KR820000697B1 - 다당류의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

다당류의 제조방법

제1도는 코리오루스 베르시콜로(Fr.) Qu

l균주(일명 폴리스틱투스 베르시콜로 Fr.)의 진균류로부터 수득된 다당류물질의 적외선 흡수 스펙트럼.

제2도는 코리오루스 히르수투스(Fr.) Qu

l균주(일명 폴리스틱투스 히르수투스 Fr.)의 진균류로부터 수득된 다당류물질의 적외선 흡수 스펙트럼.

제3도는 코리오루스 콘소스(Berk.) Imaz. 균주(일명 이르펙스 콘소스 Berk)의 진균류로부터 수득된 다당류물질의 적외선 흡수 스펙트럼.

제4도는 코리오루스 파르가메누스(Fr.) Pat.균주(일명 폴리스틱투스 파르가메누스 Fr.)의 진균류로부터 수득된 다당류물질의 적외선 흡수 스텍트럼.

제5도는 코리오루스 베르시콜로(Fr.) Qu

l균주의 진균류로부터 수득된 다당류 물질의 NMR 흡수 스펙트럼.

제6도는 코리오루스 히르수투수(Fr.) Qu

l균주의 진균류로부터 수득된 다당류 물질의 NMR 흡수 스펙트럼.

제7도는 코리오루스 콘소스(Berk.) Imaz균주의 진균류로부터 수득된 다당류물질의 NMR 흡수 스펙트럼.

제8도는 코리오루스 파르가메누스(Fr.) Pat. 균주의 진균류로부터 수득된 다당류물질의 NMR 흡수 스펙트럼.

제9도는 본 발명에서 대조용으로서 취급된, 코리오르스속에 속하는 바시디오마이세트로부터의 추출물을 압력하에 여과, 살균 및 분무식 건조하여 수득된 기지의 다당류물질(PS-K)의 NMR 흡수 스펙트럼.

본 발명은 복강내 투여 및 경구투여시 항종양활성 및 다른 중요한 약학적 활성을 나타내며 당류 성분들이 α-결합되어 있는 신규의 다당류의 제조방법에 관한 것이다.

최근에 여러 가지 종류의 바시디오 마이세트로부터 항종양물질을 수득하는 것에 관한 보고서들이 작성되었다. 이러한 물질은 복강내 투여하면 중요한 항종양효과를 나타내지만 경구투여 할 경우 항종양활성은 극히 저하된다는 것이 알려져 있다. 그러므로 이러한 물질이 과학적인 연구에 있어서 매우 흥미롭다 하더라도 실질적인 유용도는 거의 없다.

여러 종류의 바시디오마이세트로부터 추출물과 수성용매를 사용한 배양물에 대한 연구과정에서, 우리는 다공균과의 코리오루스속에 속하는 바시디오 마이세트의 진균류에 의해 수득된 추출물로부터 정제된 생성물 또는 그 배양물(배양시 사용된 매체포함)은 복강내 투여는 물론 경구투여에서도 우수한 항종양 활성을 갖는다는 사실을 발견하고 이러한 추출물의 활성성분에 대한 연구를 계속하였다.

우리는 상술한 연구들의 결과를 바탕으로 하여, 다음의 방법으로 항종양활성을 갖는 신규의 활성물질을 분리하는데 성공하였다. 코리오루스속의 진균 또는 이의 배양물을 수성용매로 추출하여 얻은 추출물의 정제된 수용액을 농축시켜 얻은 용액을 황산암모늄으로 포화시키고 생성된 침전물을 탈염화시킨 후 이온교환 수지로 충진된 셀룰로즈 컬럼(예 : 디에틸-아미노에틸(DEAE) 셀룰로스 컬럼)에 통과시켜 질소성분을 흡착, 제거시키고 필요한 경우 상술한 과정들을 반복한 다음 용출물을 탈염화시키고 건조시킨다.

본 발명에 따른 다당류(이하 본 물질이라 함)는 백색분말이며, 무미, 무취이다.

본 물질의 특성은 다음과 같다.

(1) 물리적 및 화학적 성질 :

원소 분석

야나기모토 제조회사의 모델인 CHN-CORDER MT-2 분석기에 의한 본 물질의 원소분석은 다음과 같은 조성을 나타낸다. 탄소 43.5 내지 45.3%, 수소 5.7 내지 6.7%이고 나머지는 산소이다.

정색 반응

정색반응 시험은 본 물질의 수용액상에서 시행하여 표 1과 같은 결과를 얻는다.

[표 1]

본 물질이 당류를 함유하고 있다는 것은 상기의 정색반응 시험 결과로부터 확실히 알수 있다.

pH치

본 물질 1g의 100cc의 물에 용해시키고 그 용액의 pH치를 히마치-호리바제조회사의 M-5pH미터를 사용하여 측정하면 6.5 내지 7.2 사이의 값을 나타낸다.

비선 광도

본 물질의 0.25% 수성용액을 제조한 후 야나기모토 제조회사의 YANACO OR -50을 사용하여 선광도를 측정하고 그로부터 비선광도

를 결정한다. 범위는 70 내지 180이다.

