KR830000309B1 - 제암활성을 가진 다당류의 제조법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도 및 제2도는 본 발명의 실시예에서 얻은 다당류에 대한 적외선 분광도이다.
본 발명은 제암제활성을 갖고 있는 다당류 및 그것을 제조하는 공정에 관한 것이다.
특히 본 발명은 잎새버섯종(Pplyporus)에 속하는 담자균류에 속하며 제암활성을 갖는 다당류를 만들어내는 균주의 자실체나 균사체로부터, 또는 이런 균주의 배양액으로부터 전술한 다당류를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 제암활성을 나타내는 다당류를 생산할 수 있는 담자균류의 잎새버섯 속에 속하는 어떤 균주의 종(種)도 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 실시예에는 1973년 일본, 미야기현, 이주미다케공원에서 채집한 진균(眞菌)류의 자실체 조직 배양액에서 얻은 잎새버섯 균사체를 사용했다. 이 종(種)에 관해서는 로구야 이마제키와 쓰기오혼고 공저(共著)인 1965년도 호이쿠샤 발행 “원색 일본 균류도감”과 세이야이토 저(箸) 1955년도 요켄도사 발생 일본균류지 제2권 제4호 및 카나다 식물잡지 1951년도 29호 P147-P157에 나와 있다.
본 균주의 특성은 다음과 같다.
자실체의 직경은 5-15cm이며 크기도 거의 같다.
자실체의 두부 부분은 반구형이나 곧 그 상부는 약간 구부러지고 하부는 평평한 구조로 팽윤되어 있다.
이 두부 부분은 담황색이나 연갈색을 띄며, 자실체의 모체가 되는 균핵에 굵은 줄기로 연결되어 있다.
이 두부 부분은 부드럽고 조직은 치즈와 비슷하여 성숙되면 조그만 담황색 조직으로 덮인다. 두부의 아랫부분은 관상형으로 이루어져 있으며 균체줄기에 가까와질수록 폭이 좁아지고 얕아진다. 이 균주의 균핵은 구형이나 계란형이 아니고 평평한 모양을 하고 있다. 포자는 무색이며(무리로 있을 때는 백색을 띈다) 계란형이고 부드러우며 크기는 1.2-4μ이다. 이러한 특성과 상기 예증한 책들로부터 이 균주는 잎새버섯 균사체로 판명되었다.
본 균주는 일본 공업기술연구원 발효기술연구소에 FERM-P.4641로, 또 미국 배양집합소에 ATCC20544로 기탁되어 있다.
본 발명의 제암활성 다당류는 이런 균사체를 배양한 여과 배양액이나 균주를 숙성시킨 균사체와 자실체의 추출액에서 얻을 수 있다.
그러나 자연에서 이런 자실체를 충분한 양을 얻기는 어렵다. 그러므로 자실체를 다량 획득하기 위해서는 균사체를 배양하는 것이 유리하다. 이 배양방법은 담자균류의 균체배양법으로 잘 공지되어 있으며, 배양체로서 나무조각이나 톱밥을 사용한다.
실예로써 200g의 톱밥에 100g의 쌀겨, 300ml의 물을 잘 혼합하여 적당한 용기내에서 살균하여 배양체를 만들 수 있다.
공지된 방법으로 분리하여 배양한 균주를 25-27℃에서 공지의 방법으로 전술한 배양체를 이용하여 한달동안 균사체가 충분히 성숙하도록 배양하였다. 이후에 배양체를 흙이나 모래로 덮어 자실체가 자라도록 한달에서 두달동안 방치하였다. 이렇게 성장한 자실체를 채집하여 본 발명의 원료로 사용하였다.
본 발명에 사용된 균사체는 고체배양이나 액체배양법으로도 얻을 수 있다. 고체배양에는 예로써 한천, 젤라틴, 전분, 나무조각, 펄프, 전형적인 토양배양체나 이들의 조합체를 사용할 수 있다.
액체배양시에는 미생물의 배양분야에서는 잘 공지된 영양분을 포함하는 액을 쓸 수 있다. 액체배양에는 탄소원으로 포도당, 과당, 자당, 유당, 전분, 효모 등을, 또 질소원으로는(유기 및 무기질소화합물)펩톤이나 효모, 효모추출체, 옥수수액 및 요소, 암모늄염 등을 사용하며, 인산염이나 마그네슘염 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라서 비타민류를 첨가할 수도 있다. 이러한 고체배양이나 액체배양에 사용되는 물질들은 균류배양분애에 잘 공지되어 있으며 여기서는 상세한 설명을 약하기로 한다.
