JPS601878B2

JPS601878B2 - 抗腫瘍剤

Info

Publication number: JPS601878B2
Application number: JP304081A
Authority: JP
Inventors: 文安土屋; 久七宮沢; 道雄神辺; 宗宏小田; 直之海老沢
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd
Current assignee: Meiji Dairies Corp
Priority date: 1981-01-14
Filing date: 1981-01-14
Publication date: 1985-01-17
Also published as: JPS57117504A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規な高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０を有効
成分としてする抗腫傷剤に関するものである。

本発明の有効成分である高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０
はラクトバチルス属及びストレプトコッカス属に属する
高分子多糖類物質ＭＰＳ−８山モ産菌を培養することに
よって製造することができる。

高分子多糖類物質Ｍ円Ｓ−８２生産菌の具体例としては
、徴工研に寄託された菌として、ラクトノゞチルス・ユ
ーグルテイＮｏ．８５１、ＦＥＲＭＢＰ−６６（ＦＥＲ
Ｍ−ＰＮｏ．５８５１）〔Ｌａｃｔｏ舷ｃｍ雌ｉｕ
籾ｎｉＮｏ．８５１、ＦＥＲＭＢＰ−６６（ＦＥＲＭ−
ＰＮｏ．５８５１）〕及びストレプトコッカス・サーモ
フイラスＮｏ．１２７、ＦＥＲＭＢＰ一６５（ＦＥＲＭ
−ＰＮｏ，５８５０）〔ＳｔｒｅｐｔｏＣｏＣＣ
ｕＳｔｈｅｎｎｏｐｈｊｌ聡Ｎｏ．１２７、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６５（ＦＥＲＭ−ＰＮｏ．５８５０）〕が示さ
れ、有効に使用される。本発明は、高分子多糖類物質Ｍ
世Ｓ−８０を有効成分として含有する抗腫場剤に関する
ものである。高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０は、高分子
多糖類物質ＭＰＳ−８山王産菌を培養した後、培養物の
液体区分および菌体区分から分離採取することによって
得ることができる。

培養培地としては、いかなる組成の培地でもよいか、脱
脂乳、ホェー等を含有する乳酸菌培養塔地が好ましい。

培養条件としては、例えば２０ｑ○〜４５ｏ０の静暦培
養で十分であり、また、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０
生産菌の生育が可能で高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０を
生産する条件であればいかなる条件でもよい。高分子多
糖類物質ＭＰＳ−８０生産菌の培養物から遠心分離によ
り液体区分および菌体区分を得、次いで、これらから抗
腫場作用を有する高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０を採取
する。

液体区分から高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０を採取する
には常法によればよく、例として、ゲル炉過、イオン交
換水クロマトグラフィー、塩祈、溶媒分画、透析などの
操作を単独あるいは適宜併用すればよい。菌体区分から
高分子多糖類物質ＭＰＳ一８０を採取するには、菌体区
分から、例えば水抽出を行ない、その後は液体区分から
の採取法に準ずればよい。一般的には、ホェー塔地で高
分子多綾類物質ＭＰＳ−８０生産菌を培養し、培養終了
後、遠心分離にて培養上燈液を得る。次いで、この培養
上燈液に有機溶媒を添加し、沈澱物を得る。

一方、遠心分離にて得られた菌体区分につき、水抽出を
行ない、次いで、遠心分離を行ない抽出上燈液を得る。

この上燈液に有機溶媒を添加し、沈澱物を得る。このよ
うにして得られた両沈澱物を水に溶解した後、同様に有
機溶媒を添加し、再沈澱させる。

この沈澱物質を適当な緩衝液に溶解した後、同種の緩衝
液で十分緩衝化したイオン交換体に負荷する。次いで、
同種の緩衝液を流し、イオン交換体に吸着されない高分
子多糖類物質を含む通過液を回収し、イオン交換水に対
して透析する。透析内液を凍結乾燥し、高分子多糖類物
質ＭＰＳ−８０を得る。ここに得られた高分子多糖類物
質ＭＰＳ−８０は優れた抗腫場作用を有し、本発明の抗
腫場剤の有効成分とされる。

次に、高分子多糖類物質ＭＰＳ一８０の理化学的性質を
示す。

‘１’元素分析Ｃ：４２．２％Ｈ：６．９％ ○：５０．４％ ‘２｝分子量（ｉ）限外炉過法による場合。

Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ波による限外炉過を行なった結果を
第１図に示した。

力ラムサイズ２．５×４０．５肌；１フラクシヨン５夕
；試料２．５の９（１私）を負荷：展開剤０．０８Ｍり
ん酸緩衝液（ｐＨ６．０）；の条件により、本物質はほ
ぼＶｏ幻Ｖｏｌｕｍｅ付近に分画される。

