KR810001499B1 - 질소를 함유하는 다당류의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

질소를 함유하는 다당류의 제조방법

본 발명은 담자균강(Basidiomycetes)중 코리오루스(Coriolus) 속에 속하는 균류에서 항암작용 및 기타의 탁월한 약리작용을 갖는 질소를 함유하는 다당류의 제조방법에 관한 것이다.

항암효과를 갖고 있는 다당류는 담자균류의 수성용 매추출액을 정제함으로써 제조될 수 있는 것으로 알려지고 있다. 그러나 이러한 기지의 방법은 활성성분의 추출효율이 낮고, 그러므로서 항암물질의 산업적 생산에 이러한 방법은 실제적으로 작용할 수 없다는 중대한 결점을 갖고 있다. 추출물 정제 수단으로서의 이러한 방법은 황산암모니움을 사용하는 염석, 투석, 유기용매를 사용하는 침전, 또는 겔 여과이다.

그러나 이러한 정제수단은 실제 조작상 극히 불량하며 그럼으로써 이러한 방법은 추출물중에 함유하는 저분자물질(분자량이 5000이하)를 제거하는데에 유익한 수단이 되지 못한다. 저분자물질을 살코마(Sarcoma)-180 충실성 종양으로 감염시킨 생쥐에 대하여 복강내 투여시 거의 항종양효과가 없으며, 더욱, 이 저분자 물질은 쓴맛과 불쾌한 향기를 갖고 있어 이러한 물질의 존재는 다당류를 약제로서 사용하는데에 바람직하지 못하다.

본 발명에서 항암작용 및 기타의 여러 약리작용을 갖는 함질소다당류는 담자균강의 폴리포라세아에(Polyporaceae)중 코리오루스속에 속하는 균류를 특정한 범위의 농도를 갖는 수용액으로 추출하고 얻은 추출액 한외여과, 및 또는 역삼투압의 수단으로 정제할때에 고율로 얻을 수 있다.

본 발명에서 출발물질로 사용된 ＂코리오루스 속에 속사는 균류＂는 담자균강의 폴리포라세아에 속하는지의 균류이며 이러한 균류는 예를 들면 코리오루스 버시컬러(Coriolus versicolor(Fr.) Quel) 코리오루스 르수투수(Coriolus hirsutus(Fr.) Quel), 코리오루스 콘소스(Coriolus consors(Berk.) Imaz), 코리오루스 파르가메뉴스(Coriolus pargamenus(Fr.)Pat.) 및 코리오루스 비포르미스(Coriolus biformmis(Klots.)t.)이다. (참조 : ＂Coloured Illustration of Fungi of Japan by Rokaya Imazeki 및 Tsuguo Hongo, Vol. 1974, 및 Vol. II 1975). 코리오루스 버시컬러(FERM-P No, 2414), 코리오루스 콘소스(FERM-P No. 988), 코리오루스 히르수투스(FERM-P No. 2711), 코리오루스 파라가메누스(FERM-P No. 2712) 균주는 일본특허청장에 의해 설립된 정부기관인, 산업과학기술처(Chiba-shi, 일본) 발효연구소에 보고되어 있다.

본 발명에서 사용된 ＂코리오루스 속에 속하는 균류＂란 균류의 실체 및 또는 균사체이며 본 발명에서 코오루스 버시컬러의 인공배양액에서 얻은 균사체가 가장 바람직하다.

본 발명은 0.01N-2N 알카리수용액으로 전술한 균류를 추출하고 얻어진 추출액을 한외여과 및/또는 삼투압으로 추출액중에 분자량 5000이하의 저분자물질을 제거하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 담자균류를 추출하는데 사용하는 염기성용액의 농도는 0.01N-2N 범위의 농도가 적당하다.

만일 0.01N이하의 농도를 사용하면 물로 추출하여 얻은 결과와 다를바 없으며 반면에 2N 이상의 농도로 사용하면 분해가 일어나게 되기 때문이다. 담자균류의 바람직한 추출은 50-100℃의 온도에서 바람직하기로는 80-98℃의 온도에서 20-600분동안에 전술한 염기성용액을 사용하여 만족할 정도로 수행할 수 있다. 추출온도가 50℃이하인 경우 활성성분이 충분히 추출되지 않으며, 추출온도가 100℃이상인 경우 얻어진 활성성분이 열에 의해 활성도가 저하된다는 점에 주의하여야 한다. 바람직한 추출시간은 사용되는 염기성 용액의 농도와 온도에 따라 다양하나 통상 상기 정의된 범위 즉 20-600분내에 일정온도에서 추출하는 것이 바람직하다. 1회 추출로서 만족할 만한 결과를 얻을 수도 있다. 그러나 필요에 따라 몇회씩 추출을 반복할 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화 암모니움 또는 칼슘등과 같은 여러종류의 염기성 물질들이 본 발명에서의 염기성용액으로 사용될 수 있으며, 수산화나트륨 및 수산화칼륨을 사용하는 것이 바람직하다.