액체배양은 정지배양법이나 유동배양법 또는 침잠배양법 등을 사용할 수 있다.
경제면과 조작면에서 볼 때 용액배양법 특히 침잠배양법이 고체배양법보다 유리하다.
액체 배양법을 조작하는데 있어서는 아래 조건이 필요하다.
초기 pH 2-9
배양온도 15-35℃
배양기간 2-20일
침잠배양시에는 배양체내에 3C-500rpm 속도로 교반하면서 0.1-2l/분의 비율로 통기시켜 주어야 한다.
상기의 고체배양법이나 액체배양법으로 배양시킨 균사체를 공지된 방법으로 채집하여 본 발명의 원료로 사용한다. 예를 들면 액체배양법에 있어서 균사체는 액체배양체를 원심분리나 여과 같은 과정으로 분리하여 모을 수 있다. 이 분리공정으로 얻어진 잔여액은 여과발효액으로서 본 발명의 원료로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면 상기 방법으로 채집한 균사체나 자실체는 수용성 용매로 추출할 수 있다. 이 경우 자실체나 균사체는 직접 추출할 수 있다. 필요한 경우에는 이 추출에 앞서서 자실체나 균사체를 세수(洗水), 공기건조, 분쇄(분말화) 등의 전처리 공정을 거칠 수도 있으며 비극성 용매로 추출할 수도 있다. 추출에 쓰이는 수용성 용매는 물이나 물과는 혼합물 또는 산이나 염기, 염 또는 유기용매로서 물에 용해되는 것이어야 한다. 전처리된 또는 처리되지 않은 자실체나 균사체를 축출할 때는 이 자실체나 균사체를 수용성 용매와 혼합해야 한다.
용매의 온도는 120℃ 이하에서만 유지되면 되지만 적당한 온도범위는 5C-100℃이다. 어느 경우에든 온도 조절은 경제적인 면을 고려하여 선택해야 한다.추출과정은 원하는 정도까지 추출이 이루어지도록 충분한 시간에 걸쳐서 한다. 일반적으로 고온인 경우에 추출시간은 짧아진다.
상기 온도범위 이내에서는 추출은 30분-10시간에 걸쳐서 행해진다. 추출은 스테인레스스틸 또는 유리나 유리로 도장된 또느 에나멜을 씌운 용기내에서 교반하면서 행한다. 용매의 량은 넓은 범위에 걸쳐 사용할 수 있으나 일반적으로 자실체나 균사체의(건조된) 10배-100배 정도를 사용한다. 추출시에는 분쇄된 균사체나 자실체를 쓰는 것이 좋다. 추출후에는 자실체나 균사체 또는 다른 고형성분을 여과나 원심분리등으로 추출액에서 분리할 수 있다. 추출액은 진공증류나 유사 조작과정을 거쳐 농축할 수 있다. 수용성 추출액은 처음 부피의 1/3-1/10로 농축된다.
전술한 방법으로 얻은 추출액은 아래에 설명된 정제과정을 거쳐 침전시킨 후 원하는 다당류를 얻을 수 있다. 여기서 말하는 “액체추출액”은 추출액에서 균사체나 자실체 및 기타 다른 고형성분을 제거한 후 여과나 원심분리 시킨 것을 뜻한다.
여과발효액은 아래 설명한 정제과정을 거쳐 침전시킨 후 원하는 다당류를 회수할 수 있다.
여기서 말하는 여과발효액은, 전술한 액체배양법으로 균주를 배양한 배양매체 즉, 배양발효액에서 균사체나 다른 고형성분을 제거하고 얻어진, 활성성분인 다당류를 포함한 여과액을 뜻한다.
여과발효액은 진공증류나 유사조작과정을 거쳐 농축할 수 있다. 일반적으로 여과발효액은 처음 부피의 1/3-1/10로 농축된다.
액체추출액과 여과배양액은 각각 정제할 수 있으며 또는 함께 혼합해서 정제할 수 있다.
정제는 아래에 기술한 한 공정을 이용하여 이루어진다.
(A) 높은 극성 유기용매(저급알코올이나 케톤류, 예로써 메탄올이나 에탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤 등)를 첨가하여 원하는 물질을 침전시키거나 수용성 무기염(황산암모늄염, 소금, 염화칼륨 등)을 첨가하여 염석시킨다.