（ｉｉ）超遠心法による場合。

０．２けりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）に０．１％濃度で
溶解した試料について超遠心法（設定回転数５１２００
ＲＰＭ）により沈降定数を求めたところ７．災Ｓ（Ｓ：
Ｓｖｅｄにｒｇ単位）であった。

（沈降は単一状態を示した。）■ 融点（分解点）本物質は２６２℃付近で変色が始まり、２６３〜２鼠℃
で黒変する。

■ 比旋光度〔Ｑ〕蟹＝十３３‐２（Ｃ＝○‐５％）｛５１紫外部吸収スペクトル第２図に示す通りである。

【６１赤外部吸収スペクトル第３図に示す通りである。

（７１溶剤に対する溶解性水に可溶、メタノール、エタノール、アセトン・エーテ
ルに不溶。

‘８｝呈色反応（ｉ）モーリッシュ反応＋（ｉｉ）アンスロン反応＋側システ
ィンー硫酸反応十Ｍアニリンー塩酸反応Ｍカルバゾールー硫酸反応側ェルソンーモルガン反応〜ｉｉ）ビュレット反応 ■ 塩基性、酸性、中性の別本物質の０．１％〜０．５％水溶液のｐＨは中性である
。

【ＩＱ物質の色本物質の凍結乾燥物は白色繊維状である。

ＯＵ構成糖の種類５％ＳＥ−５２（２机カラム）を使用し、ＧＬＣによる
構成糖の種類を調べた。

条件：昇温１５０午○〜２３０ｑｏ（３℃／ｍｉｎ）試
料を洲−ＫＳ０４で沸とう水中４時間加水分解し、炭酸
バリウムで中和後、炉過した。

炉液についてアンバーライトＩＲＡ−４１０およびアン
バーライトＩＲ−１２船で脱塩後、濃縮乾園し、ＴＭＳ
化してＧＬＣにかけた。その結果、本物質の構成糖とし
てグルコース、ガラクトースが認められた。０２構成
糖の組成比試料を洲−ＱＳ０４で沸とう水中４時間加水分解し、炭
酸バリウムで中和後炉過し、その炉液について酵素法に
より構成糖の組成比を調べた。

その結果、グルコース：ガラクトース＝２．２〜１．９
：１であった。

０３）Ｃ４３１−ＮＭＲスペクトル（Ｄ２０中、ＴＭ
Ｓ基準）（ｐｐｍ）第４図に結果を示した。

風酵素による分解性０．０９Ｍ酢酸緩衝液に溶解した本物質について各種酵
素を作用させた。

酵素による分解性はソモギー・ネルソン法による還元糖
量の増加で判定した。使用した酵素と反応条件。

ａＱ−Ａｍｙｌａｓｅ（べ−リンガ一社）ｐＨ５．９
、３７０、４時間ｂ８−Ａｍｙｌａｓｅ（ベーリンガ
一社）ｐＨ４．＆３０００、４時間ｃ８一Ｇａｌａ
ｃのｓｉｄａｅｓ（ベーリンガー社）ｐＨ４．＆３０
ｏｏ、４時間ｄＡｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓ幻ａｓｅ（ベ
ーリンガー社）ｐＨ４．＆３０℃、４時間ｅＱ−Ｇａ
ｌａｃＰｓｉｄａｓｅ（ベーリンガー社）ｐＨ４．８、
３０００、４時間上記条件下ではａ〜ｅすべてにおいて
、還元糖量の増加は全く認められなかった。

０８ＬＤ５。

ｄｄＹ５ｗ予マウス（平均体重２１．３夕、１群７匹）
を用い、生理食塩水に溶解した試料を各種没与量で腹腔
内に１回投与して１０日間観察しＬＤ５ｏを求めた。

その結果、ＬＤ５ｏは２００の９／ｋ９体重以上であっ
た。高分子多糖類物質ｈ仲Ｓ−８０はすぐれた抗腫場作
用を有しており、単独又は他の抗腫傷剤と併用して、す
ぐれた抗腫場剤とすることができる。

