KR810000551B1 - 다당류의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

다당류의 제조방법

본 발명은 담자균강(Basidiomycetes), 코리오루스(Coriolus) 속에 속하는 진균을 심부 배양하여 얻은 배양액으로부터 항암제로 유효한 다당류를 제조하는 방법에 관한 것이다.

항암작용을 갖는 다당류는 수용성 액체배지에 담자균강에 속하는 진균을 배양하여 제조할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 또한 담자균강에 속하는 진균을 액체 배지중에서 심부 배양하면 목적하는 다당류가 균사체중에서 뿐만아니라 배지중에서도 생성되는 것으로 알려져 있다.

그러므로 담자균강의 진균을 심부 배양한 배양물로부터 다당류를 제조하기 위해서는 일반적으로 사용한 배지(배양액)는 그대로 두거나 또는 여기에 물을 가한 후에 균사체를 마쇄시켜, 배양액을 여과 또는 원심 분리하여 균사체 잔류물을 제거시키고 수득된 액체 부분으로부터 목적하는 다당류를 포집하는 방법을 사용한다.

비록 이러한 방법이 합리적이며 실제적이긴 하지만 이에는 여전히 몇가지 어려운 문제점이 있다. 예를 들면 심부배양 생성물을 곧 균사체와 용액으로 분리시키는 경우 배양계의 높은 점도 뿐만아니라 균사체의 높은 수분 함량으로 인해 분리조작이 효율적으로 이루어질 수 없다. 물을 첨가하면 배양액의 점도가 감소되고 물중으로 추출되는 속도가 증가되나 과량의 수분 사용으로 분리조작 시간이 지연되고 균사체중 물의 함량이 감소되지는 않는다.

이러한 이유로 상기 언급된 심부 배양물로부터 고효율 및 고수율로 목적하는 다당류를 제조하기 위한 개선된 방법이 산업적 견지에서 요구되어 왔다.

본 발명의 주목적은 공업적 규모 및 고수율로 담자균강 진균을 심부 배양하여 항암작용 및 기타의 바람직한 약력학적 작용을 갖는 다당류를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 방법은 담자균강의 코리오루스속에 속하는 진균을 먼저 수용성 액체 배지중에서 심부배양하고, 얻어진 배양물의 균사체와 배지를 서로 분리시키지 않고 60° 내지 150℃의 온도에서 건조시켜 건조물질중의 수분함량이 20중량% 이하가 되도록 하고, 수용매로 추출한 후, 얻어진 추출용액으로부터 분자량 5,000 이하인 물질을 제거하여 정제시킴을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에서 가장 현저한 특징은 목적성분을 배양액으로부터 직접 모으지 않고 배양액을 일단 건조시킨 후에 이를 수용성용매로 추출하는 점이다.

본 발명에서 사용하는 담자균강에 속하는 진균은 코리오루스 속에 속하는 것으로 다음이 있다 :

코리오루스 베르시칼라(Coriolus versicolor (Er.) Ou

I)

코리오루스 콘소르스(Coriolus consors (Berk.) Imaz.,)

코리오루스 히르수투스(Coriolus hirsutuss (Fr.) Qu

l)

코리오루스 파르가메누스(Coriolus Pargamenus (Fr.) Pat.,)

코리오루스 부베센스(Coriolus pubescens (Fr.) Qu

l)

및 코리오루스 콘키페르(Coriolus conchifer (Schw.) Pat.)

이 담자균강의 형태학적 특징과 진균학적 성질은 다음 참조에 설명되어 있다 : [참조 : ＂COLOURED ILLU STRATION OF FUNGI OF JAPAN＂ by Rokuya Imazeki and Tsuguo Hongo, Vols. I. 1974, and II, 1975]

이들 담자균강중 하기에 표시된 것은 일본 특허청장이 지시한 보관기관인 산업과학기술처의 발효연구기관에 보관되어 있다.

