SU961565A3 - Способ получени мукополисахаридов - Google Patents

Description

3 96 sutus (Fr., Quel., Corlolus pargamenus (Fr.) Pat., с помощью воды или 0,01-0,5 н. водного щелочного раствора при 95 100с, отделение экстракта , его концентрирование, фракционированное осаждение целевого продукта сульфатом аммони , диализ и хроматографическую очистку диализата, из вида Coriolus verslcolor (Fr.) Quel используют штаммы FERM-P N 24l2-2 26, из вида Coriolus hirsutus (Fr.) Quel штамм FERM-P № 2711, из вида CorloIus pargamenus (Fr.) Pat. - штамм FERM-P № 2712, из сконцентрированного экстракта удал ют низкомолекул рные вещества путем добавлени  сульфата Ьммони  в количестве, соответствую- ; щем 100% степени насыщени , с последу ющим перерастворением полученного осадка в воде и диализом., фракционированное осаждение сульфатом аммони  осуществл ют сначала в количестве от насыщени  с удалением полученного осадка, затем в количестве 0 от насыщени  с последующим диализом , а хроматографическую очистку диализата осуществл ют на диэтиламинЬэтилцеллюлозе с элюацией 1 н. раствором NaCI, после чего целевой продукт выдел ют осаждением сульфатом аммони  в количестве kQ% от насыщени  с последующим диализом и сушкой распылением . Используемые штаммы депонированы в Научно-исследовательском институте ферментации (Агентство промьгашенных исследований и технологии) в Японии. На фиг. 1 графически изображен инфракрасный спектр поглощени  предлага емых веществ - полисахаридов, св занных с белками; на фиг, 2-6 - спектры протонного магнитного резонанса предлагаемых веществ. Мукополисахариды, полученные предлагаемым способом, более эффективны при подавлении образований из пересаженных опухолевых клеток на подопытных животных по сравнению с продуктом полученным в соответствии с известным способом, при стоматическом при .менении. Результаты сравнени  противоопухолевых активностей приведены в табл.1 8 качестве исходного материала можно примен ть как Corlolus versicolor (Fr.) Quel - штамм FEPM-P N 2H22 26 , так и Coriolus hfrsutus (Fr.) Quel - штамм FEPM-P Vf 2711, и Corlolus pargamenus (Fr.) Pat. - штамм FEPM-P № 2712. Однако дл  промышленного производЬтва наиболее вЬ1годно использовать Coriolus versicolor (Fr.) Quel штамм FF.PM-P № , так как он может обеспечить самый высокий выход предлагаемого вещества. Способ осуществл ют следующим образом . Грибы-продуценты предварительно выращивают и мицелиальную пленку, выросшую на поверхности питательной среды, гомогенизируют физиологическим раствором, чтобы получить посевной материал дл  производства культу ры. Посевной материал подвергают cтa ционарному выращиванию или выращиванию погружением дл  развити , грибницы , которую экстрагируют, примен   водный растворитель - гор чую воду или. разбавленный щелочной раствор. Полученный экстракт после, удалени  из него остатка от экстракции концентрируют и затем подвергают высаливанию сульфатом аммони  или ультрафильтрации дл  удалени  низкомолекул рных веществ. Очищенный таким образом экстракт концентрируют до 5-10 по весу. В этот концентрированный раствор затем добавл ют сульфат аммони  в количестве,, соответствующем 2S% от величины наГсыщени , с целью . проведени  фракционированного осаждени , и удал ют образовавшийс  осадок. В полученный раствор снова добавл ют сульфат аммони  в количестве, соответствующем 0% величины насыщени , и полученный .осадок собирают. Собранный осадок раствор ют в воде и обессоливают с помощью диализа. Образовавшийс  раствор пропускают через кколонку с ДЭАЭ-целлюлозой и вещество, адсорбированное на колонке, промывают водой и затем вымывают 1 н. солевым раствором. В полученный элюат снова добавл ют сульфат аммони  в количестве , соответствующем 40 величи ,ны насыщени , дл  получени  осадка. Полученный осадок снова раствор ют в воде и затем обессоливают с помощью диализа. Полученный очищенный npcjдукт высушивают. Характерные свойства предлагаемого вещества. Цветные реакции. Испытани  на цветные реакции провод т с водными растворами предлагаемого вещества и получают результата :представленные в табл. 2, Из приведенных результатов испытаний на цвет ные реакции очевидно, что предлагаемое вещество содержит сахариды и белок Растворимость. Полумаемые вещества раствор ютс  .,в ВОде и почти не раствор ютс  в ме{ганоле , пиридине, хлороформе, бензоле и гексане. Гигроскопичность. Дл  определени  гигроскопичности предлагаемого вещества несколько образцов помещают а эксикаторы, в каждом из которых поддерживаетс  заданна  относительна  влажность (табл.