JPS601877B2 - 高分子多糖類物質ｍｐｓ−８０及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０及びそ
の製造法に関するものである。

更に詳細には、本発明は、高粘性で、抗腫場作用を有す
る高分子多糖類物質Ｍ門‐８０及びその製造法に関する
ものである。

本発明の高分子多糖類物質Ｍ鴎−８０はラクトバチルス
属及びストレプトコッカス属に属する高分子多糖類物質
Ｍ博一８０生産菌を培養することによって製造すること
ができる。

高分子多糖類物質ＭＰＳ−８比生産菌の具体例としては
、徴工研に寄託された菌として、ラクトバチルス・ュー
グルテイＮｏ．８５１、ＦＥＲＭＢＰ一６６（ＦＥＲＭ
一ＰＮｏ．５８５１）〔仏ｃｔｏｂａｃｈｌｕｓ 瓜処
ｎｉ Ｎｏ．８５１、ＦＥＲＭＢＰ−６６（ＦＥＲＭ−
Ｐ Ｎｏ．５８５１）〕及びストレプトコツカス・サー
モフイラスＮｏ．１２７、ＦＥＲＭ ＢＰ−６５（ＦＥ
ＲＭ−Ｐ Ｎｏ．５８５０）〔Ｓ０８ｐｔｏｃｏｃｃ
聡〜 ｔｈｅｒｍｏｐｈ肌ｓ Ｎｏ．１２７、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６５（ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ．５８５０）〕が示さ
れ、有効に使用される。本発明は、高分子多糖類物質Ｍ
ＰＳ−８０に関し、そして高分子多糖類物質ＭＰＳ−８
０を製造する方法に関するものである。

高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０は、高分子多糖類物質Ｍ
ＰＳ−８逆生産菌を培養した後、培養物の液体区分およ
び菌体区分から分離採取することによって得ることがで
きる。

培養培地としては、いかなる組成の培地でもよいが、脱
脂乳、ホェー等を含有する乳酸菌培養培地が好ましい。

培地条件としては、例えば、２０００〜４５ｑｏの静暦
培養で十分であり、また、高分子多健類物質ＭＰＳ−８
０生産菌の生育が可能で高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０
を産生する条件であればいかなる条件でもよい。高分子
多糖類物質Ｍ＄−８０生産菌の培養物から遠心分離によ
り液体区分および菌体区分を得、次いで、これらから抗
腫場作用を有する高分子多糖類物質ＭＰＳ一８０を採取
する。

液体区分から高分子多糖類物質ＭＰＳ一８０を採取する
には常法によればよく、例として、ゲル炉過、イオン交
換クロマトグラフィー、塩析、溶媒分画、透析などの操
作を単独あるいは適宜併用すればよい。菌体区分から高
分子多糖類物質ＭＰＳ一８０を採取するには、菌体区分
から例えば水抽出を行ない、その後は液体区分からの採
取法に準ずればよい。本発明方法において、一般的には
、ホロー培地で高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０生産菌を
培養し、培養終了後、遠心分離にて培養上燈液を得る。

次いで、この培養上燈液に有機溶媒を添加し、沈澱物を
得る。一方、遠心分離にて得られた菌体区分につき水抽
出を行ない、次いで、遠心分離を行ない抽出上燈液を得
る。

この上燈液に有機溶媒を添加し、沈澱物を得る。

このようにして得られた両沈澱物を水に溶解した後、同
様に有機溶媒を添加し、再沈澱させる。

この沈澱物質を適当な緩衝液に溶解した後、同種の緩衝
液で十分緩衝化したイオン交換体に負荷する。次いで、
同種の緩衝液を流し、イオン交換体に吸着されない高分
子多糖類物質を含む通過液を回収し、イオン交換水に対
して透析する。透析内液を凍結乾燥し、精製高分子多糖
類物質ＭＰＳ−８０を得る。ここに得られた高分子多糖
類物質ＭＰＳ−８０は優れた抗腫嬢作用を有し、抗腫場
剤として有用であり、かつまた、高粘性であるために、
増粘剤として有用である。

本発明の高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０の理化学的性質
を次に示す。

‘１｝ 元素分析 Ｃ：４２．２％ Ｈ：６．９％ ０：５０．４％ ■ 分子量 （ｉ’限外涙過法による場合。

Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ班による限外炉週を行なった結果を
第１図に示した。

力ラムサイズ２．５×４０．５弧；フラクシヨン５夕；
試料２．５の９（１の‘）を負荷：展開剤０．０８けり
ん酸緩衝液（ｐＨ６．０）；の条件により、本物質はほ
ぼＶｏ紅Ｖｏｌｕｍｅ付近に分固される。

