ES2335723T3

ES2335723T3 - Composiciones de celulas restringidas capaces de crecer rapidamente que producen materiales supresores de la proliferacion y sus usos de las mismas.

Info

Publication number: ES2335723T3
Application number: ES99971668T
Authority: ES
Inventors: Shirin Asina; Kanti Jain; Albert L. Rubin; Barry Smith; Kurt Stenzel
Original assignee: Rogosin Institute Inc
Current assignee: Rogosin Institute Inc
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 1999-11-09
Publication date: 2010-03-31
Anticipated expiration: 2019-11-09
Also published as: PT1128731E; AU1472600A; DE69941599D1; EP1128731A1; US6224912B1; HK1039439A1; CA2334483C; KR20040075922A; WO2000027207A1; RU2268735C1; US6818230B2; RU2236855C2; WO2000027207A8; US20030143739A1; DK1128731T3; KR20050055797A; US20020168415A1; JP2005343899A; NO20101615L; JP4294223B2

Abstract

Una perla sólida que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente que, cuando se restringen al estar atrapadas en dicha perla, producen un material que suprime la proliferación celular, donde dicho material se difunde a través de dicha perla sólida que contiene agarosa y está cubierta de agarosa, donde ese material tiene un peso molecular de al menos 30 kD, donde dichas células que proliferan rápidamente son seleccionadas de células cancerosas o células madre no humanas, y donde las células restringidas y células a suprimir se originan de diferentes especies.

Description

Composiciones de células restringidas capaces de crecer rápidamente que producen materiales supresores de la proliferación y usos de las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la restricción de la proliferación de células en o capaces de crecer rápidamente en fase logarítmica que, cuando su proliferación se restringe físicamente en un material semipermeable biocompatible, producen cantidades normalmente no expresadas o aumentadas de un factor o factores expresados normalmente capaces de inhibir el crecimiento de otras células de proliferación rápida del mismo o diferente tipo y/u origen. Estas células restringidas son denominadas en la presente memoria como células proliferativas. Una lista no limitante de células proliferativas que pertenecen a esta categoría incluye células neoplásicas, células cancerosas, y células no cancerosas que incluyen, pero no se limitan a, células embriónicas, células madre, y células en una fase regenerativa posterior al daño tisular que incluyen hepatocitos, fibroblastos y células epiteliales. Las estructuras que son una característica de la invención pueden ser usadas "como tales" o para producir material tal como concentrados con un peso molecular aproximado definido, que también tienen un efecto anti-proliferativo sobre las células que proliferan rápidamente asociadas a enfermedades o condiciones tales como, por ejemplo, cáncer, o para controlar el crecimiento de células para prevenir ciertos problemas médicos que pueden aparecer a partir del crecimiento celular incontrolado, tal como la formación de cicatrices tras la operación.

Antecedentes y Técnica anterior

La encapsulación de varios materiales biológicos en materiales biológicamente compatibles, que está bien documentada en la literatura, es una técnica que ha sido usada durante algún tiempo, aunque con éxito limitado. Ejemplos del estado de la técnica son las Patentes de EE.UU. Nos. 5.227.298 (Weber et al.); 5.053.332 (Cook et al.); 4.997.443 (Tice et al.); 4.971.833 (Larsson et al.); 4.902.295 (Walthall et al.); 4.798.786 (Tice et al.); 4.673.566 (Goosen et al.); 4.647.536 (Mosbach et al.); 4.409.331 (Lim); 4.392.909 (Lim); 4.352.883 Lim); y 4.663.286 Tsang et al.). También está la Patente de EE.UU. No. 5.643.569 de Jain et al. Jain et al. discuten, con algo de detalle, la encapsulación de islotes en varios materiales biocompatibles. Los islotes producen insulina, y el uso de los materiales descritos por Jain et al. en el tratamiento de la diabetes se enseña en la misma. La Patente de EE.UU. No. 5.888.497 de Jain et al. describe perlas implantables de agarosa cubiertas de agarosa que tienen células cancerosas restringidas en las mismas las cuales producen más de un material que suprime el crecimiento de células cancerosas no restringidas que un número igual de las mismas células cancerosas no restringidas. La patente de Jain et al. discute, con algo de detalle, las aproximaciones previas que se dan en el estado de la técnica en la terapia de transplante. Estas se enumeran en la presente memoria.

Se conocen cinco aproximaciones principales para proteger el tejido transplantado de la respuesta inmune del hospedador. Todas implican intentos de aislar el tejido transplantado del sistema inmune del hospedador. Las técnicas de inmunoaislamiento usadas hasta la fecha incluyen: cámaras de difusión extravascular, cámaras de difusión intravascular, cámaras de ultrafiltración intravascular, microencapsulación, y macroencapsulación. Hay muchos problemas asociados con métodos del estado de la técnica, que incluyen una respuesta fibrótica del hospedador al material del implante, inestabilidad del material del implante, difusión limitada de nutrientes a través de membranas semipermeables, permeabilidad de secretagogos y producto, y retraso en la difusión a través de barreras de membranas semipermeables.

Por ejemplo, un procedimiento de microencapsulación para rodear células, tejidos y otras membranas lábiles viables dentro de una membrana semipermeable se desarrolló por Lim en 1978. (Lim, Research report to Damon Corporation (1978)). Lim usó microcápsulas de alginato y poli L-lisina para encapsular islotes de Langerhans (denominados a partir de ahora como "islotes"). En 1980, se describió la primera aplicación exitosa in vivo para esta nueva técnica en la investigación de la diabetes (Lim et al., Science 210: 908 (1980)). La implantación de estos islotes microencapsulados dio como resultado un estado euglucémico sostenido en animales diabéticos. Otros investigadores, sin embargo, que repitieron estos experimentos, encontraron que el alginato causa una reacción tisular y fueron incapaces de reproducir los resultados de Lim et al. (Lamberti et al. Applied Biochemistry an Biotechnology 10 : 101 (1984); Dupuy et al. J. Biomed. Material and Res 22: 1061 (1988); Weber et al., Transplantation 49: 396 (1990); y Doon-shiong et al., Transplantation Proceedings 22: 754 (1990)). La solubilidad acuosa de estos polímeros ahora se considera como la responsable de la estabilidad y la biocompatibilidad limitada de estas microcápsulas in vivo (Dupuy et al., más arriba, Weber et al., más arriba, Doon-shiong et al., más arriba, y Smidsrod, Faraday Discusión of Chemical Society 57: 263 (1974)).

Iwata et al., (Iwata et al., Jour. Biomedical Material and Res. 26: 967 (1992)). Utilizaron agarosa para la microencapsulación de islotes pancreáticos alogénicos y descubrieron que podía ser usada como medio para la preparación de microperlas. En su estudio, se microencapsularon de forma individual 1500-2000 islotes en agarosa al 5% y se implantaron dentro de ratones diabéticos inducidos con estreptozocina. El injerto sobrevivió durante un largo periodo de tiempo, y los receptores mantuvieron la normoglicemia de forma indefinida.

Sin embargo, su método tiene varios inconvenientes. Es torpe e inexacto. Por ejemplo, muchas perlas permanecen parcialmente cubiertas y algunos cientos de perlas en forma vacía de agarosa. Por ello, se necesita tiempo adicional para separar los islotes encapsulados de las perlas vacías. Además, muchas de las microperlas implantadas se reúnen en la cavidad pélvica, y se necesita un gran número de islotes en perlas individuales completamente cubiertas para lograr normoglicemia. Además, Las perlas transplantadas son difíciles de recuperar, tienden a ser frágiles, y liberan islotes fácilmente en daños leves.

También se ha ensayado un procedimiento de macroencapsulación. Se hicieron macrocápsulas de varios materiales diferentes, tales como poli-2-hidroxietil-metacrilato, ácido de polivinilcloruro-c-acrílico, y acetato de celulosa para el inmunoaislamiento de islotes. (Véase Altman et al., Diabetes 35 : 625 (1986); Altman et al., Transplantation : American Society of Artificial Internal Organs 30 : 382 (1984); Ronel et al., Jour. Biomedical Material Research 17 : 855 (1983); Klomp et al., Jour. Biomedical Material Research 17: 865-871 (1983)). En estos estudios, sólo se logró una normalización transitoria de la glicemia.

