JPS5933223A - 人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は人の悪性ｌｌ！瘍細胞増殖抑制剤に関づる。

この発明１．１人の悪性１１１！瘍細胞を培養し、その
培ｉ後倍地Ｊ：り前記悪性腫瘍細胞を除いて抽出したし
ので、人のｌＩ！瘍細胞に対し、増殖抑制や細胞致死効
果を特異的に有づものである。この悪性腫瘍細胞増殖抑
制物質は、低分子の物質であり、分子量１０００の分子
を篩い分（プる／ミコン社製のＹＭ　２　を、Ｕ　Ｍ　
Ｏ５／：にどのフィルターを透過可能であり、これらを
用いて抽出することができる。抽出して得られたこの物
質は、正常細胞に対しても多少の増殖抑制が認められる
が、悪性１ｌｆｆｌ瘍細胞に対でる増殖抑制力とは著し
い差異があり、正常細胞に対して致死効果がル２められ
ないことから、この発明により１！′Ｉられた悪性腫瘍
細胞増殖抑制剤は、在来の抗腫瘍剤のような副作用はほ
とんどないと考えられる。

また、人の悪性腫瘍細胞に人の正常細胞を混合培養して
もその培養侵倍地より抽出したも゛のが同様の効果が１
ηられる。そして、混合培ｇ！Ｒｍの（Ｒ地と新釘通常
倍地との比率を選べば、正常細胞は増殖し、悪性腫瘍細
胞の増殖は著しく低下させることができる。

次に、この発明の効果を確認するために実験方法につい
て述べる。

実　　　験　　１ １）実験材料とした細胞 人の悪性腫瘍より分離した多種類の培養樹立株細胞を使
用した。すなわら、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞ＨＲＣ
、ヒ１〜胃癌由来樹立株細胞Ｍ　Ｋ　。

ヒト肺癌由来樹立株細胞ＰＣ−１．ヒドロ腔底癌由来樹
立株細胞ＫＢ、およびヒト筋原竹肉腫由来樹１″Ｉ株細
胞１１Ｍ５の１５種類を使用した。

２）培　　養 成長用培地（こ（よ１０％〕１新生児血清を添加したｆ
３　ａｓａｌ　　Ｍ　ｅｄ’１ｌｊｌｌｌ　［：ａｇＩ
Ｑ　（１３Ｍ　、ＩＥ　）　Ｊ’ｊよび５％牛新生児血
清を添加した１１１）ｔｖｌ　１１６’Ｉ　Ｏを成長用
培地（ｇｒｏｗｔｈ　　１１１０（Ｉｉｌｌｍ）どして
用い、抽出用の借地どしては、自消無添加の１３ＭＦを
使用した。

まず成長用培地を用い、ＩＲ養器に飽和状態になるＪ：
で悪性腫瘍細胞を増殖し、ぞの後１回洗って血清を除く
。次に、これを抽出用借地にてそのまま３〜４Ｆ１間３
７℃にて培養するが、または通常の継代培養の如く、前
記増ＩＮＪ細胞のうちから既知の細胞数を新たに抽出用
借地に播き直して３〜／Ｉ日１ｊ１３７℃にて培養し、
その借地を採取する。

３）部分精製 採神した借地を１００００．１０００．５００の分子篩
にか（）、濾過液を採取する。

４）悪性腫瘍細胞増殖抑制剤の検定法 検定に使用した細胞は実験材料に用いた５種類の株細胞
、おＪ：び６３才の正常人男子前胸部皮膚より採取した
正常ヒト２倍体皮膚線鮪芽細胞Ｎ△Ｓ６３を用い、イの
増殖状況を成長曲線および濃度反応曲線に表わして調べ
た。

ａ、成長曲線 既知の細胞数を培養器に播き、瀘過湾みの抽出用借地に
［３Ｍ　Ｆ　ｔＢ地と同組織、同品のグルコース、アミ
ノ酸、ビタミンを加え、さらにＩｉ　負Ｙな前述の血清
を１０％添加したものを成長用培地として用い、杼口的
に細胞数を測定づるが、または一定期間培養した後、細
胞数を調べる。