(B) 산이나 이온 또는 저분자량 물질들을 투석(透析), 겔여과(덱스트란이나 폴리아크릴 아마이드-예로서 Sephadex나 Biogel 등을 써서) 또는 이온교환수지 처리(흔히 시판되는 음이온 및 양이온 교환수지-예로써 Amberlite, Dowex, Duolite 등), 한외여과 등의 공정중 한 과정 또는 여러 과정을 거쳐서 제거한 후 원하는 활성체를 회수할 수 있는 순수한 용액을 얻는다.
(C) Sevag 法, 삼불화메탄(또는 삼염화메탄)법, 단백효소 처리법 등으로 유리단백질의 제거공정.
이러한 공정 및 처리공정 등은 본 분애에 잘 공지되어 있다. 필요에 따라서 이들 중 여러 공정을 함께 사용할 수도 있다.
그러나 일반적으로 농축된 액체 추출액이나 여과발효액 등은 탈색 및 산성제거 저분자량 물질제거 등을 위해서 이온교환수지 처리공정이나 투석공정 또는 겔여과, 한외여과 등의 공정들을 선별하여 또는 복합해서 시행한다.
이러한 과정을 거쳐 순수용액으로부터 냉동건조 등과 같은 방법에 원하는 활성물질을 얻을 수 있다.
필요에 따라서는 상기 공정을 반복하여 사용함으로써 원하는 순도의 용액을 얻을 수 있다.
여기서 얻은 물질은 다음과 같은 특성들을 나타낸다.
(1) 이 물질들은 백색이나 회백색 분말로서 투석현상을 나타내지 않는다.
(2) 몰리쉬 반응(Molish rxn)이나 안트론 반응(Anthrone rxn)에 대해서 양성을 나타낸다.
(3) 요오드 반응, 엘슨 모르간 반응(Elson. Morgan rxn) 뷰렛반응에 대해서는 음성을 나타낸다.
(4) 닌히드린 반응에 대해서는 미세 양성이거나 음성이다.
(5) 물에 용해될 수 있으며 가수용성 물질(예로써 유기용매, 산, 염기, 염 등등)의 용액에는 용해되지만 에테르류나 벤젠, 아세톤, 에탄올, 메탄올 등의 용매에는 용해되지 않는다.
(6) 이 물질은 뚜렷한 용해점을 나타내지 않으며 강열할 경우에는 탄화된다.
(7) 이 물질을 0.1N 황산수용액에서 분해시켜(무게비로 이물질을 0.5% 정도 포함하는) 용액을 100℃에서 5시간 동안 가열하여 얻은 가수분해체는 젖당, 포도당, 만노즈, 푸코즈, 목당 등의 당류를, 정제과정에 따라서 하나 또는 그 이상 포함하고 있다.
이러한 상기 특징으로 보아 이 물질은 고분자량의 상기 전술한 당류로 이루어진 다당류임을 알 수 있으며 분자량은 8000이나 그 이상이다.
본 발명의 다당류는 황색포도상구균, 대장균, 고초균, 흑색국균, 아구창, 칸디다 등의 박테리아나 균류 및 효모에 대해서 살균활성을 나타내지는 않는다. 그러므로 이 물질은 안티노미세태스(Antinomycetes) 속에 속하는 종으로부터 얻은 살균 항암제와는 다른 물질이다.
본 발명의 다당류는 전형적인 약들의 복용에서 일어나는 세포특성이나 또는 백혈구 감소증, 간장빈혈증, 비장위축증 또는 체중감소, 식용부진 등의 부반응을 나타내지 않는다. 이 다당류의 운모내에서의 급성독성(LD50)은 복강내에 주입했을 때 2500mg/kg 이상이다.
본 발명의 다당류는 제암활성을 띄고 있다. 제암활성은 다음 실험에 의해서 확인되고 확정되었다.
20±2g 정도의 IRC-JCL 균주인 쥐들에게 고형의 살코마(Sarcoma) 180 또는 에를리히(Erlich)암 세포를 접종하였다. 접종 일주일 후 쥐에게서 복수(腹水)의 증가를 볼 수 있었다. 암세포는 피하에 종축으로 쥐 한마리당 4,000,000개 정도 번식되어 있었다. 이 쥐들은 7-8개의 그룹으로 분리되고 매 그룹에는 8마리씩을 포함하였다. 첫번째 그룹(조정그룹)은 소금물만을 투여하고 다른 그룹에는 본 발명의 다당류를 투여하였다. 이 소금물 투여와 다당류의 투여는 암세포 접종 하루되에 복강내에 주입하였으며 그 뒤로는 하루에 9번씩 반복 투여하였다. 쥐에게 이식된 암세포에 관해서 계속 관찰하였으며 투여 마지막 날(즉 10일 후) 쥐의 평균 무게 증가를 기록한 후 해부하여 부작용을 검토하고 조정그룹(첫번째 소금물 투여그룹)에서 제거한 종양의 무게를 측정하고 다당류를 투여한 그룹에서 제거한 종양의 무게를 측정하였다.