Archer et al., Journal of Surgical Research 28 : 77 (1980), usaron fibras huecas de co-polímero acrílico para evitar de forma temporal el rechazo de xenotransplantes de islotes. Describieron supervivencia a largo plazo de injertos pancreáticos dispersados de múrido neonatal en fibras huecas fueron transplantadas dentro de hámsteres diabéticos. Recientemente, Lacr et al., Science 254 : 1782-1784 (1991) confirmaron sus resultados, pero encontraron que el estado euglucémico era una fase transitoria. Encontraron que cuando los islotes se inyectan dentro de la fibra, se agregan dentro del tubo hueco con la resultante necrosis en la porción central de las masas de islotes. La necrosis central excluía la prolongación del injerto. Para resolver este problema, usaron alginato para dispersar los islotes en la fibra. Sin embargo, este experimento no se ha repetido de forma intensa. Por ello, la función de la membrana como un medio de transplante de islotes en seres humanos es cuestionable.

La patente de Jain et al discutida más arriba describe que encapsular células secretoras en un material de gel hidrofílico permeable da como resultado un material funcional no inmunogénico, que puede ser transplantado dentro de animales, se puede almacenar durante largos periodos de tiempo, y es terapéuticamente útil in vivo. La macroencapsulación de las células secretoras proporcionó una técnica más eficaz y manejable para el transplante de células secretoras.

La patente no discute la incorporación de células capaces de proliferar de forma rápida.

Una inspección de la literatura sobre encapsulación de células revela que, tras la encapsulación, las células casi siempre producen menos materiales que los que producen cuando no están encapsuladas. Véase Lloyd-George et al., Biomat. Art. Cell & Immob. Biotech. 21 (3): 323-333 (1993); Schinstine et al., Cell Transplant 4(1) : 93-102 (1995); Chicheportiche et al., Diabetologica 31 : 54-57 (1988); Jaeger et al., Progress In Brain Research 82 : 41-46 (1990); Zekorn et al., Diabetologica 29 : 99-106 (1992); Zhou et al., Am. J. Physiol. 274 : C1356-1362 (1998); Darquy et al., Diabetologica 28 : 776-780 (1985); Tse et al., Biotech & Bioeng. 51 : 271-280 (1996); Jaeger et al., J. Neurol. 21 : 469-480 (1992); Hortelano et al., Blood 87(12): 5095-5103 (1996); Gardiner et al., Transp.. Proc. 29: 2019-2020 (1997). Ninguna de estas referencias aborda la incorporación de células capaces de proliferar rápidamente dentro de una estructura que las atrapa y restringe su crecimiento, pero sin embargo, permite la difusión de materiales dentro y fuera de la estructura.

Una teoría relacionada con el crecimiento de masas cancerosas compara estas masas, por ejemplo tumores, con órganos normales. Los órganos sanos, por ejemplo, el hígado, crecen hasta un tamaño particular, y luego no crecen más; sin embargo, si se separa una porción de hígado, este se regenerará hasta cierta extensión. Este fenómeno también se observa con los tumores. Para resumir, se ha visto que, si una porción de un tumor se separa, las células en la porción restante del tumor empezarán a proliferar muy rápidamente hasta que el tumor resultante alcanza un tamaño particular, tras lo cual la proliferación decrece o cesa. Esto sugiere que hay alguna regulación interna de las células cancerosas.

Compendio de la invención

La invención, que se verá en la siguiente descripción, muestra que cuando células capaces de proliferar rápidamente están físicamente restringidas tal como atrapadas, su ritmo de proliferación decrece marcadamente, y producen cantidades inesperadamente altas de material que, cuando se aplica a células de proliferación rápida no restringidas, inhibe la proliferación de estas células no restringidas. La capacidad para retardar la proliferación de células cancerosas ha sido un hito en oncología desde su principio. Por ello, la utilidad terapéutica de esta invención con respecto a su tratamiento del cáncer y otros estados y condiciones de enfermedad causados por la rápida proliferación celular serán claros y se elaborarán en la presente memoria. El material producido no parece estar limitado por el tipo de célula de rápida proliferación usada, ni por la especie animal de la que se originan las células que proliferan rápidamente. Además, el efecto no parece que sea específico de la especie, ya que las células restringidas de una primera especie producen material que inhibe la proliferación de células no restringidas de una segunda especie. También, con respecto al cáncer, el efecto no parece que sea específico del tipo de cáncer, ya que las células restringidas de un primer tipo de cáncer producen material que inhibe la proliferación de células no restringidas de otro tipo de cáncer.

Ni el efecto parece necesitar una respuesta inmune. El efecto anti-proliferativo se ve en sistemas in vitro, donde no se usan células inmunitarias. Por ello, el efecto anti-proliferativo no se puede atribuir a respuestas inmunológicas clásicas.

Por ello, la invención se relaciona con una perla sólida que contiene agarosa y está cubierta de agarosa, como estructura biocompatible que restringe la proliferación y selectivamente permeable que contiene células que proliferan rápidamente. La estructura restringe las células que proliferan rápidamente ya que están atrapadas en la misma y luego producen un material que se difunde a través de dicha perla sólida de agarosa que está cubierta de agarosa, donde dicho material tiene un peso molecular de al menos 30 kD. Tal material suprime la proliferación celular en comparación con un número igual de las mismas células que proliferan rápidamente cuando no están restringidas, donde dichas células que proliferan rápidamente son seleccionadas de células cancerosas o células madre no humanas, y donde las células restringidas y las células a suprimir se originan de diferentes especies.

Además, la presente invención se refiere a un proceso para preparar una perla que contiene agarosa, que está cubierta de agarosa como estructura biocompatible que restringe la proliferación y selectivamente permeable que contiene células que proliferan rápidamente tal como se define más arriba que comprende

(a) suspender dichas células de que proliferan rápidamente en una solución de agarosa,

(b) formar una perla semisólida suave a partir de dichas células suspendidas que proliferan rápidamente de la etapa (a),

(c) incubar dicha perla semisólida de la etapa (b) mientras se forma una perla sólida,

(d) cubrir dicha perla sólida de la etapa (c) con agarosa para obtener una perla que contiene agarosa que está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente,

y cultivar las estructuras durante un periodo de tiempo suficiente para restringir las células que proliferan rápidamente de forma que produzcan material que suprime la proliferación de las células que proliferan rápidamente a suprimir en comparación con un número igual de células que proliferan rápidamente no restringidas del mismo tipo, donde las células restringidas y las células a suprimir son como se definen más arriba.

Más adicionalmente, la presente invención se relaciona con una composición que es producida al restringir células que proliferan rápidamente en perlas como una estructura biocompatible que restringe la proliferación y selectivamente permeable y cultivar dichas células restringidas en perlas en un medio de cultivo apropiado para que produzcan un material que suprime el crecimiento celular, recubrir el medio resultante, y formar un concentrado a partir del medio separando la fracción que tiene un peso molecular de al menos 30 kD, donde dichas células que proliferan rápidamente y dichas perlas son como se definen más arriba. Cuando las estructuras denominadas se colocan en un medio de cultivo, el material denominado abandona la estructura y entra en el medio de cultivo.

También se ha encontrado que se puede lograr un potente efecto anti-proliferativo sometiendo a filtración el medio condicionado obtenido al cultivar las estructuras de la invención en medio de cultivo. Los concentrados resultantes tienen efectos anti-proliferativos extremadamente fuertes.

El material, el medio condicionado, y/o los concentrados derivados de los mismos también pueden ser útiles para inducir la producción del material anti-proliferativo por otras células que proliferan rápidamente no restringidas.

En realizaciones preferidas, las células restringidas son células cancerosas, pero las ventajas de usar células no cancerosas para tratar el cáncer y otras condiciones proporcionan beneficios adicionales, fácilmente obvias para aquellos expertos en la materia.

Estas, y otras características de la invención, se verán a partir de la siguiente descripción.

Descripción detallada de realizaciones preferidas Ejemplo 1

Este ejemplo, y los que le siguen, emplea células RENCA. Estas son células de adenocarcinoma renal espontáneo de ratones BALB/C, que están ampliamente disponibles, que se han mantenido tanto en cultivos in vitro como in vivo. Véase Franco et al., Cytokine Induced Tumor Immunogenicity, 181-193 (1994).

Se descongelaron a 37ºC muestras de células RENCA, y luego se colocaron en matraces de cultivo tisular que contienen Medio Modificado de Dulbecco (D-MEM), que ha sido suplementado con suero bovino al 10%, penicilina (100 \mu/ml) y estreptomicina (50 \mug/ml), para dar lo que se denominará desde ahora como "medio completo".