з) с помощью насыщенных растворов солей и содержание влаги в каждом образце определ ют, измер   изменение веса со временем. Изменение поглощени  влаги со временем при каждой относительной влажности представлено в табл 3. Примен емым насыщенным раствором дл  32 относительной влажности служит насыщенный раствор хлористого на ри  и азотнокислого кали ; дл  52 ;относительной влажности - насыщенный , раствор двухромовокислого натри ; дл 73% относительной влажности - насыще ный раствор хлористого аммони ; дл  ЭВ% относительной влажности - насыще ный раствор азотнокислого свинца. Как видно из табл. 3 каждый обра зец предлагаемого вещества претерпевает незначительное изменение внешнего вида и расплывани , вызываемого поглощением влаги, не наблюдаетс . Величина рН. рН предлагаемого вещества измер етс  при растворении образца весом 1 г в 100 мл воды. Найдено, что оно имеет рН 6,6-7,2. Это указывает на ТО, что предлагаемое вещество, по cyществу , нейтрально. Оптическое вращение. Оптическое вращение предлагаемого вещества измер ют, примен   0, водный раствор образца, чтобы определить удельное вращение Со(. Оно находитс  в области от О до 30 и предполагаетс , что предлагаемое вещество состоит преимущественно из |Ь-глюкана, удельное вращение которого пор дка 0. ИК-спектр поглощени . ИК-спектр поглощени  предлагаемого вещества, измеренный методом табле ток в бромистом калии, показан на фиг. 1. Широкую полосу поглощени  при 3600/3200 скГ относ т к l) ОНгрупп , которые в различной степени вступают в водородную св зь. Это мож- но объ снить тем, что широка  полоса поглощени  ослабл етс  или исчезает, когда гидроксильные группы в полисахаридной части образца метоксилиЬуют. Поглощени  при 1бОО и 1530 см при- писывают деформационным колебани м п соответственно. Предполо-т и жительно такое  вление возникает от белковой части образца. С другой стороны , широкие полосы поглощени  при ; 1200-1000 см рассматривают, как вызванные несимметричным валентным-колебанием св зи С-О-С в пиранозных кольцах в полисахаридной части. Кро-. ме того, при 890 смг наблюдают характерный тип поглс цени , возникающий от fb-св зи глюкозы в полисахаридной части, но характеристическое поглощение при BlO см, возникающее от(-св г зи, различают с трудом. Структура полисахаридной части. Дл  определени  структурных характеристик полисахаридной .части предла-; гаемого вещества к образцу весом О добавл ют раствор сол  ° кислоты в метаноле, чтобы выпол ить метанолиз при в течение 16 ч, и затем, после введени  триметилсилильных групп обычным способом. подвергают газохроматографическому анализу. Результаты показывают, что глюкоза составл ет более 99% общего количества сахаридов, а другие сахаридные компоненты, такие .как анноза, галактоза, ксилоза и фруктоза, ..-представлены очень скудно. Дл  того, чтобы установить тип глюкозы (D- или L-тип), кристаллы глюкозы отдел ют от продуктов гидролиза предлагаемого вещества. Найдено, что точка плавлени  отделенной глюкозы находитс  в области от до , и когда кристаллы глюкозы смешивают со стандартной I)-глюкозой, не наблюдаетс  снижени  точки плавлени . Поэтому глюкозу, .составл ющую полисахаридную часть предлагаемого вещества, идентифицируют как D-глюкозу. Характеристики вида св зи сахаридов , составл ющих полисахаридную часть. Положение глюксзидной св зи определ ют следующим образом. Типы св зи G означает структуоный скелет глюкозы ; -..G-- и «- - подтверждают из анализа моносахаридов , полученных по методу окис лени  .периодатом или разложением по способу Смита, и их соотношение в со ) ставе определ ют в опытах по метилигрованию по способу Хеуорса. В процес се идентификации сахариды, полученные при гидролизе метилированных соединений , идентифицируют с помощью газовой хроматографии как альдитолацетат и метилглюкозид. Индивидуальные продукты, гидролиза выдел ют жидкосгной хромагогрёфйей не колонке и затем кристаллизуют или переводит в их кристаллические производные.