次に本発明の製造例及び実施例を示す。

製造例１ホェー培地（１０％ｗノｖホェー粉＋０．５％ｗ′ｖビ
ール酵母エキス）１０〆にＬａｃ■ｂａｃＵＩ船ｊｕ
則ｎｉＮｏ．８５１、ＦＥＲＭＢＰ一６６（ＦＥＲＭ
一ＰＮＯ．５８５１）を接種し、３７Ｃ０で２岬時間静
置培養し、培養終了後、遠心分離（１０００仇ｐｍ、１
５ｍｉｎ）にて培養上燈液９．２〆を得る。

この上燈液に９９．５％エチルアルコールを最終濃度と
して３５％（ｖ／ｖ）となるように添加する。本操作に
より沈澱物質が認められるようになり、この沈澱物質を
遠心分離（１０００比ｐｍ、５ｍｉｎ）し、沈澱物質１
．２夕を得る。

この沈澱物質にイオン交換水を加え溶解後、不溶性物質
を遠０分離（ｌｏｏｏ仇ｐｍ、１跡ｉｎ）にて除去する
。

本操作を計３回繰り返すことにより８００の９の粗精製
物が得られる。ここに得られた粗精製物を０．０９Ｍり
ん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、同緩衝液で十分に
緩衝化したジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ
−セルロース）を充填したカラムに負荷する。

同緩衝液を流し、ＤＥＡＥ−セルロースに非吸着性物質
を含む通過液を採取する。

非吸着性物質を含む溶液を凍結乾燥した後、イオン交換
水に溶解し、イオン交換水に対して１０℃で４日間、透
析チューブにて透析を行なう。透析終了後、透析内液を
凍結乾燥し、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０の凍結乾燥
品５００の９を得る。製造例２１０％ｗ′ｖのホェー粉溶液１０そにビール酵母エキス
を０．５％ｗ／ｖ添加して堵地とした。

この培地にＳｔｒｅｐのｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐ
ｈ；ｌｕｓＮｏ．１２７、ＦＥＲＭＢＰ−６５（ＦＥ
ＲＭ−ＰＮｏ．５８５０）を接種し、３７０で２０時間
静贋培養する。

培養終了後、遠心分離（１０００仇ｐｍ、１５ｍｉｎ）
にて培養上燈液を９ク得る。

この上燈液に９９．５％エチルアルコールを最終濃度と
して５０％（ｖ／ｖ）となるように添加する。遠心分離
（１０００仇ｐｍ、５ｍｉｎ）により生じた沈澱物質１
．７夕を得る。この沈澱物質にイオン交換水を加えて溶
解し、遠心分離（１０００仇ｐｍ、１５ｍｈ）にて不溶
性物質を除去する。本操作を３回繰り返すことにより１
．２夕の粗精製物が得られる。

ここに得られた粗精製物を０．０９けりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）に溶解し、同緩衝液で十分に緩衝化したジヱ
チルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥーセルロース）
を充填したカラムに負荷する。

非吸着性物質を含む溶液を凍結乾燥した後、イオン交換
水に溶解し、イオン交換水に対して１ｏｏ０で４日間透
析チューブにて透析を行なう。透析終了後、透析内液を
凍結乾燥し、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８の東結乾燥品
８００の夕を得る。ここに得られた標品は、セファロー
ス波によるカラムクロマトグラフィーの結果および超遠
心分析の結果、いずれも単一物質であることが明らかに
なり、標品を水に溶解した場合には無色透明を呈した。

実施例１Ｅｈｒ比ｈ腹水爆に対する効果ｄｄＹ系８週令の雌性マウスを用い、１群７匹とし、予
め１週間ｄｄＹ系マウスに継代増殖させたＥｈｒｌにｈ
腹水癌細胞を１×１ぴ個腹腔内に移植し、翌日より連続
９日間、対照群には生理食塩水を、試験群には生理食塩
水に溶解した実施例１で得た、高分子多糖類物質Ｍ円Ｓ
−８０を腹腔内投与した。

投与量は１５の９′ｋｇ／ｄａｙおよび６０雌′ｋ９′
舷ｙの２段階とした。高分子多糖類物質ＭＰＳ一８０の
Ｅｈｍｃｈ腹水癌に対する効果は、対照群に対して試験
群でどの程度延命したかで判定した。

結果を第１表に示した。

第１表第１表の結果から、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０はＥ
ｈｒｌｉｃｈ腹水癌に対して強い抗癌性を示すことが分
る。

実施例２Ｅｈｒ比ｈ腹水癌に対する効果ｄｄＹ系８週令の雌性マウスを用い、１群７匹とし、予
め１週間ｄｄＹ系マウスに総代増殖させたＥｈｒ比ｈ腹
水癌細砲を１×１び個腹腔内に移植し、移植日を含め連
続３日間、対照群には生理食塩水を試験群には生理食塩
水に溶解した、実施例２で得た高分子多糖類物質ＭＰＳ
−８０を腹腔内投与した。