（ｉｉ） 超遠心法による場合。

０．２けりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）に０．１％濃度で
溶解した試料について超遠′Ｄ法（言設定回転数５１２
０皿ＰＭ）により沈降定数を求めたところ７．９＄（Ｓ
：Ｓｖｅｄ戊ｒｇ単位）であった。

（沈降は単一状態を示した。）【３ー 融点（分解点） 本物質は２６２℃付近で変色が始まり、２６３〜２６△
０で黒変する。

‘４ー 比旋光度 〔Ｑ〕背＝十３３‐２（Ｃ＝○‐５％） ■ 紫外部吸収スペクトル 第２図に示す通りである。

■ 赤外部吸収スペクトル 第３図に示す通りである。

（７｝ 溶剤に対する溶解性 水に可溶、メタノール、エタノール、アセトン・エーテ
ルに不溶。

｛８） 呈色反応 （ｉ）モーリッシュ反応 ＋ （ｉｉ） アンスロン反応 ＋皿 システ
イン−硫酸反応 ＋Ｇの アニリン−塩酸反応 Ｍ カルバゾール−硫酸反応 Ｍ ェルソンーモルガン反応 Ｖｉｌ ビュレット反応 ‘９’塩基性、酸性、中性の別 本物質の０．１％〜０．５％水溶液のｐＨは中性である
。

ＯＱ 物質の色 本物質の凍結乾燥物は白色繊維状である。

００ 構成糖の種類 ５％ＳＥ−５２（２のカラム）を使用し、ＧＬＣによる
構成糖の種類を調べた。

条件：昇温１５０ｑｏ〜２３０ｏｏ（３００／ｍｍ）試
料を州一日交０４で沸とう水中４時間加水分解し、炭酸
バリウムで中和後炉遇した。

炉液についてアンバーライトＩＲＡ−４１０およびアン
バーライトＩＲ−１２０Ｒで脱塩後濃縮乾固し、ＴＭＳ
化してＧＬＣにかけた。その結果、本物質の構成糖とし
てグルコース、ガラクトースが認められた。０２ 構成
糖の組成比 試料を州一馬Ｓ０４で務とう水中４時間加水分解し、炭
酸バリウムで中和後炉過し、その炉液について酵素法に
より構成糖の組成比を調べた。

その結果グルコース：ガラクトース＝２．２〜１．９：
１であった。０３ ＣＩ３一ＮＭＲスペクトル（Ｄ２０
中、ＴＭＳ基準）（ｐｐｍ）第４図に結果を示した。

仙 酵素による分解性 ０．０９Ｍ酢酸緩衝液に溶解した本物質について各種酵
素を作用させた。

酵素による分解性はソモギー・ネルソン法による還元糖
量の増加で判定した。使用した酵素と反応条件。

ａ Ｑ−Ａｍｙｌａｓｅ（ベーリンガー社）ｐＨ５．９
３７０、４時間ｂ ８−Ａｍｙｌａｓｅ（ベーリンガー
社）ｐＨ４．８３０００、４時間ｃ ３一Ｇａｌａｃｂ
ｓｉｄａｓｅ（ベーリンガー社）ｐＨ４．＆ ３０ｏ○
、４時間ｄ Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓ℃ａｓｅ（ベーリ
ンガー社）ｐＨ４．８、３０００、４時間ｅ Ｑ−Ｇ
ａｌａｃのｓｉｄａｓｅ（ベーリンガー社）ｐＨ４．８
３０ｑ○、４時間上記条件下ではａ〜ｅすべてにおい
て、還元糖量の増加は全く認められなかった。

０３ ＬＤ５０ ｄｄＹ５ｗ千マウス（平均体重２１．３夕、１群７匹）
を用い、生理食塩水に溶解した試料を各種投与量で腹腔
内に１回投与してｌｏＢ間観察しＬＤ５ｏを求めた。

その結果ＬＤ５。は２００の９／ｋ９体重以上であった
。次に本発明の実施例及び試験例を示す。実施例 １ ホェー培地（１０％ｗ／ｖホェー粉十０．５％ｗ／ｖビ
ール酵母エキス）１０夕にいｃｔｏｂａｃ可ｌｕｓＪｕ
則ｎｉＮｏ．８５１、ＦＥＲＭ ＢＰ−６５（ＦＥＲＭ
−ＰＮｏ．５８５１）を接種し、３７００で２４時間静
道培養し、培養終了後、遠心分離（１０００仇ｐｍ、１
５ｍｉｎ）にて培養上燈液９．２そを得る。