Se hicieron crecer las células hasta confluencia, y luego se tripsinizaron, seguido de lavado con Solución Salina Equilibrada de Hank, y luego con el medio completo denominado más arriba.

Con el fin de determinar si las células RENCA produjeron tumores de forma eficaz, se inyectaron, de forma intraperitoneal, dos ratones BALB/C con 10^{6} de estas células. Se observaron los ratones, durante un periodo de 3-4 semanas. Clínicamente, éstos parecían sanos durante las primeras dos semanas, y exhibieron actividad normal. Luego, las manifestaciones clínicas de cáncer se volvieron evidentes. Un ratón murió tras 23 días, y el segundo, tras 25 días. Tras la muerte, se examinaron los ratones y se observaron numerosos tumores de tamaños variables. Algunos de los tumores exhibían hemorragia.

Una muestra de tumor, tomada de uno de los ratones, se fijó en formalina al 10% para el posterior examen histológico.

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Ejemplo 2

Tras mostrar que las células RENCA crecen in vivo, se llevaron a cabo estudios para determinar si estas células crecían cuando se restringen en la estructura de la invención.

Se crecieron las células RENCA hasta confluencia, tal como se describe más arriba, se tripsinizaron, y lavaron, también como se describe más arriba. Luego, se prepararon muestras de entre 60.000 y 90.000 células. Luego, las células se centrifugaron a 750 RPM y se separó el líquido. Luego, las células se suspendieron en soluciones de atelocolágeno al 1%, en solución salina tamponada con fosfato, a un pH de 6,5.

Se preparó una solución al 1% de agarosa de baja viscosidad en medio mínimo esencial (MEM), se mantuvo a 60º C y luego se añadieron 100 \mul de este a la suspensión de células RENCA y atelocolágeno, descrita más arriba. Luego, los materiales se transfirieron, inmediatamente, como una gran gotita única, dentro de aceite mineral estéril a temperatura ambiente. La mezcla formó una sola perla semi sólida y suave. Este procedimiento fue repetido para producir un número de perlas.

Tras un minuto, las perlas se transfirieron a un medio completo, tal como se describe más arriba, a 37ºC. Luego, las perlas se lavaron tres veces en Medio Mínimo Esencial (MEM) que contiene los antibióticos enumerados más arriba. Luego, se incubaron las perlas durante toda la noche a 37ºC, en una atmósfera de aire humidificado y CO_{2} al 5%. Tras la incubación de las perlas, ahora sólidas, se transfirieron a una cuchara estéril que contenía 1 ml de agarosa al 5% en MEM. Las perlas se hacen rodar en la solución 2-3 veces para cubrirlas de forma uniforme con agarosa. Las perlas se transfirieron a aceite mineral antes de solidificar la agarosa, para alcanzar una superficie externa suave. Tras 60 segundos, las perlas se lavaron, cinco veces, con medio completo a 37ºC para separar el aceite. Se siguió con incubación durante toda la noche (37ºC, atmósfera de aire humidificado y CO_{2} al 5%).

Estas perlas que contienen RENCA se usaron en los siguientes experimentos.

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Ejemplo 3

Antes de llevar a cabo investigaciones in vivo, fue necesario determinar si las células RENCA podían crecer en perlas preparadas de la manera descrita más arriba.

Para hacer esto, las perlas preparadas tal como se discute en el Ejemplo 2 se incubaron en el medio descrito en el Ejemplo 2, durante un periodo de tiempo de tres semanas, bajo las condiciones deseadas. Luego, tres de las perlas se cortaron en pequeñas piezas, y se cultivaron en matraces de cultivo clásicos, permitiendo contacto directo con el matraz y el medio de cultivo.

La observación de estos cultivos indicó que las células crecían y formaban colonias RENCA clásicas. Esto indica que las células han permanecido viables en las perlas.

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Ejemplo 4

Luego, se llevaron a cabo experimentos in vivo. En estos experimentos, las perlas se incubaron durante siete días a 37ºC. Luego, los ratones sometidos recibieron transplantes de perlas. Para hacer esto, cada uno de los cuatro ratones recibieron una incisión en la línea media, llevada a cabo intraperitonealmente. Se transplantaron tres perlas, cada una de las cuales contenía 60.000 células RENCA. Luego se cerraron las incisiones (cierre de dos capas), usando una sutura absorbente. Los cuatro ratones (BALB/C) eran ratones macho normales, con un peso entre 24-26 gramos, y parecían estar sanos. Se realizaron dos grupos de control. En el primer grupo, dos ratones recibieron tres perlas que no contienen células RENCA, y en el segundo, dos ratones no se trataron con nada.

Tres semanas tras la implantación, todos los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 10^{6} células RENCA. Dieciocho días después, un ratón control murió. Luego, todos los ratones restantes se sacrificaron, y se evaluó la presencia o ausencia de tumor.

Los ratones control mostraron numerosos tumores, mientras que los ratones que recibieron los implantes de células encapsuladas en perlas mostraron sólo pequeños nódulos aislados a lo largo de la cavidad.

Estos resultados alentadores sugieren el diseño de los experimentos expuestos en los siguientes ejemplos.

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Ejemplo 5

En estos experimentos, se simularon cánceres establecidos inyectando células RENCA bajo una cápsula renal de cada uno de los seis ratones BALB/C. Quince días después, los ratones se dividieron en dos grupos. Los tres ratones en el primer grupo recibieron tres perlas, tal como se describe en el Ejemplo 4, más arriba. El segundo grupo (el grupo control) recibió perlas que no contenían células RENCA.

Durante los 4-5 días iniciales, los ratones que recibieron implantes que contienen célula RENCA parecían letárgicos y su pelo se volvió de punta. A partir de entonces, se volvieron normales. El grupo control permaneció enérgico, sin cambio en la condición del pelo.

Diez días tras la implantación (25 días tras la inyección de células RENCA), sin embargo, el grupo control se volvió perezoso y exhibían abdomen hinchado. Uno de los tres ratones control murió a los catorce días tras la implantación de las perlas. Se sacrificaron los animales.

Las cavidades corporales de los ratones control mostraron abundante hemorragia, con numerosos tumores a lo largo del canal alimenticio, hígado, estómago y pulmones. Todos los órganos de la cavidad abdominal se volvieron indistinguibles debido al crecimiento desenfrenado del tumor. Los ratones que recibieron las perlas con células RENCA encapsuladas, sin embargo no mostraron hemorragia, y sólo unos pequeños nódulos en el canal alimenticio. Además, la comparación de los grupos de ensayo y control mostró que el grupo de ensayo, los nódulos no progresaron más allá de su crecimiento inicial bajo la cápsula renal y antes de la implantación de la macroperla.

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Ejemplo 6

In vitro, el crecimiento de células RENCA inoculadas libremente es inhibido cuando dichas células son incubadas junto con células RENCA encapsuladas en microperlas. Un conjunto adicional de experimentos se llevó a cabo para determinar si este efecto se observaba con otras células.

Se obtuvo una línea celular de adenocarcinoma, es decir, MMT (tumor mamario de ratón) a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Se prepararon células MMT encapsuladas, tal como se describe, más arriba, con células MMT, para producir perlas que contienen 120.000 o 240.000 células por perla. Tras la preparación de las perlas, se usaron para determinar si éstas podían inhibir la proliferación de células RENCA in vivo. Específicamente, se prepararon dos placas petri de seis pocillos, vía inoculación con 1x10^{4} células RENCA por pocillo, en 4 ml de medio. En cada placa, tres pocillos sirvieron como control, y tres como ensayo. Uno de los tres pocillos control en cada placa recibió una perla vacía. Cada uno de los otros pocillos recibió o dos o tres perlas vacías. El segundo conjunto de pocillos se trató de forma similar, con pocillos que reciben uno, dos o tres perlas que contienen 120.000 0 240.000 células MMT. Los pocillos se incubaron a 37ºC durante 1 semana, tras la cual se tripsinizaron las células RENCA, se lavaron, y contaron, usando un hemocitómetro. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

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TABLA 1

1

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Ejemplo 7

Siguiendo los resultados en el Ejemplo 6, se llevaron a cabo los mismos experimentos usando 1x10^{4} células MMT como el inoculante (es decir, células libres) en lugar de células RENCA. El experimento se llevó a cabo con precisión como el ejemplo 6. Los resultados se muestran en la Tabla 2 más abajo.