다음 표의 억제율(IR)은 다음 식에 따라 산출하였다.
본 발명에서 제조된 다당류의 살코마 180과 에를리히 암세포에 대한 강력한 제암활성을 확인하였다.
본 발명은, 제1도 및 제2도에 나타난 본 발명의 다당류의 적외선 분광도를 참조하여 다음 예에서 더 설명될 수 있다.
[실시예 1]
잎새버섯 균사체의 균주(FERM-P.4641, ATCC 20544)를 다음 배양액 속에서 배양하였다.
배양은 상기 배양액 100ml를 500ml의 에른메이어 플라스크에서 행했다. 플라스크는 솜으로 봉하고 120℃에서 30분 동안 살균시켰다. 냉각후에 공지된 방법에 의하여, 1.5% 한천, 0.5% 에비오스(Ebics), 2% 포도당을 함유하는 사면배양액내에서 배양된 전술한 균주를 접종한다. 일주일간 27℃의 유동배양기에서 배양한 후 플라스크 내용물을 다음 배양에 사용했다. 30l의 스테인레스 스틸발효기내에서 전술한 액체배양액 20l를 120℃에서 살균시켰다. 그 후에 상기의 플라스크 내용물을 발효기내의 배양액에 접종시켰다. 이 배양액을 3일 동안 27℃에서 250r.p.m의 속도로 교반시키면서 0.5/l/분의 통기율로 호기 접종시켰다. 이렇게 하여 얻어진 발효액을 여과하여 3,000g의 습한 균사체와 17l의 여과 배양액을 얻었다.
균사체는 1l의 물로 세수한 후 그 세척액은 여과배양액에 합친다. 세수된 균사체는 6l의 물과 혼합한후 봉합용기내에서 120℃로 30분 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 뒤 여과하여 1l의 액체 추출액으로 농축시켰다. 농축된 액체추출액을 물로써 투석시킨 후 냉동건조시켜 12.08g의 회백색 분말체를 얻었다. 이 물질의 적외선 분광도(KBr환으로써)를 제1도에서 불 수 있다. 여과된 배양액(18l)을 2l로 농축한 후 물로써 투석시켜 냉동건조하여 23.6l의 연한 갈색 분말체를 얻었다.
전술한 가수분해 방법에 따르면 이 다당류들은 유당, 포도당, 만노스 (manncse), 푸코스(fuccse), 목당등으로 판명되었다. 이 다당류들의 제암활성은 다음 표 1과 2에 예시되어 있다.
[표 1]
암세포 : 살코마 180(Sarcoma 180) 4×106세포/쥐 1마리당
동물균주 : ICR-JCL 20g±2g
처리방법 : 암세포 이식후 하루뒤에 복강내에(소금물로 조정한 그룹 제외) 10번씩 투입
결정 : 고형종양의 무게
[표 2]
암세포 : 에롤리히 암세포 4×106세포/쥐 1마리당
동물균주, 처리방법, 결정 등은 전기 표 1과 같음.
[실시예 2]
200g의 톱밥, 100g의 쌀겨, 300m의 물을 혼합시켜서 배양체를 만든 후 직경 15cm×높이 20cm 크기의 합성수지로 된 원통형 용기에 넣는다. 배양체를 120℃에서 60분간 살균한 후 실온으로 냉각한다.
전술한 실시예 1에서와 같은 방법으로 사면배양체내에서 각각 배양시킨 균주 FERM-P.4641과 ATCC 5044를 전기 배양체내에서 26℃로 한달동안 균사체가 충분히 자라도록 배양시켰다.
이 배양체를 토양 속에 넣어서 2달동안 방치하여 균주의 자실체가 흙속에서 충분히 자라도록 한다.
자실체 산출량은 매용기당 180g 정도였다.
이렇게 하여 얻어진 자실체를 채집하여 건조시킨 후 분쇄한다.
그리고 100g의 자실체 분말상을 3l의 물과 혼합한 후 혼합물을 3시간 동안 가열한다. 혼합물을 여과하여 습한 여과덩어리와 여과체(액체추출액)을 얻는다. 여과덩어리에 3l의 물을 가하여 3시간 동안 가열한후 여과체(액체추출액)을 얻기 위하여 다시 여과한다. 이 두 추출액을 합하여 1l로 농축한다.