この上燈液に９９．５％エチルアルコールを最終濃度と
して３５％（ｖ／ｖ）となるように添加する。本操作に
より沈澱物質が認められるようになり、この沈澱物質を
遠心分離（１０００仇ｐｍ、靴ｈ）し、沈澱物質１．２
夕を得る。この沈澱物質にイオン交換水を加え溶解後、
不溶性物質を遠心分離（１０００仇ｐｍ、１５ｍｉｎ）
にて除去する。本操作を計３回繰り返すことにより８０
０の９の粗精製物が得られる。ここに得られた粗精製物
を０．０９ Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、
同緩衝液で十分に緩衝化したジエチルアミノエチルセル
ロース（ＤＥＡＥ〜セルロース）を充填したカラムに負
荷する。

同緩衝液を流し、ＤＥＡＥ−セルロースに非吸着性物質
を含む通過液を採取する。非吸着性物質を含む溶液を凍
結乾燥した後、イオン交換水に溶解し、イオン交換水に
対して１ｏｏ０で４日間、透析チューブにて透析を行な
う。透析終了後、透析内液を凍結乾燥し、高分子多糖類
物質ＭＰＳ−８０の凍結乾燥標品５００の９を得る。実
施例 ２ １０％ｗ′ｖのホェー粉溶液１０れこビール酵母エキス
を０．５％ｗ′ｖ添加して培地とした。

− の 培 地 に Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃ瓜ｔｈｅ皿。

ｐｈｉｌ低Ｎｏ．Ｉ２７・ＦＥＲＭＢＰ−６５（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ Ｎｏ．５８５０）を接種し、３７℃で２０時間
静置培養する。培養終了後、遠心分離（１０００仇ｐｍ
、１５ｍｉｎ）にて培養上燈液を９〆得る。この上燈液
に９９．５％エチルアルコールを最終濃度として５０％
（ｖ／ｖ）となるように添加する。遠心分離（１０００
仇ｐｍ、５ｈｈ）により生じた沈澱物質１．７夕を得る
。この沈澱物質にイオン交換水を加えて溶解し、遠心分
離（１０００仇ｐｍ、１５ｍｍ）にて不溶性物質を除去
する。

本操作を３回繰り返すことにより１．２夕の粗精製物が
得られる。

ここに得られた粗精製物を０．０９けりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）に熔解し、同緩衝液で十分に緩衝化したジエ
チルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥセルロース）を
充填したカラムに負荷する。

同緩衝液を流し、ＤＥＡＥ−セルロースに非吸着性物質
を含む通過液を採取する。

非吸着性物質を含む溶液を凍結乾燥した後、イオン交換
水に溶解し、イオン交換水に対して１ｏｏ０で４日間透
析チューブにて透析を行なう。透析終了後、透析内液を
凍結乾燥し、高分子多糖類物質Ｍ円Ｓ−８の東結乾燥品
８００の９を得る。ここに得られた標品は、セファロー
ス餌によるカラムクロマトグラフイーの結果および超遠
心分析の結果、いずれも単一物質であることが明らかに
なり、標品を水に解した場合には無色透明を呈した。

試験例 １ Ｅｈｒ比ｈ腹水癌に対する効果 ｄｄＹ系８週令の雌性マウスを用い、１群７匹とし、予
め１週間ｄｄＹ系マウスに継代増殖させたＥｈｒ比ｈ腹
水癌細月包を１×１び個腹腔内に移植し、翌日より連続
９日間、対照群には生理食塩水を、試験群には生理食塩
水に溶解した、実施例１で得た高分子多糖類物質ＭＰＳ
−８０を腹腔内投与した。

投与量は１５の９／ｋ９′ｄａｙおよび６０の夕／ｋ９
／舷ｙの２段階とした。高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０
のＥｈｍｃｈ腹水癌に対する効果は、対照群に対して試
験群でどの程度延命したかで判定した。

結果を第１表に示した。

第１表 第１表の結果から、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０はＥ
ｈｒｌｉｃｈ腹水癌に対して強い抗癌性を示すことが分
る。

試験例 ２ Ｅｈｒ比ｈ腹水癌に対する効果 ｄｄＹ系８週令の雌性マウスを用い、１群７匹とし、予
め１週間ｄｄＹ系マウスに継代増殖させたＥｈｒ比ｈ腹
水癌細胞を１×１び個腹腔内に移殖し、移安直日を含め
連続３日間、対照群には生理食塩水を、試験群には生理
食塩水に溶解した、実施例２で得た高分子多糖類物質Ｍ
ＰＳ−８０を腹腔内投与した。