전술한 방법으로 추출한 액체추출물은 희염산 같은 광산을 사용하여 통상의 방법으로 중화시키고, 추출물중에 분자량 5000이하의 저분자물질을 제거하기 위해 한외여과 또는 역삼투압을 수행한다. 추출물은 전술한 바와 같이 황산암모니윰을 사염하는 희석, 투석, 유기용매를 사용하는 침전, 또는 겔여과의 수단으로 처리하여 정제하는 것이 통상의 방법이다. 그러나 이러한 정제수단은 조작상 극히 불량하며, 그러므로 이 문제가 해결되기를 바라고 있는 실정이었다.

본 발명자는 정제물질의 약리학적 효과와 관련지어 이러한 정제수단의 유익성을 연구하여 이 문제에 대한 해결은 추출물에 함유되어 있는 저분자물질의 제거임을 발견하고 이러한 저분자물질의 제거를 위한 더욱 합리적이고 고효율을 가진 방법에 대한 연구결과로서 한외여과 및/또는 역삼투압의 기술의 사용하는 것이 분자량 5000이하의 저분자물질을 제거하는데에 가장 효과적인 방법임을 발견하게 되었다.

본 발명에서 사용된 정제수단의 특징은 일종의 분자체로서 생각할 수 있는 압력하의 막을 사용하여 함유성분을 분자량에 따라 분획하는 것이다. 이러한 막을 사용하는 분획과정에서 분자량의 크기는 통상 사용되는 막의 종류에 따라 결정되며, 그러나 분획은 분자량과 용액중의 분자형태에 크게 의존되고, 분획된 분자량의 크기는 시중 막 제조회사의 목록에 따르면 일반적으로 사용되는 조작조건이 본 발명에 따른 추출물 정제에 언제나 적용되지는 않는다. 이런 면에서, 분자량 5,000-15,000을 분획하고 표준물질인 시토크롬(cgtochrome C, 분자량 13,000)에 대하여 98-100％)억제를 나타내는 막을 본 발명에서 사용하는 것이 바람직하다. 전술한 막을 사용하는 본 발명에 따른 정제방법을 위한 조작조건은 실제로 기구의 크기와 형태, 추출물의 양 및 기타인자에 어느정도 의존되어 변동된다. 그러나 한외여과의 경우 이러한 조작은 통상 0.5-5kg/cm³의 압력하에, 바람직하기로는 1-4kg/cm²압력하에 수행하며 조작온도는 막의 종류에 따라 다양하지만 통상 5-50℃의 온도에서 수행한다.

역삼투압의 경우, 조작압력은 통상 20-35kg/cm², 바람직하기로는 20-25kg/cm²이며, 온도는 통상 5-20℃이다.

일반적으로, 한외여과는 10,000이상의 분자량을 갖는 물질을 분획하는데 적당하고 반면에 역삼투압은 1000이하의 분자량을 갖는 물질을 분획하는데 적당하다고 알려지고 있다.

본 발명에서 지향하는 5000정도의 분획치는 상기 언급한 2가지 방법의 범위중 중간적인 것이다. 그러나 2가지 방법 모두 막을 적당히 선택함으로써 5000이하의 분자량을 갖는 물질을 분획하는데 적용시킬 수 있다.

그러므로, 본 발명에서 추출물을 정제할때, 한외여과및 역삼투압방법은 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 이러한 선택은 작동성 및 조작효율을 고려하여 수행한다.

액체추출물에서 제거된 분자량 5000이하의 분획물을 살코마-180 충실성 종양으로 감염시킨 쥐에 복강내 투여할때 그 억제효과는 거의 나타나지 않으며 이 분획물은 쓴맛과 불쾌한 냄새를 갖기 때문에 이러한 저분자물질의 존재는 본 발명의 최종 생성물인 함질소 다당류의 약리효과에 조금도 유익함을 주지않고 오히려 그 효과를 감소시키는 것으로 사료된다.

분자량 5000이하의 저분자물질이 전술한 정제방법으로 제거된 추출물을 분무건조 또는 냉동건조시키고 시판 제제로 만든다.

본 발명에서 전술한 방법으로 얻은 물질은 간과 같은 갈색을 띠며 질소함유량은 2-8%, 대개의 경우 3-6%이다. 이 물질은 명확한 융점을 갖지 않으며, 융점 측정시 서서히 혹화되고 120℃ 이상의 온도에서 분해된다. 본 발명물질은 물에는 녹으나, 알콜, 피리딘, 클로로포름, 벤젠, 헥산에는 거의 녹지 않고 또 이 물질은 무미무취이다.