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TABLA 2

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Estos resultados fomentan un experimento in vivo. Este se presenta en el ejemplo 8.

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Ejemplo 8

Se usó la línea celular de tumor mamario de ratón (MMT) descrita más arriba. Usando los protocolos mostrados más arriba, se prepararon implantes que contenían 120.000 células por perla, y 240.000 células por perla.

El modelo experimental usado fue el modelo animal de más arriba. Se dividieron veintidós ratones en grupos de 4 (control), 9 y 9. El primer grupo, es decir, los controles, además se dividió en tres grupos: dos recibieron implantes de una perla vacía, uno recibió dos perlas vacías, y uno recibió tres perlas vacías.

Dentro del Grupo experimental A (9 animales), las perlas contenían 120.000 células, mientras que en el Grupo experimental B, las perlas contenían 240.000 células. Dentro de los Grupos A y B, había tres sub-divisiones, cada una de las cuales contenía tres animales. Los subgrupos recibieron una, dos o tres perlas que contenían células MMT.

Durante los primeros días, los ratones en los Grupos A y B estaban letárgicos, con pelo puntiagudo. Esto persistió durante aproximadamente cinco días, tras los cuales se observó comportamiento normal. Veintiún días tras la implantación, todos los animales recibieron inyecciones de 40.000 células RENCA.

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Tras otros veinte días, los animales control exhibieron abdomen hinchado, y pelo extremadamente puntiagudo. Un animal control murió veinticinco días tras la implantación, mientras que los ratones control restantes parecían terminales. Se sacrificaron todos los ratones, y se observó el desarrollo del tumor. Estas observaciones se encuentran en la Tabla 3, más abajo:

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TABLA 3

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Estos resultados muestran que, de dieciocho ratones tratados, trece no mostraron enfermedad. De los ratones en el Grupo A, un ratón exhibió unos pocos nódulos pequeños (+), y otro ratón mostró unos pocos tumores (++).

Dentro del Grupo B, un ratón que recibió una perla, y un ratón que recibió dos perlas mostraron unos pocos tumores, enredados con el intestino. Uno de los ratones que recibió tres perlas ha desarrollado un gran tumor sólido y estaba aparentemente muy enfermo (+++). Todos los ratones control tenían numerosos tumores (++++). Los resultados mostraron que las células de tumor mamario de ratón encapsuladas inhibían la formación de tumores.

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Ejemplo 9

Como se sugirió más arriba, la práctica de la invención da como resultado la producción de material que inhibe y/o previene la proliferación de células tumorales. Esto se exploró adicionalmente en el siguiente experimento.

Se hicieron perlas adicionales, tal como se describe más arriba en el ejemplo 2, excepto que no se incluyó atelocolágeno. Por ello, estas perlas son perlas de agarosa/agarosa. Se incorporaron células RENCA, como se describió, dentro de estas perlas, de nuevo como se describió más arriba.

Luego, se usaron dos conjuntos de placas de seis pocillos como grupos control y experimental. En el grupo control, los pocillos se rellenaron con 4 ml de medio completo RPMI (suero fetal de ternera al 10% y 11 ml/l de penicilina). Cada pocillo del grupo control se inoculó con 10.000 células RENCA.

En el grupo experimental, el medio completo RPMI se condicionó añadiendo material garantizado por incubación de diez perlas que contienen RENCA (120.000 células por perla), en una placa petri de 35x100 mm que contiene 50 ml del medio completo RPMI. Tras cinco días de incubación, se recolectó el medio de estas placas, se re colocaron 4 ml de éste en casa pocillo de ensayo. Luego, estos pocillos se inocularon cada uno con 10.000 células RENCA.

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Todas las placas (control y experimental) se incubaron a 37º C durante cinco días. Tras el periodo de incubación, las células se tripsinizaron, lavaron, combinaron y contaron usando un hemocitómetro. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

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Estos resultados muestran que las células, cuando están restringidas en, por ejemplo, las perlas de los ejemplos, producían algo de material que dio como resultado la supresión de la proliferación de células tumorales.

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Ejemplo 10

El experimento expuesto más arriba mostraba que el crecimiento de células RENCA, en medio condicionado, fue aproximadamente la mitad del crecimiento de las células en el medio control. Los experimentos mostrados en la presente memoria examinaron si la supresión de la proliferación puede continuar tras congelar el medio condicionado.

Se preparó medio condicionado RENCA incubando diez perlas que contienen RENCA durante cinco días. La incubación se hizo en placas petri de 35x100 mm, con 50 ml de medio completo RPMI, a 37ºC. Tras la incubación, se recogió y almacenó el medio a -20ºC. Se preparó medio condicionado incubando perlas que contienen células MMT (tumor mamario de ratón). Las perlas contenían 240.000 células por perla; por lo demás, todas las condiciones fueron las mismas. Los medios congelados se descongelaron a 37ºC, y luego se usaron en los siguientes ensayos. Se usaron tres placas de seis pocillos para cada tratamiento, es decir, (i) medio control de RPMI, (2) medio condicionado congelado RENCA, y (3) medio condicionado congelado MMT. Se colocó un total de 4 ml de medio dentro de cada pocillo. Luego, todos los pocillo se inocularon con 10.000 células RENCA, y se incubó a 37ºC, durante cinco días. Tras la incubación, se tomaron dos placas de muestras de cada pocillo, se tripsinizaron, lavaron, combinaron y contaron en un hemocitómetro. A los ocho días, las tres placas restantes de cada pocillo se ensayaron de la misma forma.

Resultados siguientes:

TABLA 5

5

Cuando estos resultados se comparan con aquellos del ejemplo 6, más arriba, se verá que, mientras que el medio condicionado RENCA congelado/descongelado no suprimió la proliferación en la misma extensión que lo hizo el medio condicionado MMT congelado/descongelado (comparar ejemplos 6 y 7), este suprimió, sin embargo, la proliferación.

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Ejemplo 11

Los experimentos mostrados más arriba mostraron que el medio condicionado congelado de macroperlas que contienen RENCA o MMT inhibe la proliferación de células RENCA in vitro. Los experimentos mostrados en la presente memoria examinaron si el medio condicionado de las macroperlas de RENCA o MMT, preparado por filtración como concentrados de 30 kD y 50 kD, podría inhibir la proliferación de células RENCA in vivo. Los efectos del medio condicionado de las macroperlas se comparó con los efectos del medio condicionado en presencia de células RENCA y MMT no restringidas que crecen en cultivos monocapa, para determinar si las células tumorales no restringidas crecidas hasta confluencia también hacen material regulador de la proliferación.

Para estos experimentos, se usaron 10 macroperlas, cada una de las cuales que contiene 120.000 células RENCA o MMT (es decir, 1,2 x 10^{6} células totales) para condicionar el medio (RMPI completo) durante un periodo de 5 días. En paralelo, se sembraron en un plato de cultivo 1,2 x 10^{6} células RENCA o MMT, es decir, el mismo número de células, y se dejaron proliferar como una monocapa durante un periodo de 4 días en medio RPMI completo. Luego, el medio se cambió, y este medio se recogió veinticuatro horas más tarde. La razón de la diferente longitud de tiempo de exposición de las perlas y las células no restringidas fue la diferencia en los números de células en las monocapas frente a las perlas (3 a 5 veces más células en las monocapas) al final del periodo de cinco días. En otras palabras, las células no restringidas crecieron mucho más rápidamente que las células encapsuladas, que fueron de 3-5 veces más células.

Se usaron filtros de 30 kD y 50 kD para preparar concentrados del medio condicionado que, presumiblemente podría contener el material activo, y también podrían eliminar materiales metabólicos tóxicos y/o de deshecho como factores de confusión en los experimentos. Estos contaminantes, que son bien conocidos, son demasiado pequeños para ser conservados en un filtro de 30 kD. También se ensayaron los filtrados, pero cualquier interpretación de los resultados con este material es complicado por la presencia de los productos de deshecho celular. También se usó un medio libre de suero (AIM V) en algunos experimentos para estar seguros de que ningún efecto del suero per se fue controlado.

Esencialmente, se recogió el medio condicionado, de tres a cinco días tras añadirle las macroperlas, o veinticuatro horas tras haber añadido el nuevo medio a las células no restringidas. Luego, el medio se colocó en un filtro de tubo de ensayo con un filtro apropiado (o un filtro de 30 kD o de 50 kD), y se centrífugo durante 90 minutos. El material que permaneció sobre el filtro se denomina como "concentrado", mientras que el que pasa a través del filtro y se recoge al final del tubo es el filtrado.