본 발명에 따라서 상기 언급된 진균을 심부 배양법에 의해 배양한다. 본 명세서중의 ＂심부 배양법＂이란 통기 및 교반시키면서 액체 배지중에서 배양시키는 것으로 균사체가 액체 배지 표면에서가 아니라 대개는 액층의 깊은 부분에서 성장하는 방법을 의미한다. 심부 배양시 일반적으로 통기 속도는 약 0.1 내지 2.0ℓ/ℓ(배지)/분이고 교반속도는 약 30 내지 800r.p.m이다.

심부 배양에 사용되는 배지는 미생물배양에 일반적으로 사용되는 공지의 천연 또는 합성배지중의 어느 것이거나 이들 공지의 배지를 적절히 변형시킨 것이다. 이러한 배지중에서 약 3 내지 10일간 배양시키면 목적 다당류를 만족할만한 높은 수율로 제조하기에 충분하다.

수용성 배지를 사용하여 심부 배양한 경우에는 균사체는 정지 배양에서와 같이 액체 표면에서 커다란 덩어리를 형성하는 것이 아니라 교반에 의한 전단력 때문에 비교적 작은 펠렛형 또는 섬유상 편을 형성한다. 이 공정중 다당류는 균사체 내부뿐 아니라 외부, 즉 배지 중에서도 생성된다.

본 발명에서는 담자균강의 진균을 상기 언급된 심부 배양하여 얻은 배양액을 건조시킨다. 이 건조과정은 통상 60 내지 150℃ 범위내의 온도에서 실시한다. 이러한 건조처리에 사용하는 건조기를 어떤 것으로 제한하지는 않지만 통상적으로 드럼 건조기, 프라쉬 건조기 또는 박층증발기와 같은 것을 사용한다.

배양물을 건조 처리함으로써 건조물질중의 수분함량이 20중량% 이하가 되며 수용성 용매 추출 효율이 대단히 높아질뿐 아니라 추출용액의 정제에 의한 다당류 포집율도 증대된다. 만약 이러한 건조처리시 온도가 60℃ 이하이면 건조속도가 감소될뿐 아니라 상기 언급된 효과도 만족할만큼 얻어지지 않는다. 또한 건조온도가 높아지면 다당류가 분해되기 쉬운 경향이 있으므로 건조처리는 150℃를 초과하지 않는 온도에서 시행할 것이 권장되고 있음을 주지하여야 한다.

상기와 같이 건조처리된 배양액을 수용성 용매로 자실체 또는 균사체 추출에 통상적으로 사용되는 방법에 의해 추출한다. 본 명세서중에서 ＂수용성 용매＂란 물 또는 알카리염(예 : 염화나트륨, 아세트산 나트륨)을 함유하는 수용액, 극성용매(예 : 메탄올, 에탄올) 등이나 본 발명에서는 가열하면서 물 또는 희알카리용액으로 추출하는 것이 가장 효과적이며 이러한 추출용액을 사용한 다단계 추출법이 공업적인 면에서 가장 유리하다.

수득된 추출 용액으로부터 분자량 5,000 이하인 물질을 제거하여 용액을 정제하면 목적하는 다당류가 수득된다. 이는 염석법, 투석법, 한외여과법, 역삼투압법, 이온-교환 수지처리법, 겔 여과법 또는 유기용매에 의한 침전법 등의 공지된 적절한 방법을 사용하여 시행할 수 있다. 이들 방법을 단독으로 또는 혼합하여 사용한다.

이들 방법중 본 발명의 목적에 가장 효과적인 것은 한외여과법과 역삼투압법이다.

추출용액으로부터 저분자량 성분(분자량 5,000 이하)을 상기 언급한 정제 처리법에 의해 제거하고 추출용액을 분무건조 또는 동결 건조시킨 후 시판용 상품으로 제조한다.