본 발명에 따라 얻은 물질의 여러 정색반응은 하기 표 1의 결과를 나타낸다.

[표 1]

표 1의 결과는 본 발명물질(이하 본 물질이라 칭한다)이 질소를 함유하는 다당류임을 보여준다.

초원심분리하여 측정된 본 물질의 분자량은 5,000-300,000이고 평균분자량은 10,000-100,000이다.

한외여과 막을 사용하여 분획한 것와 같은 기타의 측정치 역시 10,000-100,000이다. 그러므로 본 물질의 평균분자량은 10,000-100,000 범위에내라는 것을 확실히 계산할 수 있다.

본 발명에 따라 얻어진 함질소다당류를 살코마-180 충실성 종양으로 감염시킨 생의에 대하여 복강내 투여할때 뿐만이 아니라 경구투여 할때에도 높은 억제율도 고도의 함양작용을 나타냈다.

이것은 본 발명물질인 함질소다당류가 경구용 항암제제로서 크게 유용함을 보여주며 이러한 효과는 여러실험에서 확증되었다.

본 물질의 사용은 이러한 경구용 항암제제에 국한되지 않으며 숙주에 대한 고도의 면역회복 활성도를 나타낸다. 즉, 항암용 화학요법게의 부작용 및 방사선치료제의 감수성증가에 대한 억제뿐만이 아니라 수술 또는 수혈후에 환자의 면역성과 체력 감소 및 이에 기인하는 바이러스나 세균에 의한 감염성 질병의 억제 또는 보호에도 효과적이다.

본 물질의 경구투여는 또, 간기능항진, 식욕증진, 장질병저해, 배설항진에 탁월한 효과를 나타낸다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 복강내투여뿐만이 아니라 경구투여에서도 전술한 바와 같은 기타의 약리학적 효과 및 탁월한 항암작용을 나타내는 함질소다당류를 다음 실시예에 언급한 바와 같은 높은 수율과 비교적 간단한 조작으로 게조하는 것이 가능하다.

[실시예 1]

코리오루스 버시컬러(FERM-P No. 2414)의 건조균사체(수분함량 8.8%; 조질소함량 : 2.5%) 200g을 0.1N-수산화나트륨용액 4ℓ에 가하고 내부온도 90-95°로 1시간동안 끓는 수욕상에서 교반한 다음, 혼합물을 50℃ 이하의 온도까지 냉각시키고 pH7.0이 되도록 1N 염산용액을 서서히 가한다. 그 다음 고형물질을 흡인여과하여 제거하고 이 고형물질을 500ml의 물로 세척하여 액체추출물을 모두 4.2리터로 만든다. 이 액체 추출물을 아미콘회사(Amicon Inc)의 한외여과기(desk-Top Ultrafilter : 한외여과막 PM-5)를 사용하여 교반하에 한외여과시키고 냉각시킨 후 10℃에서 1.5kg/cm²의 압력하에 분자량 5000이하의 저분자물질을 제거한다.

이를 농축하여 300cc의 정제용액을 만들고 이 용액을 냉동건조하여 약 26.6g의 간과 같은 갈색의 분말을 얻는다. (수율 : 13.5%)이 분말은 수분함량이 7.5이고 원소분석치는 다음과 같다. C : 40.5%; H : 6.2%; N :5.8%; O : 47.5%(산소함량은 100에서 다른 원소의 전함량을 뺀 값이다) 이 분말은 물에 잘 녹으며, 이것을 살코마-180 충실성 종양으로 감염시킨 생쥐에 대해 복강내 투여시에는 90%의 억제율을 경구투여시에는 65%의 억제율을 보여준다.

본 발명에 따른 생성물의 항암효과는 후술되는 통상의 방법으로 측정된다.

살코마-180 항암세포를 생쥐의 복강에 이식하고 세포를 7일동안 충분히 성장시킨 후에 이 세포 10⁶를 다른 생쥐와 액와(azilla 필부에 접종하여 충실성 종양을 형성시킨다. 이식한지 24시간후에 시험물을 투여하기 시작한다. 복강내로 투여하는 경우, 시험물은 100mg/kg의 투여량으로 2일에 1회씩 20일간 투여하고 총 용량은 생쥐체중 20g당 0.2ml이다.