농축된 추출액을 물로써 투석하여 냉동건조시켜서 5.4g의 회백색 분말상(다당류)을 얻었다.
이 회백색 분말상은 유당, 포도당, 만노스, 푸코스, 목당 등으로 판명되었다. 이 물질의 제암활성은 고형살코마 180에 대하여 95.5%였으며 (투약량 25mg/kg/일) 완전 회귀율은 7/8이였다.
[실시예 3]
균주 FERM-P.4641, ATCC 20544를 실시예 1에서와 같은 방법으로 발효기내에서 배양하였다. 그 후에 여과배양액(11l)을 다음과 같은 방법으로 정제한다.
여과 배양액을 진공증류에 의하여 1.5l로 농축한다. 농축시킨 것을 흐르는 물속에서 24시간 동안 투석시킨다. 투석된 것을(1.6l) 가성소다로 pH 8.0으로 조정한 후 DEAE Sephadex 처리법에 따라 처리한다.
DEAE Sephadex를 거친 액의 일부를 냉동 건조하여 다당류 분말상(실시예 1과 같이)을 얻는다.
이 분말상은 회백색으로서 유당, 포도당, 만노스, 푸코스, 목당 등이었다.
전술한 액의 나머지를(1.5l 정도) 0.5l의 에탄올에 혼합시켜 침전제를 얻는다.
이 침전제를 1l의 물에 용해시킨 후 흐르는 물에서 24시간 동안 투석시킨다.
투석된 것을 염산으로 pH 3.5 정도로 조절한 후 SP-Sephadex 처리방법에 따라 처리한다.
SP-Sephadex를 거친 액을 25% 알코올 농도가 되도록 에탄올에 가하여 침전체를 얻은 후 1l의 물에 용해시키고 다시 24시간 동안 흐르는 물에 투석시킨다. 투석시킨 것을 냉동건조하여 3g의 고체상(다당류)을 얻었다. 이것을 0.3M의 초산을 함유하는 1l의 용액에 용해시켜, 0.3M의 소금물과 혼합하여 침전체를 얻는다. 혼합물을 원심분리시켜 고형물질을 얻고 이것을 여과한다.
여과한 것을 투석시키고, 투석시킨 후에 냉동건조시켜 0.18g의 산성가용 다당류(A-3로 표시)를 얻었다. 이것은 분말상으로 회백색이며 유당, 만노스, 푸코스, 목당 등으로 구성되어 있다.
원심분리하여 얻은 고형물질을 1l의 물에 용해시킨 뒤 흐르는 물속에서 24시간 동안 투석시킨다.
투석된 것을 다시 원심분리시킨 후 고형침전체를 얻고, 여과하여 여과체를 얻었다. 여과체를 냉동 건조하여 1.27g의 다당류(A-4로 표시)을 얻었다. 이것은 회백색이며 유당으로 구성되어 있다.
고형침전체는 냉동 건조하여 염기성가용 다당류(A-5로 표시)를 얻었다. 이것은 회백색이며 유당과 만노스, 목당으로 이루어져 있다. A-4의 적외선 분광도는 제2도에 예시되어 있다.
이 샘플들의 쥐에서의 제암활성은 다음과 같았다.
쥐에서의 제암활성(살코마 180)
암세포 : 살코마 180 4×106세포/쥐 1마리당
동물균주 : ICP-JCL 20g±2g
처리방법 : 암세포 이식후 하루뒤에 복강내에(소금물로 조정그룹 제외) 7번씩 투입
결정 : 고형종양의 무게
쥐에서의 제암활성(에를리히 암세포)
암세포 : 에를리히 암세포 4×106세포/쥐 1마리당
동물균주 : ICP-JCL 20g±2g
처리방법 : 암세포 이식후 하루뒤에 복강내에(소금물로 조정그룹 제외) 7번씩 투입
결정 : 고형 종양의 무게
Claims (1)
- 잎새버섯 종(Polyporus)에 속하는 담자균류에 속하며, 제암활성을 갖는 다당류를 만들어내는 균주의 자실체나 균사체 또는 그 배양여액 및 여과여액 기타 처리여액 등에서, 다당류를 액체 추출시켜 분리함을 특징으로 하는 제암활성을 갖는 다당류의 제조방법.
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KR1019790003241A KR830000309B1 (ko) | 1979-09-20 | 1979-09-20 | 제암활성을 가진 다당류의 제조법 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR830000309B1 (ko) |
-
1979
- 1979-09-20 KR KR1019790003241A patent/KR830000309B1/ko active
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