ｂ、濃度反応曲線 培養後借地および新鮮借地を各種割合で混合し、成長曲
線と同様に各種栄養を加えて一定期間培養した後、細胞
数を調べる。

５）実験結果 第１図〜第５図は各種細胞の培養後借地における細胞増
殖の経口的変化を成長曲線に表わし！ζものである。い
づれの実験においても、実験Ｉ（Ｙは各種悪性腫瘍細胞
の培養後借地をアミコンＹＭ５（Ｍ、Ｗ、１０３　）で
限界濾過後、栄養源どしてグル］−ス、アミノ酸、ビタ
ミン、血清１０％を添加した借地を用い、ス・ｊ前群は
新鮮借地Ｂ　Ｍ　Ｅに実験Ｉｆｆど同様の栄養源を添加
した一ｂのを用いた。

細胞の初期１１ｉｉ！Ｉｆｆは１　ｘ　１０４　ｃｅｌ
ｌｓとし、第１図の実験では３５ｍｍの３７４養器を、
第２図−第５図の実験テＧＪ　１　！、’）　ｍｍａ′
）培養器を用いた。

第１図の実験はｕト腎細胞癌由来樹立株細胞トＩＲＣの
経口的変化を調べたしので、対照群の細胞は増加してい
るのに比べ、ヒ１〜腎細胞癌由来樹立株細胞＋−ｒ　Ｒ
Ｃ鳩首後培養地」：り抽出した物質を含む実験群は、増
殖が抑制されていることが明らかに示されている。

第２図Ａは正常ヒＩ−２（Ａ体皮膚線紺月細胞ＮΔ８６
３の経「１的変化を、第２図Ｂはヒト胃癌由来樹立株細
胞Ｍ　Ｋの経［１的変化を調べたもので、いずれも実験
群にはヒト胃癌由来樹立株細胞ＭＫのｊｒｚ養後倍地借
地抽出した物質を含む借地を用いて゛いる。これらの成
長曲線から、正常細胞に比ベヒｌ〜胃癌由来樹立株細胞
Ｍ　Ｋの実験群は、明確に成長閉止効果が表われている
。

第３図は、ヒＩ・肺癌由来樹立株細胞Ｐ　Ｃ−１の経口
的変化を調べたもので、ヒト胃癌由来樹立株細胞ＰＣ−
１の培養模借地Ｊ：り抽出した物質を含む実験群の細胞
は減少し、致死効果が認められる。

第４図は、ヒトＩ’Ｔｌｌ１！癌由来樹立株細胞１（［
３の経口的変化を調べたもので、ヒドロ腔癌由来樹立株
細胞Ｋ［３の培養後培地より抽出した物質を含む実験群
の細胞（よ、一時増加するが、やがて減少する。

第５図は、ヒト筋原性肉腫由来樹立株細胞１−ＩＭＳの
経口的変化を調べたもので、ヒ］へ筋原性肉腫白米樹立
株細胞１−Ｉ　Ｍ　Ｓの培養後借地より抽出した物質を
含む実験群の細胞は減少し、致死効果がルクめられる。

第６図、第７図は、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞１−Ｉ
　ＲＣの培養接借地と新鮮借地の各種混合比における温
度反応を調べたもので、第６図はヒト腎細胞癌由来樹立
株細胞ＨＲＣの濃度反応曲線を、第７図は正常ヒ１〜２
倍体皮膚線維芽細胞ＮＡＳ６３の濃度反応曲線をを表わ
している。いづれも培養後培養地を分子量１００の分子
を篩い分ける膜であるアミニー１ン？ｌ　’ＥＪ　Ｙ　
Ｍ　２ににり濾過した０のを使用し、自分比は１１′５
養後イ８地と新鮮１ｇ地との相に対して培養後＋ｒｓ地
の含Ｊ、れる割合を示しでいる。

これらの図より、培養後借地は正常細胞にも増殖抑制反
応を承りが悪ｔＩｔ　ｆｌｉｒｔ瘍の一例ひあるじｌ−
腎細１１包癌山来樹立株細胞Ｎ　Ｐ　Ｃに（よ増多め抑
制効果がより強くルγめられる。