경구로 투여하는 경우 100m/kg의 투여량으로 1일 1회씩 20일간 투여하고 총용량은 생쥐체중 20g당 0.2ml이다. 종양물은 이식한지 25일후에 적출해내고, 종양세포 성장억제율은 시험물을 투여한 생쥐의 평균 종양물중량과 대조군의 평균종양물중량으로 계산한다. 비교를 위해서는, 추출과 정제수단을 0.1N-수산화나트륨용액 4리터 대신에 물을 사용하는 점을 제외하고는 같은 조건하에서 수행한다.

수득율은 7.8%이고 본 발명을 사용하여 얻은 수율의 약 60%이다.

[실시예 2]

코리오우스 버시컬러(FERM-P No. 2414)의 생균사체(수분함량 70.8%; 조질소함량 : 건조시의 계산치 2.6%) 500g을 2리터의 물에 가하고 10-20분간 쥬스믹서로 간 다음, 혼합물에 1N-수산화나트륨용액 500cc를 서서히 가하고 끓는 수욕상에서 90-95°의 내부온도로 2시간동안 추출한다.

이 용액을 염산으로 중화시키고 세척한 후 실시예 1에 기술한 바와 같이 처리한다. 얻어진 추출물을 환외여과기를(한외여과막; G-05T막, Bio-Engineering 회사제품) 사용 한외여과하여 분자량 5000이하의 저분자물질을 제거한다.

이 용액을 농축한 후 냉동건조시켜 간과 같은 갈색의 분말 24.2g을 얻는다(수율 : 15.1%). 이 분말의 수분함량은 7.6%이고 조질소함량은 6.0%이다. 이 분말을 물에 용해시킬 때 약 20%가 불용부분이고 나머지는 물에 잘 녹는다.

이 분말은 복강내투여시 95%의 억제율을 경구투여시 70%의 억제율을 보여준다.

[실시예 3]

코리오루스 버시컬러(FERM-P No. 2414)의 건조세포(수분함량 : 8.0%, 조질소함량 : 2.5%) 2kg을 4N-수산화나트륨용액 20ℓ에 가하고 가온-냉각 자켓과 교반기가 부착된 추출용기에서 내부온도를 90-95°로 유지되도록 자켓온도를 조절하면서 교반하에 2시간동안 추출한다.

추출된 스러리(Slurry)를 실온이 되도록 냉각시키고 2N-염산을 교반하여 조금씩 가하여 pH7.0이 되도록 조절한 후 잔사(고형물질)를 원심분리하여 액체인 추출물에서 분리한다. 잔사(고형물질)에 20ℓ의 0.4N-수산화나트륨용액을 가하고 90-95°에서 2시간동안 전술한 바와 같이 추출한 후 냉각하고 중화시킨 뒤 원심분리하여 액체 추출물과 잔사를 얻는다. 이 잔사를 다시 0.4N-수산화나트륨 용액으로 1시간동안 전술한 바와 같이 처리하여 추출물을 얻는다. 3회에 걸쳐 반복 추출한 추출물을 전부 합치면 약 58리터가 된다.

이 액체 추출물은 질공농축기에서 약 10리터가 되게끔 농축시킨 뒤 10℃와 30프사이(psi)에서 한외여과(Abcor 회사의 HFA-180막을 사용함)하여 분자량 5000이하의 저분자물질을 제거한다. 이를 농축하여 5리터의 정제용액으로 만들고 한외여과시에 분리된 저분자물질을 함유하는 70리터의 용액을 역삼투압기 (Abcor 회사의 AS-205막을 사용한다)를 사용하여 저분자물질을 제거하고 농축하여 약 5리터의 정제용액을 만든다. 이를 위해 사용된 조작조건은 다음과 같다.

평균압력 : 25-30kg/cm²처리온도 : 약 10℃

초원심분리 및 역삼투압을 하여 얻은 용액을 합치고 10리터의 혼합용액을 분무건조시켜 약 395g의 간과 같은 갈색의 분말을 얻는다(수율 : 19.9%)이 분말은 수분함량이 7.0%이고 원소분석치는 다음과 같다 :

C : 40.8; H : 6.0% ; N : 4.0% ; 0 : 49.2

살코마-180 충실성 종양으로 감염시킨 생쥐에 대한 이 물질의 억제율은 복강내 투여의 경우 92%이고 경구투여의 경우는 70%이다. 이 물질은 물에 잘 녹는다.

Claims (1)

1. 담자균강의 폴리포라세아에(Polyporaceae)중 코리오루스(Coriolus)속에 속하는 균류를 0.01N-2N의 농도를 갖는 염기성 수용액으로 추출하고 얻어진 추출물을 한외여과 또는 역삼투압으로 처리하여 추출물중에 존재하는 분자량 5000이하의 저분자물질을 제거하는 것을 특징으로 하여 질소함유 다당류의 제조방법.