분자량

한외원심분리 방법으로 측정된 본 물질의 분자량은 5,000 내지 300,000 사이의 범위이며 평균 분자량은 10,000 내지 100,000이다. 한외여과에 의한 분별법과 같은 다른 측정방법에 따라 수득된 값도 또한 10,000 내지 100,000의 값을 나타낸다. 그러므로 본 물질의 평균분자량은 10,000 내지 100,000의 범위임을 알 수 있으며 측정기구로는 SPINCO-E 한외원심분리기를 사용하였다.

용해도

본 물질은 물에 잘 녹지만 피리딘, 클로로포름, 벤젠 및 헥산에는 불용성이다.

적외선 흡수 스펙트럼

브롬화칼륨 정제방법에 따라 측정된 본 물질의 적외선 흡수 스펙트럼은 도면의 제1도에서 제4도에 나타나 있으며 시료사이에서 중요한 차이점은 나타나지 않았다. 스펙트럼은 3600-3200cm^-1, 2920-2900cm^-1, 1660-1610cm^-1, 1460cm^-1, 1410cm^-1, 1360cm^-1, 1230cm^-1, 1150cm^-1, 1080cm^-1, 1060-990cm^-1, 925cm^-1, 840cm^-1, 755cm^-1및 705cm^-1에서 흡수를 나타낸다. 제1도에서 제4도까지에 나타난 바와같이 3600-3200cm^-1에서 나타난 넓은 흡수밴드는 여러 가지 정도로 수소결합되어 있는 νOH에 의한 것이다. 이것은 예를들어 시료의 당류부분에 있는 하이드록시그룹이 0-메틸화될 경우 넓은 흡수 밴드가 사라지는 사실로부터 추정할 수 있다. 1200-1000cm^-1에서 나타난 다른 넓은 흡수밴드는 당류 부분에서 파라노오즈 고리내에 있는 C-0-C 결합의 비대칭성 신축진동에 의한 것이다.

840cm^-1에서 나타난 흡수는 당류의 α-결합에 기인한 것이며 이러한 흡수는 본 물질내에 α-결합된 당류가 있음을 지시하는 것이다. 측정기구로는 니폰 분꼬사의 DS-701 스펙트럼 분석기를 사용하였다.

단백질 핵 자기공명(NMR) 흡수 스펙트럼

본 물질의 NMR(100MHz) 흡수 스펙트럼은 바리안(Varian)의 모델 A스펙트럼 분석기를 사용하여 측정한다. 용매로는 중수를 사용하고 내부 표준물질로는 나트륨 2,2-디메틸-2-실라노펜탄-5-설포네이트(D.S.S)를 사용하여 그 결과는 제5도-제8도에 나타나 있다.

제5도에서 제8도에 나타난 2.5 내지 6.0ppm에서의 흡수는 당류부분내의 양성자에 기인한 것이며 5.0ppm에서의 흡수는 α-(1→6) 결합에 의한 것이고 5.4ppm에서의 흡수는 α-(1→4) 및 α-(1→3) 결합에 의한 것이다. 대조하기 위한, 다공균과의 코리오루스속에 속하는 바시디오 마이세트로부터의 추출물을 압력하에서 여과하고 살균한 후 분무건조하여 수득된 기지의 생성물의 NMR 흡수 스펙트럼은 제9도에 나타나 있다. 이러한 생성물은 PS-K로 명명하므로 이하 PS-K라 한다. 제5도에서 제8도까지와 제9도에서 보여준 흡수 스펙트럼의 비교로부터 알수 있는 바와 같이 PS-K와 본 물질사이의 가장 현저한 차이점은 본 물질의 경우, α-결합으로 인한 4.9-6.0ppm에서의 흡수는 관찰되었지만 β-결합으로 인한 4.4-4.9ppm에서의 흡수는 나타나지 않은 점이다. 이것은 본 물질의 당류성분이 모두 α-결합으로 되어 있다는 것을 나타내는 것이다. 본 물질내의 당류의 결합형태의 양적측정에 관해서는 5.0ppm에서 관찰된 α-(1→6) 결합과 5.4ppm에서 관찰된 α-(1→4) 및 α-(1-3) 결합으로부터 확실한 가정을 만들 수 있으나 5.4ppm에서 중복되는 α-(1→4) 결합 및 α-(1-3) 결합 때문에 각각의 결합의 정확한 양적측정은 어렵다. 더우기 본 물질은 측쇄구조를 갖기 때문에 본 물질의 상세한 구조식 설명은 하기에 기술된 메틸화방법에 의존해야 한다.

(2) 구조적 특징

본 물질의 당류 부분내의 당류성분을 확인하기 위해, 10mg의 본 물질시료를 100℃에서 16시간 동안 3%의 염화수소산메탄올과 혼합시켜 가메탄을 분해하고 통상의 방법에 따라 트리메틸실화한 후 가스크로마토그래피로 분석한 결과 글루코오즈가 현저히 우세하고 만노오즈, 갈락토오즈크, 크실로오즈 및 푸코오즈와 같은 다른 당류들은 매우 희귀하다는 것을 알수 있다.