投与量は１２．５の９／ｋ９′ｄａｙ、２５．０の９′
ｋ９／舷ｙ、および５０の９ノＸ９′ｄａｙの３段階と
した。結果を第２表に示した。第２表 第２表の結果から、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０は、
延命率では顕著な効果は認められないが６０日生存マウ
スの匹数において有効性が認められる。

試験例 ３ Ｅｈｒ比ｈ固型癌に対する効果 ｄｄＹ系８週令の雌性マウスを用い、１群８匹とし、予
め１週間ｄｄＹ系マウスに継代増殖させたＥｈｒ比ｈ腹
水建細胞を１×１ぴ個皮下移殖し、翌日より連続８日間
、対照群には生理食塩水を、試験群には生理食塩水に溶
解した、実施例１で得た高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０
を腹腔内投与した。

投与量は１２．５の９／ｋ９′礎ｙおよび２５．０の９
／ｋ９／ｄａｙの２段階とした。高分子多糖類物質のＥ
ｈｒｌｉｃｈ固型癌に対する効果は、試験群において、
Ｅｈｒｌにｈ固型癌が消失した動物が何匹認められるか
により判定した。

結果を第３表に示した。第３表 第３表の結果から、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０は、
Ｅｈｒ比ｈ団型癌に対して顕著な効果が認められる。

試験例 ４ Ｓａｒｃｏｍａ１８０腹水腫湯に対する効果ｄｄＹ系８
週令雌性マウスを用い、１群５匹とし、予め１週間ｄｄ
Ｙ系マウスに継代増殖させたＳａｒｃｏｍａ１８０腹水
腫湯細胞を１×１び個腹腔内に移植し、翌日より連続９
日間、対照群には生理食塩水を、試験群には生理食塩水
に溶解した、実施例１で得た高分子多糖類物質Ｍ円Ｓ−
８０を腹腔内投与した。

投与量は１２．５の９／ｋ９／泌ｙ、２５．０の９／【
９′舷ｙ、５０の９／ｋ９／ｄａｙの３段階とした。高
分子多糖類物質ＭＰＳ−８０のＳａｒｃｏｍａ１８０腹
水腰場に対する効果は、対照群に対して試験群でどの程
度延命したかで判定した。結果を第４表に示した。

第４表 第４表の結果から、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０はＳ
ａｒｃｏｍａ１８０腹水腫場に対して強い抗腫傷性を示
すのが分る。

試験例 ５ リンホサイテイツク・リュケミアＰ−３８期庫湯に対す
る効果ＣＤＦ，、６週令の雄性マウスを用い、１群８匹
とし、予め１週間ＤＢＡマウスに継代増殖させたＰ−３
８母細胞を５×１ぴ個腹腔内に移植し、マィトマィシン
Ｃと実施例１で得た高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０との
併用実験を行なった。

対照群には移植翌日より生理食塩水のみを連続１０日間
、マィトマイシンＣ単独投与群には移植翌日にマイトマ
イシンＣ（１池／ｋ９）を１回のみ、マィトマィシンＣ
と高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０との併用実験群には、
移植翌日にマィトマィシンＣ（１雌′ｋｇ）を１回、移
植後２日目から高分子多榛類物質Ｍ俺−８０を連続９日
間、それぞれ腹腔内に投与した。

高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０の投与量は１２．５の９
／ｋ９／船ｙ、２５．肋夕／ｋ９／ｄａｙ、５０．０雌
′ｋ９／ｄａｙ、７７．５の９／ｋ９／船ｙの４段階と
した。高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０の併用効果は、延
命率および７０日生存マウス匹数によって判定した。結
果を第５表に示した。