表１は、限外濾過法にＪこる各分子間の分級（ｒ　ｒａ
ｃｔ　ｉｏｎ　）の細胞増殖の効果を比較したもので・
、正常ヒト２倍体皮膚線緒芽細胞Ｎ　Ａ　Ｓ　６３ど、
ヒト腎細胞癌由来樹ｆｔ林細胞１−Ｉ　ＲＣを用いてい
る。

表中■、■、■はグループの番号を示し、（す。

■の分子量（Ｍ、Ｗ、）１０３以下の分級に特異的にヒ
ト腎細胞癌由来樹＼”ｆ株細胞ＨＲＣに対して増殖抑制
おＪ：び致死効果を持つものが存在づる。

ただし、この分級は正常細胞へも影響を与えるが、形態
的観察では正常細胞に対重る致死ダＪ宋は認められない
。

実　　　験　　２ １）実験材料どじた細胞 ５３才、及び６３才の正常人の男子前胸部皮膚より採取
した正常ヒト２倍体皮膚線紐芽細胞、及びヒト−細胞癌
由来樹立株細胞Ｈｆｌ　Ｃを用いた。

２）培　　養 培地には、１０％生新生児血清を添加したＢａ５ａｌ　
　Ｍｅｄｉｕｍ　、　Ｅ　ａｇｌｅ’（ＢＭ　Ｅ　）を
用いた。

培養条件は、閉鎖系または５％ＣＯ２，１００％湿度の
大気中で行なう開放系を用い、３７℃で石養　し　ｌこ
　。

混合培養は、上記培地で、まず、人の線紺芽細胞を培養
する。培養器に細胞が一面ずき間なく生えた状態になっ
たとさ、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞ＨＲＣを１０７〜
２Ｘ１０７個接種する。なお、このとき用いる培養器は
、通称ＲＯＩＩＸ壜（ルーびん）といわれるものを使用
する。そして、混合培養時には前記ＲＯＵＸ壜から前記
１０％生新生児血清を排出し、新しく使用する培地は、
前述の１０％牛新生児血清添加、または血清無添加のＢ
Ｍ「を用い、’Ｉ　Ｉ＋　１１１３７°０にて培播後、
培地を採取づる。

３３）透析、濃縮 採取した培地をワイス１ングチコーブ（セ［］フン・ン
でできたチコーブで゛通常の透析に用いるもの）に容れ
、外側をポリ］“ブレン・グリー＝１−ルにてシ１゜ふ
し、水分を抽出して濃縮づる。ぞの後、１０ｍＭ１ｆ３
炭酸す１−リウム添加脱イオンにて透析を行なう。

４）癌細胞増殖抑制剤の検定法 検定に用いる癌細胞は、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞１
１　ＲＣ及び人の［］腔武略より樹立したヒ１〜［１武
略癌由来樹立株細胞ＫＢを用いた。採取したｊ？“１地
及び透析した培地をシを？−レ内の１０％血清添加新鮮
培地に添加したものを用い、ヒト−細胞癌由来樹立株細
胞１１　ＲＣ及びヒト−細胞癌由来樹立株細胞ＫＢの２
種の癌細胞及び正常と１・線紐芽細胞を培養し、その増
殖状況を調べた。

５）実験結果 ８１１８図は、１０９６新鮮面清添加通常Ｊ８地、２０
％新鮮血清添加通常培地、正常細胞１８養後に１０％血
清を添加した培地、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞培養後
の培地及び混合培養培地の各種条４！１の培地を使用し
、と］−腎細胞癌由来樹立株細胞］−１ＲＣを増殖した
時の日数に対づる細胞数を承り増殖曲線で、混合培養後
培地で培養したとぎのみ、癌細胞増殖抑制及び破壊が認
められる。