본 물질의 당류 부분내의 중요한 당류성분인 글루코오즈의 형태(D형태 또는 L형태)를 확인하기 위해, 본 물질의 가수분해 생성물로부터 글루코오즈 결정을 분리시킨다. 분리된 글루코오즈는 143 내지 145℃의 융점을 가지며 D-글루코오즈 제조의 표준물질과 함께 혼합하거나 용융시킬 때 융점의 아무런 강하도 일어나지 않는데 이는 본 물질의 당류부분의 글루코오즈가 D-글루코오즈임을 입증하는 것이다.

글리코시드 결합의 위치는 다음의 방법에 따라 결정된다.

G¹(G¹→은 글루코오즈 구조골격),

의 결합형태는 과옥소산염 산화법 또는 스미스분해법에 따라 수득된 다당류를 분해하여 확인하며 그 비율은 하워드(Haworth) 법에 따라 메틸화 실험을 하여 결정한다. 메틸화생성물을 가수분해하여 수득된 당류는 알디톨-아세테이트 및 메틸 글루코시드로서 가스 크로마토그래피하여 확인하며 각각의 가수분해생성물은 컬럼액상 크로마토그래피로 분리한 후 결정성 유도체로 결정화하거나 전환시켜 확인한다.

본 물질내의 각각의 결합의 몰비는 G¹→결합의 몰비를 1로 하여 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 몰비는 알디톨-아세테이트의 가스 크로마토그래피에 의해 면적비로 부터 결정된 것이다.

[표 2]

상기표로부터 본 물질의 다당류부분은 대부분 α-(1→4) 결합으로 구성되지만 α-(1→3) 결합 및 많은 측쇄가 존재하기도 한다는 것을 알 수 있다. 이것은 본 물질의 구조에서 측쇄가 α-(1→3) 결합의 유사한 구조의 글루칸 부분을 가진 α-(1→4) 결합의 글루칸의 주쇄(main chain)에 결합되어 있음을 나타내는 것으로 해석할 수 있다.

다음에 기술하는 것은 본 발명에 따른 다당류의 제조방법에 관한 것이다. 전술한 바와 같이 본 발명의 다당류는 아필로포랄(Aphyllo-phorales)목, 다공균과의 코리루스속에 속하는 바시디오마이세트의 천연-또는 인공-배양된 진균류의 자실체 또는 균사로부터 추출한다.

본 발명에서 사용되는 진균류를 확인하기 위해서 “COLOURED ILLUSTRATIONS OF FUNGI OF JAPAN”by Bokuya imazeki ＆ Tsuguo Hongo(Hoi Kusha Press) 및 “FUNGI OF JAPAN”by Seiya Ito(Yokendo Press)를 참조하였다. 이들 문헌에 따라 본 발명의 다당류물질의 추출에 사용되는 출발물질, 즉 추출을 위해 수득된 배양물로부터 얻은 바시디오마이세트의 진균류는 코리오루스속, 예를들어 코리오루스 콘소스(Berk.) Imaz., 코리오루스 베리스콜로(Fr.) Qu

l., 코리오루스 히르수투스(Fr.) Quel 및 코리오루스 파르가메누스(Fr.) Pat.들이다. 이들 진균류는 다음 표에 열거된 기탁번호(Deposit NO.)를 매겨 일본 정부에 의해 지정된 저장기관인 Fermantation Research Institute(F.R.I.) of Agency of Industrial Science ＆ Technology에 보관되어 있다.

[표 3]

상기 언급된 바와 같이 본 발명의 다당류 물질의 추출에 사용되는 출발물질은 천연으로 또는 인공적으로 배양된 자실체 또는 균사이며, 액체배지를 사용하여 물질을 인공적으로 배양하는 경우 추출물질로서, 생성된 자실체와 배양에 사용되는 액체배지내에 용출액을 포함하는 모든 배양생성물을 사용할 수 있다.

산업적인 관점에서 볼 때, 액체 배지를 사용하여 배양된 자실체를 함유하는 배양물을 사용하는 것이 바람직하다. 이렇게하여 수득된 물질을 다음 단계로 추출 처리하나 필요한 경우, 후에 사용하기 위해 풍건 또는 동결-건조와 같은 적절한 건조처리를 하여 보관할 수도 있다. 추출효과를 증가시키기 위한 처리로써 추출단계에 적용시키기 전에 물질을 분쇄하는 것이 바람직하며 물질의 추출은 수성용매를 사용하여 수행한다. 여기에 사용되는 수성용매에는 물, 또는 물에 녹는 소량(예 : 10% 또는 그 이하)의 유기용매의 수용액, 산 또는 염기의 수용액이 있다.

상기 목적을 위한 유기용매의 바람직한 예에는 메탄올, 에탄올 및 이소프로필 알코올이 있다.