дл  подтверждени . Мол рные соотношени  каждой св зи в предлагаемом веществе даны в табл. «, причем мол рное содержание G-г -св зи прин то за 1 Мол рные соотношени , приведенные .в табл. k, определ ют по площад м пи ков на газовой хроматограмме альдитолацетата . . видно из табл. k, считаетс  что полисахаридна  часть предлагаемо го вещества состоит, главным образом из fi 1,4-св зей, МО в этой полиса харидной части существуют также и |4-Т,3-св зи и многие ответвлени . На основании этого можно сказать, что полисахаридна  часть предлагаемого вещества представл ет ёобой структуру , в которой боковые цепи св заны с главными цеп ми целлюлозы и сущест |Вуют отдельные р-1,3-св эи. Характеристики белковой части. Белковую часть предлагаемого вещества гидролизуют обычным способом и аминокислоты, составл ющие продукты гидролиза, анализируют с помощью анализатора аминокислот. Содержание аминокислот, составл ющих белковую часть, вес.: 4.впарагинова  кивуАн та13-19 Треонин 6-10 Серин6-11 Глутаминова  кислота12-18 ПролинСледы - 8 Глицин6-9 Аланин6-13 ЦистеинСледы Валин5-11 Метионин1-4 Изолейцин3-5 Лейцин Тирозин Фенилаланин Триптофан Гистидин Аргинин Аммиак Следовательно, белкова  часть предагаемого вещества содержит 18 видов минокислот, среди которых преобладат кислые и нейтральные аминокислоты, количество основных аминокислот чень ограничено. Дл  предлагаемого ещества также характерно, что аспараинова  кислота, треонин, серин, глуаминова  кислота, глицин, аланин, алин и лейцинвместе составл ют боее 70 всех аминокислот, найденных белковой части. , Хот  присутствие глюкозамина таке подтверждаетс  при аминокислотном нализе, количество этого вещества оставл ет Менее 1% по весу от общего оличества белка. Что касаетс  св зи этих аминокислот полисахаридной частью, предполагает , что аминокислоты прочно св заны полисахаридной частью в виде олигоептида или пептида. Это предложение можно вести из реультатов различного рода испытаний. При испытани хПО методу Севага, который часто примен ют дл  удалени  из образца 1римеси белка, образцы предлагаемого вещества осадка не образуют . Дл  практического осущебтвлеН1и  этого метода добавл ют 1/5 объема хлороформа и 1/25 объема Н-бутанола к водному раствору каждого образца (желательно поддерживать величину рН раствора от 4 до 5) и затем энергично встр хивают смесь. Раствор внимательно рассматривают, чтобы определить, образуетс  ли какой-нибудь гелеобразн )й ocafjOK или нет. Если полисахарид . часть « белок существуют в образце в виде простой смеси, белок денатурируетс , образует гель и оседает между слоем воды и слоем хлороформа, но такого осаждени  не происходит в том случае, когда полисахарид и белок св заны. Еще в одном опыте по осаждению, который проводитс  подобным образом С пр1именением трифтортрихлорэтана, снова не наблюдаетс  образовани  осадков из образцов предлагаемого вещества. Кроме того, образцы предлагаемого вещества не показывают изменени  содержани  белка в опыте, в котором на образцы предлагаемого вещества воздействуют протеазой - протолитическим энзимом. На основании результатов предыду- щих испытаний предполагаетс , что в предлагаемом веществе полисахаридна  и белкова  части не просто смеша ны одна с другой, а химически св заны друг с другом. Что касаетс  типа св зи полисахаридной и белковой частей в предлагаемом веществе, то известны следующие типы св эк сахара и белка: М-ацилгликозиламинный , 0-глюкозидный и глюкозидэфирный , но в Случае предлагаемого вещества, в свете тех фактов, что св зи могут с трудом разрушатьс  слабой щелочью и что после гидролиза предлагаемого вещества при анализе аминокислот отмечают присутствие глюкозамина , считаетс , что в предлагаемом веществе преобладает N-ацилглюкозиламинный тип св зи. Протонные спектры  дерного магнитного резонанса ,ЯМР . ЯМР (100 МГц ) предл.