Los resultados, enumerados en las siguientes Tablas 6, 7 y 8, muestran que cuando se usó el medio condicionado que resulta de las células RENCA restringidas en las macroperlas, éste inhibió la proliferación de las células RENCA en aproximadamente un 52% en dos experimentos separados. El concentrado de 50 kD inhibió la proliferación en aproximadamente un 99%, en ambos casos, mientras que el concentrado de 30 kD inhibió la proliferación en aproximadamente un 97%.

6

7

TABLA 8 Inhibición del Crecimiento de Células RENCA en Medio Condicionado de Macroperlas de RENCA y Concentrado (Medio AIM V)

8

Un punto importante del experimento es que las células MMT y las células RENCA, cuando se atrapan y restringen en las macroperlas suprimen la proliferación de las células RENCA, indicando que el efecto restrictivo de la proliferación no es específico del tipo de tumor. Estos experimentos confirman aquellos del Ejemplo 8 en los que las macroperlas que contienen MMT suprimían la proliferación de las células RENCA in vivo. Además, se extendieron los descubrimientos que indican que el material liberado de las macroperlas dentro del medio contiene moléculas que son al menos de 30 kD en peso molecular que son responsables, en parte, del efecto restrictivo de la proliferación. Finalmente, estos experimentos muestran que las células RENCA y MMT restringidas en macroperlas producen mucho más del material supresor de la proliferación que las mismas células crecidas hasta confluencia en cultivos de monocapa.

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Ejemplo 12

Los experimentos mostrados muestran que los medios condicionados de macroperlas de RENCA y MMT contienen material liberado de las células de proliferación restringida en la macroperla que puede inhibir la proliferación de células RENCA in vivo e in vitro. De forma importante, los experimentos muestran que el efecto inhibidor de la proliferación no es específico del tipo de tumor. Los experimentos mostrados en la presente memoria examinan si el efecto es también independiente de la especie en la que originalmente surge el tumor. Por ello, se examinaron in vitro los efectos inhibitorios de la proliferación del células tumorales de una línea celular derivada de cáncer de mama en células RENCA (usando macroperlas y medio condicionado de macroperlas) y también células MMT (usando sólo medio condicionado de macroperlas).

Los métodos para estos estudios in vitro fueron similares a aquellos descritos en los ejemplos de más arriba. Se encapsularon en macroperlas 100.000 células MCF-7 (células de cáncer de mama humano), y las macroperlas MCF-7 resultantes se incubaron con células RENCA (10.000 por pocillo) durante 5 días para evaluar los efectos inhibitorios de las macroperlas en la proliferación. Además, el medio condicionado de macroperlas MCF-7 se preparó durante un periodo de incubación de 5 días y se ensayó en células RENCA y MMT. La proliferación celular se midió durante un periodo de 5 días.

Los resultados se muestran más abajo:

TABLA 9 Resultados de macroperlas MCF-7 en células diana renca

9

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TABLA 10 Resultados del medio condicionado MCF-7 en células diana renca

11

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TABLA 11 Resultados del medio condicionado MCF-7 en células diana MMT

12

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Los resultados muestran que MCF-7, una línea celular de adenocarcinoma humano de mama, cuando se restringe la proliferación en macroperlas, produce un material que inhibe la proliferación de células de adenocarcinoma renal de ratón y células tumorales de cáncer de mama en ratón en un grado significativo (30-70%) tal como se demuestra por las propias macroperlas y el medio condicionado derivado de las mismas. Esto indica que el efecto inhibidor de la proliferación de las células cancerosas de crecimiento restringido es independiente del tipo de tumor y de la especie del origen del tumor, es decir, ratón o ser humano.

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Ejemplo 13

Los experimentos mostrados más arriba demuestran que la línea celular de adenocarcinoma de mama derivada de humano (MCF-7), cuando se restringe su crecimiento en macroperlas, produce la inhibición de la proliferación in vitro de células de adenocarcinoma de mama y renal en ratón. Los experimentos mostrados en la presente memoria examinan si existe un efecto paralelo de macroperlas que contienen MCF-7 sobre el crecimiento in vivo de células tumorales RENCA.

Se inyectaron dieciocho ratones Balb/c con 20.000 células RENCA de forma intraperitoneal. Tras tres días se dividieron los ratones en dos grupos. El Grupo 1 tenía seis ratones y el Grupo 2 tenía los restantes doce ratones. El grupo 1 de ratones, los controles, fueron transplantados con tres macroperlas vacías cada uno. El Grupo 2 de ratones recibió cada uno tres macroperlas que contienen MCF-7 (100.000 células por perla). Tras veinticinco días, se sacrificaron 2 ratones del Grupo 1 y tres ratones del Grupo 2. Se sacrificó el mismo número en el día veintiséis y los ratones restantes se sacrificaron en el día veintisiete.

En la necroscopia, las cavidades peritoneales de los ratones control se observó que estaban completamente repletas de tumores, y los órganos normales eran difíciles de identificar. Se clasificó esto como +++`(1000%) de intensidad de tumor. En los ratones tratados, la intensidad del tumor se estimó como + (10-20%).

Estos resultados muestran que las macroperlas que contienen células de adenocarcinoma de mama humano son capaces de inhibir el crecimiento del tumor de adenocarcinoma de célula renal en ratones, confirmando de nuevo que el efecto inhibidor del crecimiento tumoral/proliferación de célula cancerosa ni es específico del tipo de tumor ni es específico de especie.

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Ejemplo 14

Los experimentos mostrados más arriba demuestran que el efecto inhibidor del crecimiento tumoral/proliferación celular de tumores restringidos por macroperlas ni es específico del tipo de tumor ni es específico de especie. Los experimentos mostrados en la presente memoria examinan si las células de adenocarcinoma de mama de ratón de proliferación restringida (macroperlas) pueden inhibir el crecimiento de tumores mamarios espontáneos y tumores de resultan de la inyección de células MMT.

Los ratones C3H tienen muy alta incidencia del desarrollo de tumores mamarios en su esperanza de vida. Siete ratones en riesgo de desarrollar tales tumores mostraron tumores a los dieciséis meses de edad. A este tiempo, cinco de los siete ratones fueron implantados con cuatro macroperlas de MMT que contienen 100.000 células cada una. Los dos ratones control restantes recibieron cuatro macroperlas vacías cada uno. Los dos ratones control desarrollaron grandes tumores y murieron en tres meses tras los implantes de las perlas. Los ratones tratados se sacrificaron once meses después de los implantes de macroperlas de MMT. Las macroperlas, órganos y tumores recuperados se examinaron grosso modo e histológicamente. La tinción con hematoxilina y eosina de las macroperlas de MT mostró células viables. Los tumores pre-existentes no aumentaron de tamaño, y no hubo evidencia de ningún desarrollo tumoral nuevo.

También se realizaron experimentos en los que las células tumorales MMT se inyectaron de forma subcutánea en la región torácica. Se dividieron catorce ratones C3H en dos grupos. El grupo de cinco ratones control fueron implantados con tres macroperlas vacías cada uno. Los nueve ratones tratados recibieron tres macroperlas que contienen MMT (240.000 células) cada una. Tres semanas tras la implantación todos los catorce ratones fueron inyectados de forma subcutánea en el área mamaria con 20.000 células MMT cada uno.

En veinticinco a treinta días, los cinco ratones del grupo control se pusieron malos con formación evidente de tumores, y todos murieron en el día treinta y cinto tras la inyección. Los nueve ratones tratados, observados semanalmente, continuaron sin ninguna evidencia de formación tumoral o enfermedad durante este periodo. De diez a doce meses tras la inyección del tumor, cuatro de los nueve ratones tratados desarrollaron bultos y pérdida de pelo en parches. Los cinco ratones restantes fueron implantados de nuevo con tres macroperlas de MMT treinta meses tras la inyección tumoral inicial. Un ratón murió tres días tras la cirugía, pero en la necropsia estaba totalmente libre de tumor. Los cuatro ratones supervivientes se sacrificaron ocho meses después del segundo implante de microperlas. La necropsia mostró proliferación mínima o no proliferación de tumor.

