮层细胞及毛囊上皮细胞核固缩，真皮组织深部受损，但皮下深部可见残余的毛囊。 

若检查结果为表皮已达到深二度烧伤创面，则模型建立成功之。 

实施例 

多肽A、B、C均为Sigma公司的纯粉末试剂，含有二价阳离子的DMEM/F12细胞培养基溶液为biohermes公司市售试剂。小鼠成纤维细胞株采用L929细胞株。 

其它试剂和细胞株均为一般实验室用普通试剂，可选用任何一家生物公司的正规产品。 

按照上面的步骤配制成如表1所示不同浓度的多肽混合溶液，用0.1mol/L NaOH或0.1mol/LHCL溶液调节PH值。然后取0.2～lml多肽混合溶液，加入体积的由多肽混合溶液与等体积的含有二价阳离子的DMEM/F12细胞培养基溶液混合，引发多肽自组装制成多肽纳米纤维凝胶，然后用0.1mol/L NaOH或0.1mol/L HCL溶液将凝胶溶液PH调至7.0。 

清除小鼠模型创面的分泌物和坏死组织，用碘伏溶液清洗消毒创面。根据不同组别分别涂抹空白(生理盐水)和自组装多肽纳米纤维凝胶组。在烧伤早期每12h涂抹1次，3d后每天涂抹1次。另外术后第3d开始换药时要先用含有庆大霉素的盐水棉球清洗创面，清除液化物，然后继续行涂抹，每天涂药1次，直至皮片逐渐扩大相互融合而痊愈。计 算愈合率＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积。并进行形态学检测和分子生物学检测。 

表1：各实验例的愈合率统计 

多肽自组装体系既保持了多肽的生物功能，又实现了在分子水平上控制分子排列，通过如实施例1所示的比例配方，将多肽A、B、C混合，然后自组装成多肽纳米纤维凝胶，在生物相容性检测试验中显示出良好的相容性(如图1)，并且对小鼠成纤维细胞生长起着促进作用(图2)，如表1所示，在体内动物实验中，本发明自组装的多肽纳米纤维凝胶对促进烧伤创面愈合及皮肤和组织附属物的再生和修复作用起着显著的效果，尤其是实施例1中的结果表现极为显著。 

另外，上述实验例中，虽然此处未用数据显示，但是在预备实验中，将三条多肽混合后溶解后，若不将PH调至9.0，在电镜下观察将会影响多肽自组装的效果，进而影响自组装后的多肽纳米纤维凝胶对促进烧伤创面愈合及皮肤和组织附属物的再生和修复作用。 

从实施例2、3、4与实施例1、5、7对比来看，可知三种多肽若不按照本发明的浓度范围配方，对促进烧伤创面愈合及皮肤和组织附属物的再生和修复作用明显不如本发明的多肽纳米纤维凝胶，因此按照本发明的多肽纳米纤维凝胶，根据三种多肽的不同配比，在自组装过程中产生了难以预见的协同作用，经本发明人的不懈努力，终于证实了本发明的技术效果。 

Claims (6)

1.一种治疗皮肤创伤的多肽纳米纤维凝胶，由多肽混合溶液与等体积的含有二价阳离子的DMEM/F12细胞培养基溶液混合，引发多肽自组装制成，其特征在于，所述多肽混合溶液含有：

A肽(RADARADARADARADA，RADA16-1)：13.0～16.3％；

B肽(HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG-CONH₂)：44.2～56.4％；

C肽(CDDYYYGFGCNKFCRPR)：27.5～34.3％。

2.如权利要求1所述的多肽纳米纤维凝胶，其中，所述多肽混合溶液中A肽含量为14.9％。

3.如权利要求1所述的多肽纳米纤维凝胶，其中，所述多肽混合溶液中B肽含量为55.2％。

4.如权利要求1所述的多肽纳米纤维凝胶，其中，所述多肽混合溶液中C肽含量为32.8％。

5.如权利要求1至3任意一项所述的多肽纳米纤维凝胶，其特征在于，所述多肽混合溶液中的PH值为9.0。

6.一种制备如权利要求1至3任意一项所述的多肽纳米纤维凝胶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：分别称量取三种多肽，加入总容量1/3量的无菌0.1mol/LNaOH溶液，以及总容量1/3量的双蒸水，制成溶液；

步骤2：用0.1mol/L NaOH溶液调节PH至9.0，然后用双蒸水定容至总容量，配制成多肽混合溶液；

步骤3：在所述多肽混合溶液中加入等体积的含有二价阳离子的DMEM/F12细胞培养基溶液引发自组装；

步骤4：用0.1mol/L HCL溶液将自组装后的多肽纳米纤维凝胶的PH调节至7.0。