агаемого вещест ва измер ют, примен   в качестве раст ворител  т желую воду и выбира  в качестве стандарта 2,2-диметил-2-силано пентан-5-сульфонат натри  (ДСС). Ре зультаты приведены на фиг. 2-6. Если предполагаетс , что поглощение от 0,5 до 2,3 миллионных долей (м.д.) по ДСС св зано с протонами боковых цепей белковой части, а поглощение от 2,5 до 6,0 м.д - с протонами поли: сахаридной части, и если свойства предлагаемого вещества, в соответстви с приведенными определени ми, выражаютс  посредством соотношени  интексивности сигналов протонов Двух частей, то такое соотношение находитс  в области от 95/5 до 55А5. При упом нутых измерени х ЯНР дл  устранени  вли ни  .остаточной легкой воды в т желой воде пользуютс  величинами после коррекции в соответствии с допущением кривой Лоренца. Относительно поглощени  полйсахаридной части пик поглощени  при 2,5-,1 м.д. возникает благодар  протонам метиленовой группы в 2- и 6-пог ложени х в пиранозных кольцах цепи сахара. Дл  сравнени  может быть пред ложен продукт, полученный из экстракта гриба, принадлежащего к Cortolus versicolor (Fr.) Quel, после фильтрации экстракта под давлением, гор - чей стерилизации и высушивани  распылением (такой продукт обозначаетс  как Р5-К). Наибольшим различием между PS-K - предлагаемым веществом, как из фиг. 2-6,  вл етс  то, что в случае предлагаемого вещества абсолютно не наблюдаетс  поглощени  в области 4,9-6,0 м.д., возникающего из-за ; с(-св зей. Этот факт подтверждает, что полисахаридна  масть предлагаемого вещества состоит из одного в -D-глюкана. Поглощение при Ц,5 м.д. (фиг. 2Уотноситс  кр-:() И -(1 6) в протонах метина в 1-ом положении, в то врем , как поглощение при Л,7 м.Д. св зываетс  с (i-(1- 3 , и ( 1 - 2) в протонах метина в 1-ом положении. Поэтому можно опреде- лить соотношение р (1 - ) и Ji-(l )/ -(1 - 3) и ()/ - (1 -ч 2) t но так как включаетс  также разветвленное строение, упом нутый метод метилировани  должен быть использован дл  разъ снени  тонкой структуры Что Касаетс  белковой части,едва ЛИ можно считать доказанным строение такой белковой части только на основании измерений спектров  дерного магнитного резонанса. Однако, так как предлагаемое вещество показывает по-; глощение в некоторых, упом нутых ниже, заданных област х, этот метод считаетс  очень подход щим Дл  идентифика-. ции предлагаемого вещества. Предлагаемое вещество показывает поглощение при 0,9-0,1; 1,21.0,1; 2,0±i),1; ,,1 и ,,1 м.д., не поглощает в области ,0 м.д. и дает широкую полосу поглощени  в области 3,, М.Д. Молекул рный вес. Молекул рный вес предлагаемого вещества, измеренный методом ультра-; центрифугировани , находитс  в облает ти 5000-300000 и средний молекул рный вес находитс  в области ШООО100000 . Величины, полученные при других способах определени , таких как фракционирование с помощью ультрафильтрации , также попадают в область lOOOO-lOOOGQ. Поэтому можно предположить , что средний молекул рный вес предлагаемого вещества лежит в области 10000-100000. Таким образом, предлагаемое вещест во  вл етс  нЬвым веществом, полученным из полисахаридов, св занных с белками (Р S-k), происход щих из гриба , принадлежащего к Cor id us, и не содержащим сб-глюкан, согласно измерени м ЯМР, поэтому предлагаемое вещест во должно отличатьс  от Р S-K. Вещест во легко идентифицировать посредство точного определени  области поглощени  при измерени х ЯМР, поэтому техника идентификации, относ ща с  к предлагаемому веществу  впкетс  ценным ориентиром при изучении сложных высокомолекул рных веществ, извлеченных из природных материалов. Противоопухолева  активность. Испытани  острой токсичности на мышах и крысах При этих испытани х используют мы 1№ей ICR-ICL S-rain 4-5-недельного воз раста, вес щих 21-2 г, и крыс расы Оапгип Ц-5-недельного возраста, вес щих 100-150 г. Предлагаемое вещест во ввод т следующими четырьм  спосо бами: внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно и стоматически. Через 7 дне после введени  вещества провод т наблюдени  общих симптомов, гибели и веса тела и после завершени  наблюде НИИ животных умерщвл ют и вскрывают. Результаты испытаний острой .