Una observación adicional de estos experimentos fue que las perlas recuperadas de la primera implantación contenían células tumorales viables basadas en histología y su capacidad para reanudar patrones de crecimiento tumoral agresivo en cultivo tisular tras la separación de la perla.

Los resultados de estos experimentos muestran que los efectos de inhibición de crecimiento tumoral/proliferación celular de células cancerosas, en este caso células de adenocarcinoma mamario de ratón, pueden influenciar en el desarrollo y crecimiento de tumores que aparecen espontáneamente y tumores inducidos experimentalmente que aparecen a partir de inyección de células tumorales dentro del área mamaria.

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Ejemplo 15

Los experimentos mostrados más arriba demuestran un efecto inhibitorio del crecimiento tumoral/proliferación celular de células con proliferación restringida en macroperlas que están caracterizados por su eficacia a través de los tipos de tumor y a través de las especies, así como en tumores espontáneos e inducidos artificialmente. Los experimentos descritos en la presente memoria extienden estos descubrimientos para examinar los efectos de células derivadas de adenocarcinoma de próstata humano (ARCap10), células de adenocarcinoma renal de ratón (Balb/c) (células RENCA), y células de adenocarcinoma mamario (C3H) de ratón (MMT) con proliferación restringida atrapadas en macroperlas sobre la proliferación de células tumorales ARCap10 y el crecimiento tumoral de ARCap10 en ratones desnudos (Nu/Nu).

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En la primera serie de experimentos, se inyectaron de forma subcutánea en el costado quince ratones Nu/Nu con 2,5x10^{6} células ARCap10. En el día veinte tras la inyección, en cuyo tiempo el diámetro máximo medio del tumor era 0,5 cm, los ratones se dividieron en dos grupos. Nueve fueron implantados con cuatro macroperlas de ARCap10 (1,0x10^{5} células por macroperla) cada uno, y seis ratones control recibieron cuatro macroperlas vacías cada uno.

Diez días tras la implantación, cinco de los ratones control tenían tumores vascularizados muy grandes (2,5 cm de diámetro medio) y un ratón mostró un tumor ligeramente menor (menos de 0,5 cm). En el grupo tratado, cinco ratones mostraron regresión completa de los tumores iniciales, y todos permanecieron libres de tumores hasta su sacrificio a los ocho meses. Dos ratones no mostraron crecimiento tumoral, es decir, sus tumores tenían el mismo diámetro máximo que tenían en el momento de la implantación de las macroperlas., y dos ratones mostraron tumores que se habían agrandado desde la implantación de las macroperlas.

Los resultados (volumen y tamaño del tumor (l x w x h)) de un experimento en el que macroperlas que contienen RENCA (1,2x10^{5}) se implantaron dieciocho días después de la inyección subcutánea en los flancos de 3,0x10^{6} células tumorales ARCap10 por animal en 4 ratones Nu/Nu se muestran más abajo:

TABLA 12 Tamaño de tumores observados en ratones tratados (en mm)

13

TABLA 13 Volumen de tumores observados en ratones tratados

14

En otro experimento 10 ratones Nu/Nu se inyectaron con 2,5x10^{6} células APCap10, con seis de los ratones mostrando desarrollo tumoral sesenta y cuatro días tras la inyección. A tres de estos ratones se les dieron cuatro macroperlas de MMT (2,4x10^{5} células) a cada uno y tres recibieron macroperlas vacías. Los resultados se muestran más abajo:

TABLA 14 Tamaño de tumores observados en ratones tratados (en mm)

15

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TABLA 15 Tamaño de tumores observados en ratones control (en mm)

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Los resultados de estos experimentos además confirman la naturaleza del efecto inhibidor del crecimiento tumoral, a través de las especies y de la naturaleza del tumor, de la restricción de la proliferación en tumores de varios tipos. Además, estos experimentos demuestran la capacidad de las células cancerosas con proliferación restringida no sólo para suprimir el crecimiento tumoral y para prevenir la formación de tumores, sino también para causar la regresión de tumores in vivo.

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Ejemplo 16

Los experimentos mostrados más arriba mostraron que las células cancerosas con proliferación restringida de varios tipos de tumores y especies pueden inhibir la proliferación de los mismos y diferentes tipos de células cancerosas in vitro y prevenir la formación de tumores espontáneos e inducidos, prevenir el crecimiento de tumores, y causar la regresión de tumores in vivo en un efecto que es independiente de las especies y del tipo de cáncer. El experimento mostrado en la presente memoria describe la extensión de los descubrimientos a otra especie (conejo) y un tumor de conejo que se conoce ha sido inducido de forma viral (VX2).

En este experimento, se inyectó un Conejo Blanco New Zealand (1,13 kilos) de forma intramuscular en un muslo (dos lugares) con 0,5 ml de una pasta tumoral de VX2 (caracterizado por ser capaz de pasar a través de una aguja #26) en cada lugar. A las 3,5 semanas, apareció un tumor de 5 cm x 2,5 cm (Lxw) en el muslo dorsal y tumores de 3 cm de diámetro estaban presentes en el muslo ventral. En este punto, se implantaron 211 macroperlas de forma intraperitoneal (108 perlas de células RENCA, 63 perlas de células MMT, y 40 perlas que contienen células de cáncer de pecho humanas MCF-7). En dos días, el tumor en el muslo dorsal encogió en aproximadamente 50%; sin embargo, los dos tumores ventrales no cambiaron. El animal se sacrificó diez días tras la implantación de las macroperlas. En la necropsia, hubo una clara diferencia entre los tumores dorsales y ventrales, ya que el primero era mucho más pequeño que el que había en el momento de la implantación de las macroperlas, mientras que los dos tumores ventrales fueron hemorrágicos y necróticos.

Este experimento extiende los descubrimientos de la eficacia de la restricción de la proliferación de varios tipos de células cancerosas en relación a la prevención, captura e incluso regresión del crecimiento tumoral a otra especie, el conejo, añade un tumor de origen vírico a la lista de tipos de cáncer, y además mantiene la naturaleza a través del tipo de tumor y de especie del efecto de inhibición del crecimiento, mientras se usó una combinación de macroperlas que contienen células cancerosas renales de ratón, de mama de ratón y de mama humanas. Además, el experimento añade un mayor modelo animal al ensayo in vivo de la eficacia de la restricción de la proliferación de células cancerosas para el tratamiento del cáncer.

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Ejemplo 17

Los experimentos mostrados más arriba muestran que la restricción de la proliferación de varios tipos de células tumorales da como resultado su capacidad de inhibir el crecimiento de células del mismo o diferente tipo in vitro y previene la formación de, suprime el crecimiento de, o causa la regresión de varios tipos de tumores in vivo y que los efectos vistos son independientes del tipo y las especies del tumor. Los experimentos mostrados en la presente memoria evaluaron la viabilidad a largo plazo de las células cancerosas RENCA con proliferación restringida en macroperlas de agarosa-agarosa mantenidas en cultivo durante periodos de 1 mes, 6 meses, 2 años, y 3 años usando técnicas histológicas, de cultivo, e in vivo. Las macroperlas con MMT se mantuvieron en cultivo hasta seis meses. Además, se examinaron las macroperlas con RENCA y MMT recuperadas de ratones Balb/c y C3H respectivamente tras periodos de 2 a 8 meses tras la implantación para células tumorales viables por técnicas histológicas y
de cultivo.

Para estos experimentos, se prepararon macroperlas de agarosa-agarosa con 1,2x10^{5} células RENCA o 2,4x10^{5} células MMT. Éstas se examinaron histológicamente (tinción con hematoxilina y eosina) y por técnicas de cultivo para la viabilidad celular y las características tumorales en intervalos descritos más arriba. Para las macroperlas con RENCA, el número celular aumentó aproximadamente de 3 a 5 veces en el primer mes con una multiplicación adicional posterior en seis meses. Tras un año, hubo un aumento continuo en la masa celular, pero el ritmo de la proliferación celular disminuyó. Tras dos años, empezó a aparecer un material amorfo en el centro de la perla, y la masa/número de células no parecía que aumentara, aunque todavía eran evidentes figuras mitóticas. Tras tres años, parece que había algo más de material amorfo en el centro de la perla, pero el número/masa celular era estable. Las macroperlas de MMT han sido seguidas durante seis meses, pero el patrón temprano de la proliferación celular y la apariencia de la perla es similar a las de RENCA.