第５表 第５表の結果から、高分子多糖類物質Ｍ門−８０をマィ
トマイシンＣと併用することにより延命率および７０日
生存マウス数を見ると併用効果が認められる。

【図面の簡単な説明】

第１図は高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０の限外炉過によ
る展開図である。 ａ・・・・・・高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０、ｂ・・
・・・・ＢｌｕｅＤｅ九ｒａｎ。 第２図は高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０の紫外部吸収ス
ペクトルを、第３図は同じく赤外部吸収スペクトルを、
第４図は同じくＣＩ３−ＮＭＲスペクトルを示す図であ
る。 第１図 第２図 図 の 鯨 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有する高分子多糖類物質ＭＰＳ
   −８０。 （１）元素分析 Ｃ：４２．２％ Ｈ：６．９％ Ｏ：５０．４％ （２）分子量 （i）限外濾過法による場合。 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ２Ｂによる限外濾過を行なつた結果
   を第１図に示した。 カラムサイズ２．５×４０．５ｃｍ；フラクシヨン５ｇ
   ；試料２．５ｍｇ（１ｍｌ）を負荷；展開剤０．０５Ｍ
   りん酸緩衝液（ｐＨ６．０）；の条件により、本物質は
   ほぼＶｏｉｄ Ｖｏｌｕｍｅ付近に分画される。 （ii）超遠心法による場合。 ０．２Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）に０．１％濃度で
   溶解した試料について超遠心法（設定回転数５１２００
   ＲＰＭ）により沈降定数を求めたところ７．９８Ｓ（Ｓ
   ：Ｓｖｅｄｂｅｒｇ単位）であつた。 （沈降は単一状態を示した。）（３）融点（分解点） 本物質は２６２℃付近で変色が始まり、２６３〜２６４
   ℃で黒変する。 （４）比旋光度 〔α〕■＝＋３３．２（Ｃ＝０．５％） （５）紫外部吸収スペクトル 第２図に示す通りである。 （６）赤外部吸収スペクトル 第３図に示す通りである。 （７）溶剤に対する溶解性 水に可溶、メタノール、エタノール、アセトン、エーテ
   ルに不溶。 （８）呈色反応 （i）モーリツシユ反応＋ （ii）アンスロン反応＋ （iii）システイン−硫酸反応＋ （iv）アニリン−塩酸反応− （v）カルバゾール−硫酸反応− （vi）エルソン−モルガン反応− （vii）ビユレツト反応− （９）塩基性、酸性、中性の別 本物質の０．１％〜０．５％水溶液のｐＨは中性である
   。 （１０）物質の色 本物質の凍結乾燥物は白色繊維状である。 （１１）構成糖の種類 ５％ＳＥ−５２（２ｍカラム）を使用し、ＧＬＣによる
   構成糖の種類を調べた。 条件：昇温１５０℃〜２３０℃（３℃／ｍｉｎ）試料を
   ２Ｎ−Ｈ＿２ＳＯ＿４で沸とう水中４時間加水分解し、
   炭酸バリウムで中和後濾過した。 濾液についてアンバーライトＩＲＡ−４１０およびアン
   バーライトＩＲ−１２０Ｂで脱塩後濃縮乾固し、ＴＭＳ
   化してＧＬＣにかけた。その結果、本物質の構成糖とし
   てグルコース、ガラクトースが認められた。（１２）構
   成糖の組成比 試料を２Ｎ−Ｈ＿２ＳＯ＿４で沸とう水中４時間加水分
   解し、炭酸バリウムで中和後濾過し、その濾液について
   酵素法により構成糖の組成比を調べた。 その結果グルコース：ガラクトース＝２．２〜１．９：
   １であつた。（１３）Ｃ＾１＾３−ＮＭＲスペクトル（
   Ｄ＿２Ｏ中、ＴＭＳ基準）（ｐｐｍ）第４図に結果を示
   した。 （１４）酵素による分解性 ０．０５Ｍ酢酸緩衝液に溶解した本物質について各種酵
   素を作用させた。 酵素による分解性はソモギー・ネルソン法による還元糖
   量の増加で判定した。使用した酵素と反応条件 ａ α−Ａｍｙｌａｓｅ（ベーリンガー社）ｐＨ５．９
   、３７℃、時間ｂ β−Ａｍｙｌａｓｅ（ベーリンガー
   社）ｐＨ４．８、３０℃、４時間ｃ β−Ｇａｌａｃｔ
   ｏｓｉｄａｓｅ（ベーリンガー社）ｐＨ４．８、３０℃
   、４時間ｄ Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）（ベ
   ーリンガー社）ｐＨ４．８、３０℃、４時間ｅ α−Ｇ
   ａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ベーリンガー社）ｐＨ４．
   ８、３０℃、４時間上記条件下ではａ〜ｅすべてにおい
   て、還元糖量の増加は全く認められなかつた。 （１５）ＬＤ＿５＿０ ｄｄＹ５ｗ♀マウス（平均体重２１．３ｇ、１群７匹）
   を用い、生理食塩水に溶解した試料を各種投与量で腹腔
   内に１回投与して１０日間観察しＬＤ＿５＿０を求めた
   。 その結果ＬＤ＿５＿０は２００ｍｇ／ｋｇ体重以上であ
   つた。２ ラクトバチルス属又はストレプトコツカス属
   に属する高分子多糖類物質ＭＰＳ−８生産菌を培養し、
   培養物より高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０を採取するこ
   とを特徴とする高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０の製造法
   。