токсично ти на мышах и крысах представлены в табл. 5. Даже введение максимальной ДОЗЫ не вызывает гибели животных ни крыс, ни мышей, и практически невозможно вычислить вели чины od . Испытани  противоопухолевой актив ности. Противоопухолева  активность in vitro. Подавл юща  активность In vitro против роста клеток асцитической гепатомы АН-13. Исследуют концентрацию LCcp подавл ющую рост на 50%. Предлагаемое вещество, последовательно разбавленное, добавл ют к суспензии клеток асцитической гёпатомы АН-13 и после i 8-4acoBoro Еыращивани  подсчитывают живые клетки методом окрашивани , чтобы определить подавление роста. Результат показывает, что LCjo предлагаемого вещества составл  ет 100 мг/мл. .Активность in vitro против роста клеток асцита Эрлиха мышей. Исследую вли ние предлагаемого вещества на по глощение Н-уридина и Н-тимидина клетками асцита Эрлиха мышей (ЕС-клетки ) , ЕС-клетки () выращивают в питательной среде Eagle MEM, содержащей 500, 1000 и 2000/J г/мл предлагаемогр веществами 0,5 С/мл Н-уриди - 1 --.,, на или Н-тимидина, при в течение 120,мин. Дл  контрол  вместо предлагаемого вещества добавл ют стерильный физиологический раствор. Предлагаемое вещество может уменьшить поглощение Н-уридина РНК ЕС-клеток до 70% от контрольного при содержании предлагаемого вещества , через 120 мин, до 6S% от контрольного при 1000;Мг/мл и до 60 от контрольного при 2000/1Г/МЛ. Предлагаемое вещество может также уменьшить поглощение Н-тимидина ДНК ЕС-клеток до при 500у«г/мл, до 60% при OQO г/мл и до 2000 г/мл, через . 120 минут, соответственно. Испытание противоопухолевой активности in vivo и in vitro. (Подавл юща  активность предлагаемого вещества против роста клеток асцита Эрлиха). Исследуетс  против роста клеток асцита Эрлиха мышей. ЕС-клетки (5x10 клеTOK/rvi ) инкубируют в растворе Ханка, содержащем 5000 г/мл предлагаемого вещества, при в течение 3 ч. После инкубации ЕС-клетки пересаживают в брюшные полости ICR-iCL мышей- самок (10 мышей в каждой группе количестве 10 клеток на мышь и в регистрируют случаи гибели животных в течение 2( дней. Не наблюдаетс  гибели животных в течение 20 дней после пересадки мышам ЕС-клеток, обработанных предлагаемым веществом. Имеетс  несколько мышей , у которых отсутствует накопление асцита. С другой стороны, все мыши контрольной группы, которым привиты ЕС-клетки, погибают от опухоли в течение 20 дней после пересадки. Испытани  противоопухолевой активности in vivo. Результаты испытаний противоопухолевой активности in vivo на мышах и крысах приведены в табл. 6. Предлагаемое вещество показывает высокую противоопухолевую активность вкаждом случае, Итак, получаемое вещество - полисахарид , св занный с белками, показывает очень эффективное действие при ррименении в качестве противоопухоле вого вещества, вводимого стоматически . Предлагаемое вещество, кроме то1396 го, придает способность к иммунитету через хоз ина и  вл етс  эффективным дл  предотвращени  ухудшени  или рез кого Падени  иммунитета или физической силы Больных, которые прошли раз личные курсы лечени , такие как хими терапи , радиотерапи , хирургическа  операци  или переливание крови, неза висимо от того, были ли они поражены раком или нет. Более того, предлагаемое вещество эффективно также дл  защиты больных от инфекционных болез ней, таких как гепатит или пневмони , которые могут быть вызваны зара жением вирусами или бактери ми в результате ослаблени  или упадка иммунитета или физической силы. Кроме того, предлагаемое вещество при стоматическом введении больному не только способствует улучшению общего физического состо ни , но так же действует как облегчающее работу кишечника и улучшающее аппетит больного . Предлагаемое вещество оказываетс  также очень полезным-дл  улучше ,. ни  функции кишечника больного, который длительное врем  лежит в постеш Примеры 1-. Продуценты кажда  лини  СМ-101 (FEPM-P Jf 2kn , СМ-102 (FEPM-P tf 2lt13 и СМ-103 (FEPM-P If 2 , принадлежащих к CoriolusversTcolor (Fr.) Quel, засеваетс  в 200-миллилитровую коническую колбу, содержащую 30 мл питательной среды, имеодей следующий состав , %: глюкоза 5, пептон 0,2, дрожжевой экстракт 0,3, КН, 0,1 и 0,1. Культивирование стационарно при 25-27 0 в тече ние 10 дней и мицелиальную пленку, выросшую на поверхности питательной среды, гомогенизируют физиологически раствором дл  получени  посевного ма териала. Посевной материал затем высевают в каждую из однолитровых колб дл  выращивани , содержащих 200 мл той we самой питательной среды, и ин кубнруют при 25-27С в течение 25 , дней, чтобы посредством этого получить грибницу. Мицелиальный выход составл ет г. на колбу дл  СМ-101 2,0-2,5 г дл  СМ-102 и 2,7-3,2 г дл  СМ-103.