Para la evaluación de la viabilidad y el comportamiento biológico de las células RENCA y MMT a intervalos descritos más arriba, se aplastaron diez perlas y se sembraron en dos o más matraces de cultivo tisular de 25 cm2 en medio RPMI completo. Luego, se observaron los matraces para el crecimiento celular. A intervalos de uno a seis meses, el número de células viables recuperables de las perlas aumentó. Al año, el número de células RENCA que crecen a partir de la perla aplastada parece que era similar al de los seis meses. A los dos y tres años, la proporción de células viables parece que es algo menor, reduciéndose a aproximadamente 20% del número máximo que alcanzaron en la perla (es decir, en su estado restringido) tras tres años en cultivo.

Para la evaluación de las macroperlas de RENCA y MMT tras implantación in vivo (periodos de 1-4 años para macroperlas con RENCA y hasta 8 meses para macroperlas con MMT), se han utilizado hasta la fecha las técnicas histológicas. Los patrones de proliferación y masa celular son muy similares a aquellos de las perlas mantenidas en cultivo para los correspondientes periodos de tiempo, es decir, las células aumentan en número al menos hasta 4 meses para RENCA y 8 meses para MMT.

Para las otras líneas celulares cancerosas usadas, tales como MCF-7 y ARCap10, los patrones de viabilidad en macroperlas son similares a aquellos observados para RENCA y MMT.

Estos experimentos muestran que las células cancerosas pueden ser mantenidas in vitro durante periodos de hasta 3 años e in vivo durante periodos de al menos 8 meses en un medio de proliferación restringida y que éstas mantienen su viabilidad durante estos periodos con clara demostración del número de células aumentados hasta al menos un año. Esto es importante no sólo para la capacidad de crear y almacenar materiales para el tratamiento del cáncer, sino también para la capacidad de las células con proliferación restringida de sacar material que suprime el crecimiento tumoral en animales de sangre caliente durante periodos continuos prolongados probablemente necesarios para el tratamiento con éxito del cáncer experimental o que se da de forma natural.

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Ejemplo 18

Los experimentos mostrados más arriba muestran que las células cancerosas de varios tipos pueden ser mantenidas bajo condiciones de proliferación restringida durante largos periodos de tiempo (hasta 3 años) con retención de su capacidad para proliferar, para formar tumores, y liberar materiales que inhiben la proliferación celular, y materiales incluso regresivos que previenen y suprimen el crecimiento tumoral. Los experimentos mostrados en la presente memoria evalúan la posible toxicidad de implantes a largo plazo (un año) de macroperlas de agarosa-agarosa que contienen células cancerosas en ratones Balb/c.

Se implantaron siete ratones Balb/c con 3 macroperlas con RENCA cada uno (1,2x10^{5} células por perla). Inmediatamente después de la cirugía los ratones parecían enfermos (pelo puntiagudo y letargia) durante unos pocos días, pero se volvieron sanos de nuevo tras esto. Todos los ratones sobrevivieron en aparente buena salud durante un periodo de al menos un año, con un ratón muerto de viejo y otro por causas no relacionadas. Se sacrificaron todos los ratones. En la necropsia, no se observaron anormalidades, tales como fibrosis, peritonitis, o crecimiento tumoral. Todos los órganos observados parecían normales, aunque se observó algo de adherencia de las perlas a las superficies serosas de los intestinos, especialmente donde hay bucles intestinales. No se ha observado interferencia con la función normal o la estructura de los intestinos.

Estos resultados muestran que las macroperlas de agarosa-agarosa que contienen células cancerosas son bien toleradas en animales experimentales durante un periodo de un año. Estos descubrimientos muestran que las perlas de células cancerosas con proliferación restringida pueden ser utilizadas in vivo para la prevención, supresión y regresión de la proliferación celular, que incluyen tumores in vivo de varios tipos.

Los ejemplos anteriores describen la invención, que incluye, inter alia, composiciones de materia que puede ser usada para producir material que suprime o controla la proliferación de células que proliferan rápidamente, particularmente la supresión de células cancerosas. Estas composiciones comprenden células en un crecimiento en fase logarítmica (fase proliferativa rápida) atrapadas en un material selectivamente permeable para formar una estructura que restringe la proliferación de las células atrapadas. Como resultado de estar atrapadas, las células producen de forma inesperada altas cantidades de material que suprime la proliferación de células que proliferan rápidamente, tales como células cancerosas. Las células restringidas producen más material que las cantidades comparables de células no restringidas.

La materia usada para hacer las estructuras de la invención incluye cualquier materia biocompatible que contiene agarosa, cubierta de agarosa que restringe el crecimiento de células que proliferan rápidamente, induciéndolas por ello a producir mayores cantidades de material supresor del crecimiento/proliferación celular. La estructura tiene un tamaño de poro adecuado tal que el material supresor de más arriba puede difundir al medio externo, y prevenir que entren en la estructura los productos o células del sistema inmunitario del hospedador y causen el rechazo de las células cancerosas o, si no, impedir su capacidad de sobrevivir y continuar la producción del material deseado. La materia usada para formar la estructura también será capaz de mantener células viables (con proliferación restringida pero que sobreviven) tanto in vitro como in vivo, preferiblemente durante periodos de hasta varios años manteniendo la entrada de nutrientes apropiados, la eliminación de productos de deshecho, y un medio intra-estructural físico-químico compatible. La materia usada para preparar la estructura es preferiblemente bien tolerada cuando se implanta in vivo, lo más preferiblemente durante toda la duración de la implantación en el hospedador.

Una lista de materiales y combinaciones de materiales no limitante que pueden ser utilizados incluyen alginato-poli-(L-lisina); alginato-poli-(L-lisina)-alginato; alginato-poli-(L-lisina)-polietilenimina; quitosán-alginato; polimetacrilato de hidroxietilo-meracrilato de metilo; carbonilmetilcelulosa; K-carragenano; quitosán; agarosa-polietersulfona-hexadimetrina-bromuro (Polibreno); etilcelulosa; geles de sílice; y combinaciones de los mismos.

Las estructuras que comprenden las composiciones de materia pueden tener muchas formas, tales como una perla, una esfera, un cilindro, una cápsula, una hoja, o cualquier otra forma que es adecuada para la implantación en un individuo, y/o cultivo en un entorno in vivo. El tamaño de la estructura puede variar, dependiendo de su uso eventual, y estará claro para el experto en la materia.

Las estructuras de la invención son selectivamente permeables, de forma que los nutrientes pueden entrar en la estructura, y por ello el material que inhibe la proliferación así como los deshechos celulares pueden abandonan la estructura. Para uso in vivo, es preferible que las estructuras prevengan la entrada de productos o células del sistema inmunitario de un hospedador que podrían causar el rechazo de las células restringidas, o si no, impedir la capacidad de las células para producir el material supresor de la proliferación.

Otro aspecto de la invención incluye composiciones que son útiles para suprimir la proliferación de células cancerosas. Estas composiciones son preparadas cultivando células restringidas tal como se describe más arriba en un medio de cultivo apropiado, seguido de la recuperación del medio condicionado resultante. Luego, los concentrados pueden formarse a partir del medio condicionado, por ejemplo, separando fracciones que tienen pesos moleculares de más de 30 kD o más de 50 kD, que tienen altos efectos anti-proliferativos en células cancerosas.

Según la invención, las células proliferativas son seleccionadas de células cancerosas o células madre no humanas. Las células cancerosas es un tipo preferido de célula, y ejemplos de tipos de células cancerosas que pueden ser usadas incluyen células de cáncer renal, células de cáncer de mama, células de cáncer de próstata, células de coriocarcinoma y demás. Las células cancerosas puede ser de origen epitelial, mesotelial, endotelial o célula germinal, e incluyen células cancerosas que generalmente no forman tumores sólidos tales como células de leucemia.

Tal como se aclarará en esta descripción, un aspecto adicional de la invención es el uso de las estructuras y composiciones según la invención para métodos terapéuticos para tratar individuos que padecen enfermedades hiperproliferativas tales como cáncer, inflamación, fibrosis, y trofoblastosis. También es un aspecto de la invención controlar el crecimiento de células en una fase proliferativa de forma que se reproduzcan de una forma controlada. Esto es particularmente útil, por ejemplo, en el control de la producción de tejido cicatrizante y queloides, que evitan las adhesiones tras cirugía abdominal, y posiblemente en enfermedades hiperproliferativas de piel tales como soriasis. Cuando se usa en un contexto terapéutico, tal como se elaborará más abajo, el tipo de célula restringida en la estructura no es el mismo tipo de célula que causa (o que puede causar) el padecimiento del paciente. Tal método implica insertar al menos una de las estructuras de la invención en un individuo, en una cantidad suficiente para causar la supresión de la proliferación celular en un individuo. Preferiblemente, las estructuras y composiciones de la presente invención son usadas para el tratamiento del cáncer y el individuo es un ser humano, aunque es aplicable a otros animales, tales como animales domésticos, animales de granja, o cualquier tipo de animal que padece cáncer.