投与量は１２．５の９′ｋ９／ｄａｙ、２５．０雌／ｋ
９／ｄａｙ、および５０他′ｋ９／ｄａｙの３段階とし
た。結果を第２表に示した。第２表第２表の結果から、
高分子多糠類物質ＭＰＳ−８０は、延命率では顕著な効
果は認められないが６０日生存マウスの匹数において有
効性が認められる。

実施例３Ｅｈｒ比ｈ固型癌に対する効果ｄｄＹ系８週令の雌性マウスを用い、１群８匹とし、予
め１週間ｄｄＹ系マウスに継代増殖させたＥｈｒ比ｈ腹
水癌細砲を１×１ぴ個皮下移植し、翌日より連続８日間
、対照群には生理食塩水を、試験群には生理食塩水に溶
解した、実施例１で得た高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０
を腹腔内投与した。

投与量は１２．５の９／ｋ９／舷ｙおよび２５．０爪９
／ｋ９／船ｙの２段階とした。高分子多糖類物質のＥｈ
ｒｌｉｃｈ固型癌に対する効果は、試験群において、Ｅ
ｈｒ比ｈ固型癌が消失した動物が何匹認められるかによ
り判定した。

結果を第３表に示した。第３表第３表の結果から、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０は、
Ｅｈｒｌにｈ団型癌に対して顕著な効果が認められる。

実施例４Ｓａｒｃｏｍａ１８０腹水腫湯に対する効果
ｄｄＹ系８週令雌性マウスを用い、１群５匹とし、予め
１週間ｄｄＹ系マウスに総代増殖させたＳａｒｃｏｍａ
１８０腹水腫場細胞を１×１び個腹腔内に移植し、翌日
より連続９日間、対照群には生理食塩水を、試験群には
生理食塩水に溶解した、実施例１で得た高分子多糖類物
質Ｍ円Ｓ−８０を腹腔内投与した。

投与量は１２．５の９／ｋ９′協ｙ、２５．０雌／ｋ９
／舷ｙ、５０雌／Ｘ９／ｄａｙの３段階とした。高分子
多糖類物質Ｍ肉‐８０のＳａｒｃｏｍａ１８０腹水腫湯
に対する効果は、対照群に対して試験群でどの程度延命
したかで判定した。結果を第４表に示した。

第４表第４表の結果から、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０はＳ
ａｒｃｏｍａ１８０腹水腫湯に対して強い抗腫場性を示
すのが分る。

実施例５リンホサィティック・リュケミアＰ−３８期庫湯に対す
る効果ＣＤＦ，、６週令の雄性マウスを用い、１群８匹
とし、予め１週間ＤＢＡマウスに継代増殖させたＰ−３
８８細胞を５×１ぴ個腹腔内に移植し、マィトマィシン
Ｃと実施例１で得た高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０との
併用実験を行なった。

対照群には移植翌日より生理食塩水のみを連続１０日間
、マイトマィシンＣ単独投与群には移植翌日にマイトマ
イシンＣ（１奴９／ｋ９）を１回のみ、マィトマィシン
Ｃと高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０との併用実験群には
、移植翌日にマィトマィシンＣ（１柵／ｋ９）を１回、
移植後２日目から高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０を連続
９日間、それぞれ腹腔内に投与した。高分子多糖類物質
ＭＰＳ−８０の投与量は１２．５の９／ｋ９／舷ｙ、２
５．０の９／ｋｇ／ｄａｙ、５０．０肌９／ｋｇ′ｄａ
ｙ、および７７．５のｃ／Ｚ９′ｄａｙの４段階とした
。高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０の併用効果は、延命率
および７０日生存マウスの匹数によって判定した。

結果を第５表に示した。

第５表第５表の結果から、高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０をマ
ィトマィシンＣと併用することにより延命率および７０
日生存マウス数を見ると併用効果が認められる。

【図面の簡単な説明】

第１図は高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０の限外炉過によ
る展開図である。ａ・・・・・・高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０、ｂ・・
・・・・ＢｌｕｅＤｅ幻ｒａｎ。第２図は高分子多糖類物質ＭＰＳ−８０の紫外部吸収ス
ペクトルを、第３図は同じく赤外部吸収スペクトルを、
第４図は同じくＣＩ３−ＮＭＲスペクトルを示す図であ
る。第１図第２図図の船第４図