第９図は、第１図と同様な各種類の培地を使用し、正常
ヒト線紺力細胞を培養したごしので、混合培養後培地に
おいても日数暢対′する細胞数は増殖傾向を示Ｊ０ 第１０図は、混合培養を無血清培地で行ない、その培地
に１０％新鮮血清を添加したものと１０％血清添加通常
培地とＨＲＣ培養後の血清無添加培地とにヒト腎細胞癌
由来樹立株細胞１−Ｉ　ＲＣを培養したもので、この結
果より無血清培地にて混合培養を行なっても同様の効果
が得られることがわかった。したがって、この方法によ
れば、人の癌細胞増殖抑制剤の抽出が血清の存在に邪魔
されずにスムーズに行なうことが可能であることがわか
イ〉１゜ 第１１図は、混合拾九後ｉｒＸ地と１０％而消面加新鮮
通常ｊ（Ｚ地との和に対Ｍる課金Ｉ８養羨培地の各種の
百聞比率にＪ、る６７合をｔ−ｉ　＜ｔつだときの１で
１−１［１：ζＩ！！　ＴｐＩｔ材細胞、及びヒ］〜腎
細胞癌由来樹立株細胞＋１Ｒ（〕の増殖度を示したもの
て゛ある。正常細胞は一部比率では正常細胞培地より高
い増殖度を示し、拓−Ｉ細胞は対数的に増頬殴が低下り
る。

第１２図は、第４図と同じ培地まＩζはＩＩＲＣ培養後
ＩＦＳ地と１０％血精添加通常培地に対゛ＣＪる混合１
）゛１養後ｊ８地Ｊ、たはＩＩＲｃ培養後培養後口８地
Ｊる他の癌細胞ｒあるヒ１〜１１腔底癌山来樹立株細胞
Ｋ　ｌ’３の増多め度を示したちのＣ゛、混合培養後培
地のｈかでの混合比率が高くなる（よど抑制ｔａも高く
なる。したが−）で混合培養後培地は、癌細胞増殖抑制
に奇！ｊ【ッており、この抑制（Ｊｌ物質によって惹起
されることを表わしＣいる。

第１３図は、無血清ｌｉｔ　’Ｉｈ　１１５地にて、混
合培養を１１／Ｔっだ培養後培地を透析」）たものと１
０％血精添加通常培地と、１１１＜　Ｃ：培養部培地と
、１０％血精添加通富］８地どの混合割合に対Ｍる５１
−１間の１１ＲＣの細胞数の変化を調べたものＣ，混合
Ｉ８養後１８地抽出物を添加した３１１地に著明な細胞
増り１１抑制効宋が認められた。

なお、人の線紺’！Ｊ　１１１胞や癌細胞−よ様々なし
のがあり、一種類に限らず、同様の効果が認められる。

しかし、正常細胞ど癌細胞の混合比率にＪ、す、ｈ価の
変化がル２められ、上記実験から、正常細胞７００〜１
０００万に対し、癌細胞１０００万〜２０００万を接種
するのが好ましいと考えられる。

参考のため、第１４図、第１５図を添イ・１覆る。

第１４図は、１０％１（１１清添加通常培地と混合培養
培地どの和に対り−る混合培養培地の割合を横軸にとり
、混合培養の癌細胞１−（ＲＣと同種の癌細胞１−Ｉ　
ＲＣの接種数をそれぞれ変化さｌｏた場合の５日間の癌
細胞数を縦軸に示したものであって、癌細胞接種数が人
さいけど、また、混合培養培地の割合が高いほど癌細胞
数が少なくなっている。