여기서 사용되는 산에는 염산, 황산, 아세트산 등이 있으며, 염기는 암모니아, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨 등이다. 이들 수성용매 중에서 가장 바람직한 것은 물과 약알칼리 용액이며 특히 농도가 0.005 내지 2N인 수산화나트륨 또는 수산화칼륨의 수용액이 특히 바람직하다. 추출은 상술한 바와 같은 수성용매를, 추출물질로 사용된 배양액의 5 내지 200배의 양으로 사용하여 50 내지 100℃에서 20분 내지 20시간 동안 수행한다. 50℃ 이하의 추출온도는 추출의 효율을 저하시키므로 80 내지 98℃ 사이의 온도가 추출을 수행하는데 바람직하다. 추출 횟수는 10 이하이며 3 내지 8 정도가 바람직하다. 활성물질의 분해를 방지하기 위해서는 추출의 횟수에 관계없이 추출의 총 시간을 20시간 이하로 제한하는 것이 바람직하다.

한편 추출효율의 관점에서는 1시간 이상 추출을 수행하는 것이 바람직하다. 추출에 사용되는 수성용매는 상술한 그룹으로 부터 선택하지만 단한 종류의 용매만을 사용하는 것이 필수적인 것은 아니며 어떤 경우에서는 둘 이상의 용매를 혼합하여, 예를들어 물과 약알칼리 용액을 혼합하여 사용해서 더 좋은 결과를 얻기도 하다.

본 발명에서 가장 바람직한 추출방법은 약알칼리용액을 사용하거나 또는 물과 약알칼리용액의 혼합물을 사용하여 약알칼리 용액의 농도를 점차 증가시키는 다단계 추출법이다. 이러한 형태의 추출은 추출효율을 매우 증가시킨다.

이와같은 높은 추출효과에 대한 이유가 확실히 알려지지는 않았지만 그러한 형태의 추출에서는 물질로부터 가용성물질의 용출뿐아니라 물질이 완만히 분해하여 가용성활성물질의 급속한 추출이 일어남을 가정할 수 있다. 따라서, 상기의 다-단계 추출방법에 따라 분해가 일어나 활성물질의 추출을 증가되고 각 단계마다 알칼리의 농도가 증가됨을 알 수 있다.

처음부터 고농도인 알칼리용액을 사용하여 추출을 수행할 경우 목적물질의 수득량은 추출을 진행시킴에 따라 예민하게 감소된다. 이것은 다음과 같은 이유에 기인한다. 즉 추출에 의해 수득된 획분(목적물질)은 엄격한 조건으로 인한 과량의 분해가 일어나서 바람직한 고-분자 다당류보다는 변질되거나 저분자물질이 생성되기 때문이다.

상기 언급된 추출방법에 의해 수득된 액체 추출물은 산추출의 경우 알칼리를 사용하고 알칼리추출의 경우 산을 사용하는 통상적인 방법에 따라 중화시키고 이어서 수득된 액체 추출물을 정제 처리한다. 여기서 실시되는 정제처리 단계는 추출물 내에 함유되어 있는 저분자량물질(분자량 5,000 이하인 것)을 제거하는 것이며 이러한 처리단계는 유기용매를 사용하여 염석, 투석, 한외여과, 역삼투, 겔여과 또는 침전법으로 수행하여 상기의 기술들은 단일로 또는 혼합하여 사용한다.

공학분야에서는 압력하에서 막(membrane) 분리방법인 한외여과, 또는 역삼투법을 단일로 또는 혼합하여 사용하는 것이 바람직하지만 어떤 경우에는 상기 정제처리를, 추출물에 염석처리를 미리 수행한 후 실시하기도 한다. 정제처리를 위한 투석은 보통 셀로판막, 콜로디온 격막 또는 셀룰로오즈막을 사용하여 수행한다. 염석처리에 사용되는 염석제는 황산암모늄, 식염, 염화칼륨, 탄산바륨 등이며 황산암모늄이 가장 바람직하다. 염석처리를 실시할 경우, 투석, 한외여과, 겔여과, 역삼투 또는 상기의 처리들이 뒤따른다.

겔여과는 덱스트란 또는 폴리아크릴 아미드겔로 충진된 컬럼을 사용하여 수행하며 이러한 경우 세파덱스 비오겔(Cephadex Biogel)의 상품명으로 판매되는 충진제를 사용한다. 한외여과 및 역 삼투는 막을 사용하여 전자에서는 0.5 내지 5kg/㎠의 압력하에서, 후자에서는 20 내지 35kg/㎠의 압력하에서 실시되는 분별방법이다. 침전법의 경우에서는 메탄올, 에탄올, 이소프로판을 또는 아세톤과 같은 유기용매를 사용한다. 필요한 경우 상기에 언급된 처리와 동시에 이온교환처리를 수행할 수도 있다.