상기 기술된 방법에 따라 수득된 다당류(이후로는 본 발명의 물질로 표기함)는 질소함량이 2 내지 8%, 대부분 3 내지 6%인 갈색의 물질이며, 이러한 물질은 융점을 표시할 수 없으며 일반적으로/20℃ 이상의 온도에서는 점차 흑변하여 분해된다. 본 발명의 물질은 물에 가용이나 알콜, 피리딘, 클로로포름, 벤젠과 헥산에는 거의 불용이다. 또한 맛과 냄새가 거의 없다.

다음 표 1은 본 발명의 물질에 대한 여러 가지 정색반응시험 결과이다.

[표 1]

상기 표의 시험결과는 본 발명의 물질이 질소를 함유한 다당류임을 나타낸다. 초원심분리법에 의해 본 발명의 물질의 분자량을 측정한 결과 5,000 내지 300,000 번위내이며 평균분자량은 10,000 내지 100,000이다. 한외여과 분리막을 사용한 획분화법과 같은 기타의 측정 방법으로부터 얻은 값은 모두 10,000 내지 100,000 범위내이다. 그러므로 본 발명의 물질의 평균분자량을 10,000 내지 100,000 범위내로 평가하는 것은 매우 믿을만한 것이다.

본 발명에 따라 제공되는 질소함유 다당류는 마우스에 복강내 투여뿐 아니라 경구투여시에도 매우 탁월한 항암작용을 나타낸다. 이것은 본 발명의 물질이 경구투여용 항암제로써 유용성이 탁월함을 시사해 주는 것이다. 실제로 이러한 효과는 여러가지 다양한 실험에 의해 확인되었다. 또한 본 발명의 물질은 경구적인 항암효과 외에도 숙주의 억제된 면역을 현저히 회복시킨다. 즉 본 발명의 물질은 암의 화학요법에서 생기는 원치않는 부작용과 방사성동위원소 치료법에 대한 예민감의 증가 예방뿐만 아니라 외과수술 또는 수혈에 의한 환자의 면역 및 체력감소의 방지 및 환자의 체력 또는 면역 감소로 걸리기 쉬운 바이러스 또는 박테리아의 감염조절 또는 예방에 유용된다. 본 발명의 물질의 경구투여시에도 간의 기능개선, 식욕증가, 장관 질환치료와 배뇨촉진효과가 탁월하다. 또한 나병의 치료에도 유용된다.

본 발명의 방법을 구체적으로 다음에 상술한다. 다음 설명중 모든 백분율(%)은 언급이 없으면 중량부이다.

[실시예 1]

10% 포도당, 1.5% 효모추출물, 0.1% KH₂PO₄와 0.1% MgSO₄·7H₂O를 함유한 배지 1600ℓ를 2㎥의 수직 발효관에 넣고 이 배지에 20ℓ의 진탕배양하여 얻은 코리오루스 베르시칼라(Fr.) 꿸 FERM-P-2414의 진균 슬러리 20ℓ를 접종하고 7일간 26℃에서 배지 1ℓ당 0.5ℓ/분의 속도로 통기시키고 150r.p.m.의 속도로 교반하면서 배양한다.

따라서 수득된 배양액(슬러리)를 500ℓ씩으로 나누고 각각을 2종-드럼형 건조기로 건조시킨다.

드럼 건조기의 표면온도를 조절하여 배양액의 표면온도(드럼표면에 배양액 표면을 박층의 형태로 부착)가 각각 65℃, 80℃, 90℃, 110℃와 145℃가 되도록 하면 건조된 각 생성물의 수분함량이 20% 이하가 되게 한다(표 2 참조).

건조된 각 생성물에 250ℓ의 뜨거운 물을 가하고 95±1℃에서 3시간 동안 추출하여 냉각시킨 후 나사형경 사장치와 분리판형 원심분리기를 사용하여 균사체 잔사와 추출용액으로 분리한다. 혼합물계의 정확한 점도와 이 추출과정에서 원심분리에 필요한 시간은 표 2와 같다.

상기 기술된 처리법에 따라 얻은 추출용액을 아미콘사(Amicon Co)의 HF형 한외여과기의 PM-5막에 통과시켜 분자량이 5,000보다 작은 추출물 성분을 추출 용액으로부터 제거하여 100ℓ의 정제용액을 얻는다.