Claims

【特許請求の範囲】１次の理化学的性質を有する高分子多糖類物質ＭＰＳ
−８０を有効成分とする抗腫瘍剤。（１）元素分析Ｃ：４２．２％Ｈ：６．９％Ｏ：５０．４％（２）分子量（i）限外濾過法による場合。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ２Ｂによる限外濾過を行なつた結果
を第１図に示した。カラムサイズ２．２×４０．５ｃｍ；１フラクシヨン５
ｇ；試料２．５ｍｇ（１ｍｌ）を負荷；展開剤０．０５
Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）；の条件により、本物質
はほぼＶｏｉｄＶｏｌｕｍｅ付近に分画される。（ii）超遠心法による場合。０．２Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）に０．１％濃度で
溶解した試料について超遠心法（設定回転数５１２００
ＲＰＭ）により沈降定数を求めたところ７．９８（Ｓ：
Ｓｖｅｄｂｅｒｇ単位）であつた。（沈降は単一状態を示した。）（３）融点（分解点）本物質は２６２℃付近で変色が始まり、２６３〜２６４
℃で黒変する。（４）比旋光度〔α〕■＝＋３３．２（Ｃ＝０．５％）（５）紫外部吸収スペクトル第２図に示す通りである。（６）紫外部吸収スペクトル第３図に示す通りである。（７）溶剤に対する溶解性水に可溶、メタノール、エタノール、アセトン、エーテ
ルに不溶。（８）呈色反応（i）モーリツシユ反応＋（ii）アンスロン反応＋（iii）システイン−硫酸反応＋（iv）アニリン−塩酸反応− （v）カルバゾール−硫酸反応− （vi）エルソン−モルガン反応− （vii）ビユレツト反応− （９）塩基性、酸性、中性の別本物質の０．１％〜０．５％水溶液のｐＨは中性である
。（１０）物質の色本物質の凍結乾燥物は白色繊維状である。（１１）構成糖の種類５％ＳＥ−５２（２ｍカラム）を使用し、ＧＬＣによる
構成糖の種類を調べた。条件：昇温１５０℃〜２３０℃（３℃／ｍｉｎ）試料を
２Ｎ−Ｈ＿２ＳＯ＿４で沸とう水中４時間加水分解し、
炭素バリウムで中和後濾過した。濾液についてアンバーライトＩＲＡ−４１０およびアン
バーライトＩＲ−１２０Ｂで脱塩後、濃縮乾固し、ＴＭ
Ｓ化してＧＬＣにかけた。その結果、本物質の構成糖としてグルコース、ガラクト
ースが認められた。（１２）構成糖の組成比試料を２Ｎ−Ｈ＿２ＳＯ＿４で沸とう水中４時間加水分
解し、炭酸バリウムで中和後濾過し、その濾液についで
酵素法により構成糖の組成比を調べた。その結果、グルコース：ガラクトース＝２．２〜１．９
：１であつた。（１３）Ｃ＾１＾３−ＮＭＲスペクトル
（Ｄ＿２Ｏ中、ＴＭＳ基準）（ｐｐｍ）第４図に結果を
示した。（１４）酵素による分解性０．０５Ｍ酢酸緩衝液に溶解した本物質について、各種
酵素を作用させた。酵素による分解性はソモギー・ネルソン法による還元糖
量の増加で判定した。使用した酵素と反応条件。ａ α−Ａｍｙｌａｓｅ（ベーリンガー社）ｐＨ５．９
、３７℃、４時間ｂ β−Ａｍｙｌａｓｅ（ベーリンガ
ー社）ｐＨ４．８、３０℃、４時間ｃ β−Ｇａｌａｃ
ｔｏｓｉｄａｓｅ（ベーリンガー社）ｐＨ４．８、３０
℃、４時間ｄＡｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（ベ
ーリンガー社）ｐＨ４．８、３０℃、４時間ｅ α−Ｇ
ａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ベーリンガー社）ｐＨ４．
８、３０℃、４時間上記条件下ではａ〜ｅすべてにおい
て、還元糖量の増加は全く認められなかつた。（１５）ＬＤ＿５＿０ｄｄＹ５ｗ♀マウス（平均体重２１．３ｇ、１群７匹）
を用い、生理食塩水に溶解した試料を各種投与量で腹腔
内に１回投与した１０日間観察しＬＤ＿５＿０を求めた
。その結果、ＬＤ＿５＿０は２００ｍｇ／ｋｇ体重以上で
あつた。