La composición de la presente invención puede ser usada como terapia principal en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas, y como un tratamiento adyuvante en combinación con otras terapias. Por ejemplo, los pacientes pueden ser tratados con composiciones y métodos descritos en la presente memoria, junto con terapias conocidas tales como radioterapia, quimioterapia, tratamiento con otros materiales biológicamente activos tal como citoquinas, moléculas antisentido, hormonas esteroídicas, terapia génica, y similares. Las composiciones y métodos de la invención también pueden ser usados junto con procedimientos quirúrgicos para tratar el cáncer, por ejemplo, implantando las macroperlas tras la resección de un tumor para prevenir su crecimiento de nuevo y las metástasis. Los cánceres que están presentes en un estado no operable pueden hacerse operables por tratamiento con las composiciones anti-proliferativas de la invención.

Las composiciones de la invención también pueden ser usadas de forma profiláctica en individuos con riesgo de desarrollar cáncer, por ejemplo, presencia de factores individuales de riesgo, historia familiar de cáncer, generalmente historia familiar de cáncer de un tipo específico (por ejemplo cáncer de mama), y exposición a carcinógenos ocupacionales u otros carcinógenos o agentes que promueven el cáncer. Para la profilaxis contra el cáncer, se administra al individuo con identificación de uno o más factores de riesgo una cantidad profiláctica eficaz de las estructuras de la invención.

Como se indicó en los ejemplos, más arriba, el efecto anti-proliferativo no está limitado por el tipo de célula proliferativa usada, ni por las especies de las que se origina la célula proliferativa. Por lo tanto, se puede administrar a un individuo estructuras que contienen, por ejemplo, células cancerosas de un primer tipo con un segundo tipo diferente de cáncer. Además, pueden usarse células proliferativas de una especie diferente de la especie a tratar pueden en las estructuras administradas. Por ejemplo, las células de cáncer de ratón pueden ser restringidas en las estructuras de la invención, y luego administradas a un humano. Todavía otro aspecto de la invención es el uso de concentrados, como se describe en la presente memoria, como agentes terapéuticos. Estos concentrados se pueden preparar como se describen en la presente memoria, y luego ser administrados a un individuo con una enfermedad hiperproliferativa tal como cáncer, o a un paciente con necesidad de controlar el ritmo del crecimiento celular, tal como un paciente en post-operación que tiene una herida en un lugar donde puede ser perjudicial un exceso de tejido cicatrizante o que simplemente no se desea. Todas las realizaciones descritas más arriba se pueden usar para preparar concentrados. Por ejemplo, tras el cultivo in vitro de estructuras que contienen células cancerosas de ratón, se pueden preparar concentrados y luego administrarlos a seres humanos. También, como se discute más arriba, el tipo de célula cancerosa usada para preparar el concentrado puede ser, pero no es necesario, del mismo tipo de cáncer que padece el individuo. Por ello, se pueden usar células cancerosas de mama de múrido, por ejemplo, para preparar un concentrado que se usa para tratar a un ser humano con melanoma, o un individuo con cáncer de próstata puede tener algunas de sus células del cáncer de próstata, separadas, atrapadas en una estructura de la invención, cultivadas en un medio apropiado, y luego tener el medio condicionado resultante filtrado para producir un concentrado. Se debe tener en mente que el medio condicionado resultante de los cultivos in vitro de las estructuras de la invención también es parte de la invención.

También son parte de la invención los procesos para hacer las estructuras de la invención, así como los concentrados de la invención. En el caso de los concentrados, simplemente se puede cultivar las estructuras de la invención durante un tiempo suficiente para producir una cantidad suficiente de material anti-proliferativo y luego separar las porciones deseadas del medio condicionado resultante, por ejemplo, por filtración con un filtro que tiene un punto de corte apropiado, tal como 30 kilodaltons o 50 kilodaltons.

Claims

1. Una perla sólida que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente que, cuando se restringen al estar atrapadas en dicha perla, producen un material que suprime la proliferación celular, donde dicho material se difunde a través de dicha perla sólida que contiene agarosa y está cubierta de agarosa, donde ese material tiene un peso molecular de al menos 30 kD, donde dichas células que proliferan rápidamente son seleccionadas de células cancerosas o células madre no humanas, y donde las células restringidas y células a suprimir se originan de diferentes especies.

2. La perla de la reivindicación 1 que comprende alginato-poli-(L-lisina); alginato-poli-(L-lisina)-alginato; alginato-poli-(L-lisina)-polietilenimina; quitosán-alginato; polimetacrilato de hidroxietilo-meracrilato de metilo; carbonilmetilcelulosa; K-carragenano; quitosán; agarosa-polietersulfona-hexadimetrina-bromuro (Polibreno); etilcelulosa; geles de sílice; y combinaciones de los mismos.

3. La perla según la reivindicación 1 o 2, donde dicha célula que prolifera rápidamente es seleccionada del grupo que consiste en una célula de cáncer renal, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de mama, una célula de coriocarcinoma, una célula neoplásica o una célula madre no humana.

4. La perla según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende de 120.000 a 240.000 células, o de 60.000 a 90.000 células.

5. Una composición producida por cultivo de células, restringidas en perlas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un medio de cultivo apropiado, por recuperación del medio resultante, y por formación de un concentrado del medio por separación de la fracción que tiene un peso molecular de al menos 30 kD, donde dichas células que proliferan rápidamente son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3.

6. La composición de la reivindicación 5, donde cada una de dichas perlas contiene de 10.000 a 500.000 células cancerosas, preferiblemente de 30.000 a 250.000 células cancerosas.

7. La composición de las reivindicaciones 5 o 6, donde dichas células cancerosas con células cancerosas humanas o células cancerosas de ratón.

8. Método para producir una perla que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende:

(a) suspender células que proliferan rápidamente en una solución de agarosa,

(b) formar una perla semi-sólida suave a partir de dichas células que proliferan rápidamente suspendidas de la etapa (a),

(c) incubar dicha perla semi-sólida de la etapa (b) mientras se forma una perla sólida.

(d) Cubrir dicha perla sólida de la etapa (c) con agarosa para obtener una perla que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente.

donde dichas células que proliferan rápidamente son definidas como en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3.

9. Método de la reivindicación 8, donde la etapa (a) comprende añadir una solución al 1% de agarosa de baja viscosidad a las células que proliferan rápidamente y/o la etapa (d) comprende hacer rodar dicha perla sólida de la etapa (c) en agarosa al 5%, y/o poner en contacto dicha perla sólida enrollada con aceite mineral, y/o lavar dicha perla enrollada para obtener dicha perla que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente, donde dichas células que proliferan rápidamente son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3.

10. Método de cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde dicha célula que prolifera rápidamente es seleccionada del grupo que consiste en una célula de cáncer renal, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de mama, una célula de coriocarcinoma, una célula neoplásica o una célula madre no humana.

11. Uso de una perla que contiene agarosa y está cubierta de agarosa que contiene células que proliferan rápidamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas en un individuo con necesidad del mismo, donde dichas células que proliferan rápidamente son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3.

12. Uso de una cantidad suficiente de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas en un individuo.

13. Uso según las reivindicaciones 11 o 12, donde dicho individuo es un ser humano.

14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde la enfermedad hiperproliferativa es cáncer.

15. El uso según la reivindicación 11 y 14, donde dichas células que proliferan rápidamente son células cancerosas.

16. Uso según la reivindicación 15, donde dichas células cancerosas son células humanas, células de ratón u otras células no humanas.

17. Uso según las reivindicaciones 15 o 16, donde dichas células son del mismo tipo que el cáncer del que el individuo está aquejado.

18. Uso según las reivindicaciones 15 o 16, donde dichas células son de un tipo diferente de cáncer del que el individuo está aquejado.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde dichas células son células tomadas del individuo al cual es administrada dicha composición.