第１５図は、１０％血清通常培地と混合１Ｅｔ　Ｍ培地
との和に対する混合培養培地の割合を横軸にとつ、混合
培養の癌細胞１１１≧Ｃと異なった癌細胞１（１３の接
種数をそれそ′れ変化させた場合の５［］間の癌細胞数
を＃１軸にり１ζしたしのであって、癌細胞がｊ、Ｉ／
なるものであっても、第１４図に示４傾向が児られるこ
とを示している１、 まｌこ培地の種類は、１３ＭＥに限らず、他のＩｎ　Ｉ
ｌ’Ｊを用いてもよい。而−油添加−し１０％に限らず
他の濃度、または無血清でもよく、生新１児血清の他、
成牛の自消、仔１１−９生胎児、または他の動物のもの
を使用することもできる。さらに、１８拵は静置［ｆ１
養やその他浮３カ培養系を用いてもＪ：り、培養器ｔ）
様々あるので、適宜選択することは自由である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各培地にお１′ｌＪるヒ］〜腎細胞癌由来樹
立株細胞ＨＲＣの増殖を示Ｊ図、第２図（Ａは、各培地
にお（〕る正常ヒト２倍体皮膚線紐芽細胞ＮＡＳ６３の
増殖を示１図、第２図Ｂは、各培地にお（）るヒト肺癌
由来樹立株細胞ＭＫの増殖を示す図、第３図は、各１８
地におＩ′Ｊるヒト肺癌由来樹立株細胞Ｐ　Ｃ−’Ｉの
増９１＋を承り図、第４図は、各培地に８４Ｊるヒ１−
１］腔癌山来樹立株細胞）＜１３の増殖を承り図、第５
図は、各培地におけるヒト筋原Ｐ１肉腫由来樹立株細胞
ＩＩ　Ｍ　Ｓの増殖を示−４図、第６図は、ヒト腎細胞
由来樹立株細胞１−Ｉ　ＲＣの培養後培地と新鮮培地の
各秤況合比にお１するヒト腎細胞由来樹立株細胞１−Ｉ
　ＲＣの濃度反応を示す図、第７図は、第６図と同様の
各培地にお（）る正常ヒ１へ２倍体皮Ｉａ線帷芽細胞Ｎ
ＡＳ６３の濃度反応を示づ図、第ε３図は、各培地にお
ける癌細胞の増殖を示づｍｍ、第９図は、各培地におけ
る正常細胞の増殖を示す図、第１０図は、無血清培地に
お【ノる癌細胞の増殖を示す図、第１１図は、混合培養
後培地ど新鮮通常培地との各種混合比率の培地にお（プ
る正常細胞及び癌細胞の増殖を示す図、第１２図は、混
合培養培地と新鮮通常培地との各秒混合比率の培地にお
ける他の補数の癌細胞の増殖を示す図、第１３図は、無
血清培地にて混合培養後の培地の透析物を添加した培地
の癌細胞の増殖を示づ図、第１４図は、各培地にお【プ
る癌細胞接種数毎の増殖を示す図、第１５図は、各培地
におけるＫ　Ｂ細胞のＩｆＱ　９１１を小η図（ある。 表１は、各分子州分級の細胞増殖のりｊ宋を比較したも
のである。 出Ｍ１人代理人　　弁即−１竹　本　松　用表１ 第　　　１　　　図 日数−一− 第　　２　　　吃ＩＡ 第　　　３　　図 第　　４　　図 日数−一− 第　　５　　図 ”　　ＢＥｌｔ− 第　　６　　図 土＠堆４も＠−１：ヒ １−　　　　　　）、ｉ　　　　　　？山　　　　　１
１’、　　　　　　ＪＪ昭和５７（１１１月２９［１ Ｑｊｆ　Ｎ庁１（宕　若　（６和　大　殿′１．・旧′
１の表出 昭和５）７　（Ｉ　　’ｌ’ｌ　　Ｒ′Ｉ’　　１９ｆ
＋　　第　１４　：”ｌ　３／Ｉ　Ｏシー〕２、ブを明
の？１称 人の悪１＋１腫ｉｂ　ｓ＋＋＋胞増ｌめ抑制剤ＳＬ　　
？＋ｌｉ＋Ｉ　　を　’Ｊ　　Ｋ１名′１汀１どの関係
　　　　　Ｑ：ＩＡ’ｌ　　出りイ１人１１所　　中５