상술된 본 발명에 따른 정제처리 단계는, 추출물을 억제활성을 거의 나타내지 않으며 또한 그러한 획분은 약간의 고미 및 냄새를 갖기 때문에 필수적으로 수행해야 한다. 따라서 저분자 획분의 존재는 본 발명에 따른 다당류 목적물질의 약학적 효력의 면에서 바람직하지 못하다.

전술된 정제처리에 의해 수독된 액체는 1 내지 20%, 바람직하게 3 내지 10%의 농도로 조절한 후 황산암모늄으로 포화시키고 생성된 침전을 모은다. 이 침전을 물에 다시 용해하고 투석, 한외여과 또는 역 삼투에 의해 처리한 후 농도를 3 내지 10%으로 조절하고 이 용액을 DEAE 셀룰로오즈 컬럼을 통과시켜 질소성분을 흡착, 제거한 다음 필요한 경우 상기의 과정을 되풀이 하고 수득된 용출물을 농축, 건조시켜 백색을 띄며, 무미·무취의 다당류의 목적물질을 수득한다.

본 발명에 따른 다당류물질의 항종양 활성은 다음에 기술하는 여러 가지 동물실험의 결과로써 알수 있다.

급성 독성

생쥐 및 쥐에서의 급성 독성

본 시험에서 사용되는 생쥐는 ICR-JCL종에 속하며 4 내지 5주일된 21 내지 24g의 것이고 쥐는 Donryu종에 속하며 4 내지 5주일된 100 내지 150g의 것이다. 본 발명에 따른 물질은 정맥내, 피하, 복강내 및 경구와 같은 4가지 경로로 투여하고 물질 투여후 7일동안 일반적증상, 죽음 및 체중등을 관찰하고, 이 관찰기간이 지나면 동물을 죽여 그 시체를 해부한다. 결과는 표 4에 나타나 있다. 쥐 및 생쥐에게 최대투여량으로 물질을 투여하여도 죽음이 야기되지 않았고 LD₅₀에 대한 수치를 계산하기는 실질적으로 불가능하였다.

[표 4]

항종양 활성

본 발명에 따른 물질의 항종양 효과는 하기에 요약한 통상의 방법에 따라 측정된다.

사르콤마-180종양세포를 생쥐의 복강내에 접종하고 종양세포가 충분히 성장하는 7일 후 10⁶의 세포를 다른 10마리의 생쥐의 액와피부 아래 접종시켜 고체종양을 형성시킨다.

본 발명에 따른 분말물질을 생리적 식염용액에 녹인 다음 접종후 24시간째로부터 시작하여 생쥐에게 투여한다.

복강내 투여할 경우 물질은 10mg/kg 또는 0.2ml/20g(생쥐 체중)의 투여량으로 하루걸러 한번씩 총 10회 투여하고 경구투여할 경우 물질은 1,000mg/kg 또는 0.2ml/20g(생쥐 체중)의 투여량으로, 하루에 한번씩 총 24회 투여한다. 접종 25일후 종양을 적축하고 종양성장 억제율을 투여된 그룹내의 종양의 평균무게 및 대조그룹내의 종양의 평균무게로부터 계산한다. 결과는 표 5에 나타나 있다.

상기 언급된 측정에서 수득된 시험결과로부터 본 물질은 복강내 투여는 물론 경구투여에서도 우수한 항종양 효과를 나타냄을 알수 있다.

시험에 사용되는 본 물질의 시료는 표 5에 나타난 진균류 배양물의 추출물로부터 제조된다.

[표 5]

상기에 나타난 실험결과로부터 판단하면 본 물질은 경구 및 복강내 투여할 수 있다.

특히 그 특성중 하나는 단백질을 함유하지 않으므로 알레르기 발현성을 나타내지 않으며 안전한 정맥내 주사를 할수 있고 또한 포유동물에 대한 실험결과를 사람의 경우에 작용할 수 있다는 사실이 다음 문헌에 기술되어 있다(참조 : Akio HOSHI and kazuo RURETANI, Farumashia 9 : 464-468, 1973).

식도암, 위암, 군체의암 및 직장암과 같은 위장관암, 머리 및 목부위의 암, 유암, 폐암, 악성림프종 및 성인환자의 여러 종양의 치료에 대하여 경구투여할 경우 적당한 투여량은, 투여 횟수에 따라 변화하지만, 보통 하루에 1 내지 3g 정도가 바람직하며 주사할 경우의 투여량은 500mg을 넘지 않는 것이 바람직하다.

본 물질을, 경구투여를 위해 정제, 입제, 분말, 캅셀등과 같은 고상으로 제조할 경우 조성물은 결합제, 봉입제, 성형제, 활탁제, 붕해제, 습윤제 또는 그외의 첨가물 등을 함유한다. 또한 본 물질은 액제, 진탕혼합물, 현탁액, 유탁액, 시럽등과 같은 경구액상제제로 형성할 수도 있고 또한 사용되기전 재용해시키는 건조생성물의 형태로도 할수 있다. 이러한 액상제제는 통상적으로 사용되는 부가제 또는 방부제를 함유할 수 있다.