Затем к каждой полученной грибниj e (JOO г) добавл ют 3 л дистиллированной воды и каждую из грибниц экстрагируют при перемешивании при 98 в течение 3ч. После завершени  экстракции каждый раствор раздел ют на экстракт и остаток от экстракции, 1 остаток от экстракции подвергают такой же обработке посредством экст;акции ,как упом нуто,использу  каждый из водных растворителей, указанных в табл. 7. Каждый из экстрактов собирают и затем концентрируют. Концентрированный раствор экстракта насыщают сульфатом аммони  и получают осадок. Полученный осадок снова раствор ют в воде и подвергают обессоливанию посредством диализа, использу  целлюлозную мембрану. Полученный таким образом раствор концентрируют до S% по ресу, затем добавл ют сульфат аммони  в количестве, соответствующем 25 от величины насыщений. После удалени  осадка, образовавшегос  при упом нутой обработке, к раствору снова добавл ют сульфат аммони  в количестве, соответствующем kQ% от величины насыщени . Полученный осадок раствор ют в воде и подвергают такому же обессоливанию, как- упоминалось , затем пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Адсорбированное на колонке вещество промывают водой, затем вымывают одномол рным солевым раствором. В элюат снова добавл ют сульфат аммони  в количестве 0 от , величины насыщени  и образовавшийс  в результате осадок собирают и снова раствор ют в воде. Полученный раствор обессоливают посредством диализа и концентрируют, затем высушивают распыливанием и получают посредством этого искомое вещество. Свойства полу- . ченного вещества и результаты его испытаний на животныхприведены в табл.7. Метод щелочного экстрагировани  с . .применением в качестве растворител  щелочи осуществл етс  так же, как описанный способ, за исключением того , что вместо воды в повторной экстракции осадка примен ют 1/10 н. раствор едкого натра и после завершени  экстракции довод т величину рН до нейтральной с помощью 1/10 н. сол ной кислоты..В табл. 7 приводитс  инфракрасный спектр поглощени , измеренный по способу таблеток в бромистом калии, который графически изображен на . 1 на котором видно поглощение 1/ ОН при 2600-3200 деформационные колебани  - -т при 1600 и 1530 см1 соответственно, широкое поглощение при 1200-1000 см - антисимметричные валентные колебани  С-0-С-св зи пиранозных колец о полисахаридной части и специфичное поглощение при 890 см, вызванное/ -св зью глюкозы, но поглощение при (с/-св зь) едва заметно. Так как большого различи  в инфрарасных спектрах поглощени  отдельных образцов«не отмечаетс , в качестве ти пичного представител  даны результаты одного примера 1. Измерени  ЯМР провод т, выбира  в качестве внутреннего эталона ДСС и 1Примен   в качестве растворител  т желую воду. Данные, приведенные в -1-1 Габл. 7, представл ют собой величины Лосле коррекции в соответствии с допущением кривой Лоренца дл  устранени  вли ни  остаточной легкой воды ё т желой воде. Молекул рный вес предлагаемого вещества измер ют, примен   метод ультрацентрифугировани . Он равен 5000300000 дл  всех образцов. Дл  измерени  используют седиментационное равновесие и искусственную граничную модель , примен   интерференционную оптическую систему. Услови  эксперимента следующие: концентраци  образца 0, растворитель 1/10 н. КС1; температура 25°С; длина столбика раст.вора 1,7 мм; скорость 22000 об/мин; ёрем  измерени  5ч. Аминокислотный анализ выполн ют 6 cooтвeтctвии с обычным методом путем добавлени  4 мл 6о н. сол ной кис лоты к 10 мг каждого образца, заморажива  его в смеси сухого льда и аце :гона, запаивани  образца в трубке под уменьшенным давлением, гидролизу  его течение 24 ч, при высушива  и затем раствор   в мл лимонноКислого буферного раствора с величиной рН 2,20. При определении удельного вращени  сначала измер ют оптическое вращение bJJ-линией натри  ( 589 мм), использу  0, водный раствор каждого образца и 5-сантиметровые  чейки, и вы14ИСЛЯЮТ удельное вращение о J из из меренного оптическоговращени  Измерение моносахаридного состава предлагаемого вещества провод т еле- дующим образом. 