이 정제용액의 농도가 1%이므로 농축기로 분무 건조처리법에 적당한 농도로 농축시킨다. 만약 어느정도 이상으로 용액이 농축되면 정제된 용액의 겔화가 일어나 처리가 곤란해지므로 겔화가 일어나지 않는 농도의 한계치를 표 2에 임계농도로써 표시한다.

상기 언급된 농축용액을 분무 건조시키는데 필요한 시간과 수득된 다당류의 수득량은 또한 표 2에 기술한 바와 같다. 비교하기 위해서(비교실시예) 상기에 기술된 바와 동일한 방법에 의해 얻어진 배양액을 45℃ 또는 160℃에서 건조한 후 또는 건조시키지 않고 상기 기술된 것과 동일하게 처리하고 동일한 측정법을 각 생성물에 대해 실시하여 그 결과를 표 2에 밝힌다.

[표 2]

표 2에 기술된 수치에 의해서 본 발명의 방법으로 얻은 배양물을 특정한 온도 조건 특히 60 내지 150℃의 온도 범위내에서 건조처리할 때에는 추출처리, 추출물 정제처리와 정제된 용액의 농축 및 분무건조처리를 유리하게 합리적으로 시행할 수 있음을 알 수 있다.

따라서 수득된 다당류 생성물은 각각 물에 쉽게 용해되는 갈색 분말이다(비교실시예 3의 생성물은 미량의 불용물질을 함유) 생성물을 원소분석한 결과, 각 생성물은 C,H,N 및 O로 구성되어 있으며 질소의 함량은 약 3 내지 3.5%이다. 또한 표 1에 표시된 여러 가지 정색반응 시험결과로 생성물이 양성임이 밝혀졌다. 이 결과로부터 상기 언급된 생성물은 질소를 함유한 다당류임이 확인된다.

본 발명물질을 마우스에 복강내 및 경구투여시 육아종증(Sarcoma)-180 고형종양에 대한 억제작용 결과는 표 2와 같으며, 150℃ 이상의 고온에서 고온처리한 때만을 제외한 모든 경우에서 탁월한 억제작용을 나타냈음이 밝혀졌다.

종양억제효과는 통상적인 방법에 따라 측정하며 그 방법을 다음에 간단히 기술한다.

육아종증-180 종양세포를 마우스에 복강내로 이식하고 7일간 충분히 성장시킨 후 동일세포 10⁶개를 다른 마우스의 액와 피부하에 이식하여 고형종양을 일으킨다. 표본물질투여는 이식후 24시간에 시작한다. 복강내 투여시에는 본 발명의 물질을 1일 1회에 10mg/kg용량으로 하루 건너 한번씩 20일간 투여하여 0.2mℓ/20gr(마우스체중)의 총량이 되도록 하고, 경구투여시에는 본 발명의 물질 1000mg/kg을 1일 1회 20일간 투여하여 0.2ml/20gr(마우스체중)의 총량이 되도록 한다. 이식후 25일에 각 종양을 적출하여 대조그룹에서의 종양 평균중량과 본 발명 물질을 투여한 마우스그룹에서의 종양평균 중량으로부터 종양 억제율을 계산한다.

Claims (1)

1. 코리오루스속에 속하는 진균을 수용성 배지중에서 심부배양하여 배양된 균사체를 건조시키고 수득된 건조물질을 물 또는 알카리 수용액으로 추출한 후 분자량 5,000 이하의 물질을 제거시키기 위해 추출물을 한외여과 또는 역삼투 시킴으로써 질소함유 다당류를 제조하는 방법에 있어서, 건조물질중의 수분함량이 20중량% 이하가 되도록 균사체와 배지를 서로 분리시키지 않고 배양된 균사체와 함께 배지를 60 내지 150℃의 온도에서 건조시킴을 특징으로 하는 상기 다당류의 제조방법.