또한 주사용 제제도 안정화제, 완충제, 방부제, 등장화제 등과 같은 첨가제를 함유할 수 있으며 이것들은 단위 투여량의 물질을 함유하는 앰플제 또는 수회 투여량의 물질을 함유하는 내용물의 형태로 제조한다. 주사용 조성물은 오일 또는 수성부형제내에서 녹인 수용액, 현탁액, 용액 또는 유탁액의 형태로 제조할수 있으며 활성물질은 사용시 발열물질을 함유하지 않는 살균수와 같은 적절한 부형제에 재용해시키는 분말의 형태로 제조할 수 있다.

상기에 나타난 바와 같이, 본 발명의 다당류 물질은 항종양제로서 경구투여할 경우 매우 우수한 효과를 나타내며 또한 숙주를 통한 면역성 상승작용을 가지며 화학요법에서 부작용을 방지하거나 방사요법에서의 민감도를 증가시키는데에 효과적이다. 더우기 본 물질은 환자의 면역성 또는 체력의 억제를 방지하고 환자에게서 면역성이 쉽게 감소되는 바이러스성 또는 세균성감염에 대하여 환자를 보호하는데 유용하다.

본 물질을 경구투여하여 나타나는 탁월한 효과중에는 간기능의 증진, 장의 질병의 치료 및 방뇨의 촉진등이 있다.

본 발명은 다음의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되나 본 발명의 범이가 이로써 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

코리오루스속에 속하는 코리오루 베르시콜로(Fr.) Qu

l의 CM-103 균주(F.R.I. Deposit No. 2414)를 5%의 글루코오즈, 0.2%의 펩톤, 0.3%의 효모추출물, 0.1%의 KH₂PO₄및 0.1% MgSO₄·7H₂O로 이루어진 30cc의 배지를 함유하는 200cc의 원추형플라스크내에 접종시키고 25 내지 27℃에서 10일간 고정 배양시킨 후 배지표면에 자라난 균사의 메트(mat)를 생리적 식염수로 균질화하여 시드(seed)를 제조한다.

상기 시드의 슬러리 20ℓ를 2M³의 수직발효 탱크 내의, 10%의 글루코오즈, 1.5%의 효모추출물, 0.1%의 MgSO₄·7H₂O 및 0.1%의 KH₂PO₄로 이루어진 1600ℓ의 배지에 접종시키고 26℃에서 7일동안 배지 1ℓ당 0.5ℓ/분의 율로 통기시키고 150r.p.m.의 속도로 진탕시키며 배양한다. 상기에서 수득된 육즙을 각 500ℓ씩으로 회분시킨 후 각 부분을 이중드럼형 건조기로 건조하여 약 30kg의 건조생성물을 수득한다. 이 건조생성물중 100g을 3ℓ의 물과 함께 교반기가 장치된 5ℓ들이 플라스크에 넣고 교반을 계속하며 내부온도를 95±2℃로 3시간동안 유지시킨다. 냉각후 용액을 균사의 잔류물 및 추출용액으로 분리시킨다.

상기 균사잔류물을 1ℓ의 물로 세척하고 추출용액과 혼합하면 용량은 약 3.5ℓ가 된다.

균사잔류물에 0.1N수산화나트륨용액 2ℓ를 가하고 상기의 방법에 따라 95±2℃에서 2시간 추출한후 냉각시키고 2N염산으로 중화시킨 다음 흡인 여과하여 추출용액 및 균사 잔류물로 분리시킨다. 분리한후 잔류물은 0.5ℓ의 물로 세척하고 추출용액과 혼합시켜 2.2ℓ의 추출용액을 수득한다. 0.5ℓ의 세척수를 사용하여 2ℓ의 0.2N, 0.3N 및 0.4N 수산화나트륨 용액으로 동일한 처리를 하여 약 7.2ℓ의 추출용액을 수득한다.

상기에서 수득된 추출용액을 10℃, 1.5kg/㎠의 압력하에 Amicon's 2000벤치형 한외여과기(DM-5막으로)를 사용하여 교반 및 냉각하여 처리하여 저분자량물질 및 중성염을 제거하여 결과적으로 200cc의 액체를 수득한다.

상기에서 수득된 액체에 160g의 황산암모늄을 가하고 생성된 침전을 수집한다. 이 침전물을 물에 용해시킨후 상술한 Amicon's 한외여과기로 탈염시켜 190cc의 액체를 수득한다. 이 액체를 DEAE 셀룰로오즈(OH형태)로 층진된 직경 10cm, 길이 100cc의 컬럼에 통과시켜 액체내에 함유되어 있는 질소함유물질을 흡착 제거한후 물을 컬럼에 통과시켜 20ℓ의 용출액을 수득한다. 상기에서 생성된 액체를 회전증발기를 사용하여 180cc로 농축시키고 다시 DEAE 셀룰로오즈 컨럼을 통과시킨 수득된 용출액을 회전증발기로 더욱 농축시키고 동결전조하여 최종생성물인 분말상의 다당류물질 3.0g을 수득한다.