3 мг каждого образца помещают в 5-миллиметровую стекл нную ампулу, в которую добавл ют 10 мл 3 -ного раствора хлористого водорода в метаноле, и провод т метанолиз при в течение 16 ч. Образовавшийс  Продукт нейтрализуют углекислым серебром и отфильтровывают при комнатной температуре. Фильтрат упаривают досуха и затем раствор ют в 0,5 мл сухого пиридина. В полученный раствор добавл ют 0,2 мл гексаметилдисилазана и 0,3 Мл триметилхлорсилана и смесь оставл ют сто ть в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы осуществить введение триметилсилильных групп. По завершении этого процесса смесь раст (вор ют в хлороформе и, после удале ни  избытка реагента промыванием во- дои, полученный раствор упаривают , милунсппмп pauiDUp у i ictyn uonj I ди суха. Обработанное таким образом вещество (триметилсилат ; раствор ют в четыреххлористом углероде и оценивают посредством газовой хроматографии . i Тип св зи сахаридов определ ют в соотёетствии со способом Хеуорса. Т.е. 2 г каждого образца раствор ют в 10 мл 1 н. раствора ЫаОН и, поддержива  тем-г пературу смеси tO-5flC в токе азота, при интенсивном перемешивании добавл ют по капл м 20 мл диметилсерной кислоты и 0 мл 30 -ного раствора гидроокиси натри  в течение нескольких часов . После отстаивани  смеси в течеиие ночи ее подвергают такой же обработке тем же самым количеством метилирующего реагента. После нейтрали- . зации реакционный раствор диализуют в протекающей воДе, диализат концентрируют при уменьшенном давлении и подвергают трехкратному метилированию. После дополнительной нейтрализации и диализа смесь упаривают досуха при . уменьшенном давлении. Оставшеес  вещество раствор ют в 20 мл смеси хлороформа с метанолом (10:0 и к раствору добавл ют смесь петролейного эфира и эфира (1:1) дл  осаждени  метилированного вещества. Затем 20 мг этого метилированного вещества подвергают гидролизу с 1 н. серной кислотой при в течение 16 ч и продукт гидролиза обычным способом перевод т в альдитолацетат, мол рное соотношение определ ют по площад м пиков на газовой хроматограмме. Дл  того , чтобы различить 2,3,6-три-0-Ме-О и 2,3, --три-0-Ме-6-, 20 мг метилированного вещества подвергают метанолизу при в течение 16 ч в запа нной трубке, примен   раствор хлористого водорода в метаноле. При5 сутствие 2,3,-три-О-Ме-О- в продукYe метанолиза не подтверждаетс  газо роматографическим анализом. Каждый из упом нутых продуктов разложени  идентифицируют по газовой хроматогра мме, использу  эталон. Кроме того, каждый из упом нутых продуктов разложени  выдел ют, примен   жидкостну хроматографию на колонке и/или кристаллизуют или перевод т в кристаллическое производное. Свойства, структурные характеристики и противропухолевartrактивность полученных таким образе веществ полисахаридов , св занных с белками, показаны в табл. 7 При меры 5и6. Провод т аналогично примерам 1- с использова нйем штамма грибков FEPM-P Н 2711 Corlolus hirsutus (Fr.) duel. При этомлолучают практически те же самые результатыI что и в ходе проведени  эксперимента примера 1, когда исполь зуют грибки Corlglus verslcolor (Fr) duel (штамма FEPM-P ff .). Другие эксперименты провод т аналогично варианту способа, описанному в примере 1, с использованием штамма FEPM-P ff 2712 грибков Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. При этом также достигают лрэктически те же результаты, что и ;в ходе проведени  эксперимента примера1. Свойства получаемых веществ приведены в табл.8. Получаемые вещества имеют структурру , в которой белок св зан с полисахаридной частью. Предлагаемое вещество не имеет запаха, безвкусно и растворимо в воде, имеет светло-коричневую или коричневую окраску. Кроме , предлагаемое вещество не имеет определенной точки плавлени  и постепенно чернеет и разлагаетс  при температуре выше . а б, л и ц а 1 .