：ミ都−Ｉ゛代１１１区四番町７番地名称　興！、Ｊ１
株式会芥ｌ （ばか　：１名） 、・１１代理人〒１０！ｉ ｔｌ所　中東部港ＩＲＩｆ＋ワ閂１１１１１ａ口１号虎
−ビル（１階氏名　（８２３（１）　　弁理ト１′１　
　　本　　松　　司（）電話　５０２−２５７８　”　
’　”’巳）、ｉ＋Ｉｉ＋Ｉ−命令の［ｌ　ｆ＝＋　　
　　　な　し４（白光浦１］）（５、＞＋ｌｉ　ｉＴに
より増１１１１　ＬＪる弁明の数　　　／Ｃ１）７、補
１［のス・凶　　　明細ＪＪの性情１．＾求σ）範囲の
欄イ）−らび（こ発明のｊｉＹ細／ｉＩ＋（２明の欄。 ８、補正の内容 （１）明細用の’ｌ’ｌ　ｉ＋Ｔ　ｉ＾求の範囲を別紙
のと、Ｉ３り補ｉｔ：　！Ｊる。 （２）同上第６頁第１２行、第２頁第７行、第８１１゜
第９行、第３頁第６行、第６〜７行、第８（ｊ。 第１０行、第１３行、第１／１行、第１６行、第４頁第
６行（２ケ所）、第８〜９行、第１２１１（２ケ所）、
第１６行、第１９行、第５頁第２行（２ケ所）、第１７
行く２ケ所）、第６頁第３行。 第７行、第１１行、第１５行（２ケ所）、第７頁第２行
（２ケ所）、第３行、第４行の［Ｑ：５地ｊを「培地」
ど補正する。 （３）同上第６頁第１９行「をを」を「を１に補正づる
。 ２、特許請求の範囲 人の悪性口Φ；９細胞のｊＦＳ養後１１Ｊ：り前配悪１
）１肘１Ｊｊｌ［を除い−Ｃ抽出しＩＪｔ〕のからなる
ことを特徴と１ノる人の＋Ｕ：　（ＩＩ　ｌ！ｌｉ瘍細
胞増殖抑制剤。 ’ｆ　　　　＋；ｃ　　　　？ｌｈ　　　　ｉｌ−μＪ
　（方］（）昭和５フイ１１２１１３１１ ’４１ｆＦ庁長官　名　（ニ　■１　　大　殿１、事ｐ
＋の表示 昭和５７　’ｔ　　Ｂ＋　　ａ’ｌ　　願　第　１　／
Ｉ　３３／Ｉ　Ｏ舅２、発明の名称 人の悪１！Ｌ　ＩＩ・Ｆ瘍細胞増殖抑制剤３、補正をす
る者 事イ′１どの関係　　　　　特　８′１　出願人住所　
　東帛都千代１１区四番町７番地名称　　興　萌　株　
式　会　礼　　　（（３Ｉか　３名）４、代理人〒１０
５ 住所　東卓都港［ス虎）門ＩＴ［１１番１１シコ１）Ｃ
じル（’＋　ｌｉｊ’Ｈ氏名　　（８２３０）　　　弁
理−ト　　　竹　　　本　　　松　　　６１　　・′、
パ入 電話　！＋０２−２５７８　　””−”５、補正命令の
日イー１ 昭和５７年１１月１２日（昭和５７年１１月３０１］弁
送）。 ６、補正により増加づる発明の数　　　な　し７、補ｉ
Ｅの対象　　明細ｉ１１の発明の詳細な説明の欄、図面
の簡単な説明の欄並びに図面中の表１゜ １”Ｊ、’１山１１−の内”Ｆｌ （１）明Ｉｌｌ　＋ｌ　’ｄ”ｒ　７　ｆ＋　：：（！
　１８行と第Ｅ３自第１　！’ｉとの間（：次の人を１
Ｉ人りる。。 表　　　１ （２）同１　’ｄ！　１５）−（４第１１”ｊ・−第２
ｔ−７１人１（，１、・・・・・・・・・Ｌ）の（゛あ
る。１を削除・する、。 （３）図面中表１を削除覆る、。 １６０

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 人の悪性腫瘍細胞の培養後倍地にり前記悪ｆｌｕ　Ｉｌ
   ＋ＴＩ瘍を除いて抽出したものからなることを特徴と１
   ６人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤、。