본 물질의 성질은 하기의 방법에 의해 축정되며 동물시험 또한 하기에 기술된대로 본 물질상에서 시행된다.

(1) 성질의 측정

적외선 흡수 스펙트럼

보롬화칼륨 정제방법에 따라 측정된 분말물질의 적외선 흡수 스펙트럼은 제1도에 나타나 있다. 이 방법에 사용된 정제는 1g의 kBr 및

내지

의 스파튤라양의 시료를 통상적인 방법에 따라 혼합, 제조한다.

흡수는 3600-3200cm^-1, 2920-2900cm^-1, 1600-1610cm^-1, 1460cm^-1, 1410cm^-1, 1360cm^-1, 1230cm^-1, 1150cm^-1, 1080cm^-1, 1060-990cm^-1, 925cm^-1, 840cm^-1, 755cm^-1, 및 705cm^-1에서 나타나며 840cm^-1에서의 흡수는 당류의 α-결합에 인한 것이다.

이것은 본 물질이 α-결합된 글루코시드로 이루어졌음을 입증하는 것이다.

비선광도

선광도는 시료의 0.25% 수용액 및 5cm 세포를 사용하여 나트륨의 D-선(589mμ)으로 측정하고 비산광도

는 선광도 α로부터 계산한다.

NMR 흡수 스펙트럼

NMR 흡수 스펙트럼은 내부 표준물질로 DSS를 취하고 용매로는 중수를 사용하여 측정한다. 표에 나타난 숫자는 로렌츠곡선(Lovenz's Curve)의 가정하에서 중수에 남아있는 경수의 영향을 제거하기 위해 보정한 후의 수치이다.

분자량

본 물질의 분자량은 한외원심분리법을 사용하여 측정한다. 결과는 모든 시험시료의 분자량이 5,000 내지 300,000의 범위이다. 측정하기 위해서 간섭광학계를 사용하는 침전평형 및 합성경계표본을 이용한다.

실험조건은 하기와 같다.

시료의 농도 0.3%; 용매 M/10M kce; 온도 25℃; 액체컨럼 1.7mm; 속도 22,000r.p.m.; 측정시간 5시간.

(2) 클루코시드의 당류 성분

본 물질의 단당류 성분을 다음의 방법에 따라 분석한다. 3mg의 시료를 글래스앰플에 넣고 3%의 메탄올성 염산 10ml를 가하여 100℃에서 16시간 동안 가메탄을 분해한 후 염산을 탄산음으로 중화시키고 실온에서 여과한다. 여액을 농축, 증발, 건조한 후 0.5ml의 무수 피리딘에 녹인다.

수득된 용액을 트리메틸실화하기 위해 0.2ml의 헥사메틸디실라잔 및 0.3ml의 트리메틸클로로실란과 혼합하고 혼합액을 실온에서 30분간 방치한다. 혼합물을 클로로포름에 녹이고 물로 세척하여 과량의 시약을 제거한 후 수득용액을 증발, 건조시킨다. 잔류물을 사염화탄소에 녹이고 가스 크로마토그래피로 분석한다.

분석의 결과, 본 물질의 당류성분의 99% 이상이 글루코오즈이고 만노오즈, 갈락토오즈, 크실로오즈, 푸코오즈 등의 당류들은 극히 소량임을 알수 있다.

본 물질의 당류부분의 주성분인 글루코오즈가 D 형태인지 또는 L 형태인지를 알기위해서 글루코오즈를 컬럼을 사용하여 본물질의 가수분해생성물로부터 분리시킨 후 융점의 강하가 나타나지 않는다. 이 결과로부하 본 물질내의 글루코오즈는 D-글루코오즈임을 알수 있다.

(3) 당류결합 방식

본 물질내의 당류결합 방식은 호워드(Howorth)법에 따라 결정된다. 2g의 시료를 10ml의 1N NaOH 용액에 녹이고 혼합물을 40 내지 50℃의 질소기류하에 격렬히 교반시키며 20ml의 디메틸황산 및 40ml의 30% 수산화나트륨 용액을 서너시간에 걸쳐 적가한 후 철야 방치하고 동량의 메틸화제로 상기와 유사하게 처리한다. 중화시킨 후 반응용액을 유수내에서 투석시키고 투석액을 감압하에서 농축한 후 상술한 메틸화 처리를 3회 반복하고 다시 중화 및 투석한 다음 반응물을 감압하에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 20ml의 클로로포름-메탄올(10:1) 혼합용매에 녹이고 여기에 석유에테르-에테르(1:1) 혼합용매를 가하여 메틸화물질을 침전시킨다. 이어서 메틸화된 물질 20mg을 100℃에서 16시간 동안 1N 황산으로 가수분해하고 가수분해생성물을 통상의 방법에 따라 알디툴-아세테이트로 전환시킨 후 가스 크로마토그래프상의 피크면적으로부터 몰비를 결정한다.

2,3,6-트리-0-Me-G와 2,3,4-트리-0-Me-G를 구별하기 위해 메틸화된 물질 20mg을 100℃에서 16시간 동안 3%의 메탄올성 염산을 사용하여 폐쇄 관내에서 가메탄올 분해한다.

2,3,4-트리-0-Me-G가 가메탄을 분해생성물의 가스크로마토그래피 분석에서 검출되지 않았다.

확증하기 위해 각각의 분해생성물을, 표준 제조물질을 사용하여 각 가수분해 생성물을 컬럼액체 크로마토그래피하에 분리한 후 결정화하거나 결정성 유도체로 전환시키며 가스크로마토그래프상에서 확인한다.

상기에 의해 수득된 본 발명에 따른 다당류 물질의 성질, 구조식 특성 및 항종양 활성은 표 6에 포괄적으로 기술하였다.

[실시예 2]

바시디오마이세트의 코리오루스속에 속하는 코리오루스 콘소스(Berk.) Imaz. CM-166(F.R.I 기탁번호 988), 코리오루스 파르가메누스(Fr.) pat. CM-161(F.R.I. 기탁번호 2712) 및 코리오루스 히르수투스(Fr.) Qu

l CM-151(F.R.I. 기탁번호 2711)균주의 시드를 실시예 1과 동일한 과정에 따라 제조한다.

상술된 각각의 배지 200ml씩을 400개의 배양법(용량 : 1ℓ)에 각각 피페트한 후 1ml의 시드를 각 배지에 접종시키고 25 내지 30℃에서 25일간 배양시킨 다음 건조하여 코리오루스콘소스(Berk.) Imaz. CM-166으로부터 980g을, 코리오루스 파 르가메누스(Fr.) pat. CM-161로부터는 1200g을, 코리오루스 히르수투스(Fr.) Qu

l로 부터는 1500g의 건조균사를 각각 수득한다.

각 균주로부터 수득한 건조균사 100g 및 2ℓ의 0.4N 수산화나트륨용액을 가열/냉각 자켓트 및 교반기가 황치된 추출용기내에 넣고 용기내부 온도를 90 내지 95℃로 유지시키도록 자켓트온도를 조절하여 교반하며 2시간동안 추출한다. 수득된 추출액을 실온으로 냉각하고 2N염산을 교반하며 적가한 후 pH를 7.0으로 조절하고 원심분리기를 사용하여 추출용액 및 균사잔류물로 분리시킨다.

균사잔류물에 2ℓ의 0.4N 수산화나트륨용액을 가하고 90 내지 95℃에서 2시간동안 유사하게 추출한 다음 냉각하고 중화시킨후 원심분리하여 추출용액 및 잔류물을 수득한다.

후자의 균사를 0.4N 수산화나트륨 용액으로 1시간 동안 더욱 추출한 후 냉각하고 중화한 다음 원심분리하여 추출용액 및 균사잔류물로 분리시킨다. 균사잔류물을 다시 0.4N 수산화나트륨용액으로 더욱 추출하고 냉각한후 중화하고 원심분리한다.

총 4회반복 추출하여 8.4ℓ의 추출용액을 수득한다. 이 추출용액을 3ℓ까지 농축한 다음 투석하기 위해 셀룰로오즈 튜브(Union carbide 사 제품인 Visking 튜브)에 넣어 6일 동안 수도꼭지에서 흐르는 물로 투석시킨후 튜브내의 용액을 농축하여 190ml의 액체를 수득한다.

수득한 농축액체에 160g의 황산암모늄을 가하고 생성된 침전을 수집한 후 물에 녹이고 Visking 튜브를 사용하여 6일동안 더욱 투석한 다음 튜브내의 용액을 410cc로 농축시킨다.

상기의 농축액체를 실시예 1과 유사한 방법, 즉 DEAE 셀룰로오즈 컬럼에 통과시켜 액체내의 질소함유 성분을 흡착, 제거한 후 수득용액을 회전증발기로 농축하고 건조하여 코리오루스 콘소스(Berk.) Imaz.로부터 6.0g을, 코리오르스 파르가메누스(Fr.) pat.로부터 6.5g을, 코리오루스 히르수투스(Fr.) Qu

l로부터 5.5g의 건조 분말상의 다당류물질을 각각 수득한다. 수득물질의 성질, 동물시험의 결과, 적외선 흡수스펙트럼, NMR 흡수 스펙트럼, 분자량, 비신광도, 당류성분 및 당류 결합방식을 실시예 1의 생성물의 성질들과 함께 표 6에 기술하였다.

[표 6]

Claims (1)

1. 코리오루스속의 진균류의 균사 및/또는 자실체를 수성용매로 추출하고 생성된 추출용액에 황산암모늄을 가하여 포화시킨 후 분자량 5,000 이하의 저분자량 물질을 제거하고 생성된 침전을 모아 물에 녹인다음 수득된 용액을 탈염화시키고 이온 교환물질로 충진된 컬럼에 통과시켜 질소 함유물질을 흡착, 제거한 후 수득된 용액을 농축시키고 건조시킴을 특징으로 하여 다당류물질을 제조하는 방법.

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