Раковое 1000x10 .новообразование 500x10 Эрлиха .

Саркома-180 1000x10

дозировка,мг/кг в день, умноженна  на число назначенийё

..-. -- -- Цветна  реакци  Ц Цвет/J

« «,Mi«««« J«B MM 4 М м« ««

Реакци  с о6-нафтолом и серной кислотой

Реакци  с индолом и серной кислотой

Реакци  с антроном и серной кислотой

Реакци  с фенолом и серной кислотой

65 50

95 85

85-90 60-65 83-89 50-55 500x10

Таблица 2 Результаты

Пурпурный Сахариды

КоричневыйЗеленовато- - голубой

Коричневый

Д996156520

, Продолжение табл. 2

Цветна  реакци  Цвет Г Резу|1ьтаты

Реакци  с триптофаном Пурпурно- . - и серной кислотой коричневый

Способ Лоури-Фолина Голубой Пептидные

.ЗИН j триптоРеакци  с нингидридомФиолетово- ct-Аминокислоты

после гидролиза сол -голубой ной кислотой (6 н. НС1,

, 20 ч.

««-«м м« шм « ««««.««цм. ..м

. -. г

- --- - --.- -г---- ------------ - ----

Услови Содержание влаги, %, через ч

1 I 3 7 2i I 72 96 jlt

Относительна  влажность 98% Температура20 С 10,0 12,5 16,0 22,5 25,5 27,027,027,0

Относительна  влажность 79

Температура25°С 9,0 9,5 11,7 15,0 15,5 16,016,617,0

Относительна  влажность 52%

Температура20 С 9,0 9,5 11,7 15,0 15,3 15,515,716,0

Относительна  влажность 32%

Температура16, 8,0 8,5 9,0 10,0 12,5 12,512,512,5

Продукты гидролиза Св зь Мол рное метили рованных- соотношесахаридовние

2;3,,6-Тетра-0-ме-.

тил-СG . 1

2,3,6гТри-0-ме- .

тил-С-- G - 3-12

2,3-Ди-О-метил-С- G ,5-3

2,6-Ди-О-метил-С.,1-2,5

2 ,1 -Ди-0-метил-С- Q или менее

2,,6-Три-0-метмл-С - G или менее

св зи, тирофан , цистеин

т а б л и ц а 3

Т а б л и ц а Д

Внутривенно 1300 1300

Подкожно 5000 5000

Внутрибрюшинио 5000 5000 Стоматически 720000 . 20000

Внутривенно 7бОО 600

Подкожно 5000 5000

Внутрибрюшинно 50005 5000 Стоматически 20000 20000 Л р и и е ч и   е. SC

Таблица 5

Таблица 6 Лбдксммог;.-1Р . виутрибрюшйнно; - вмутриброиинно и стоматически вес( X Цветна  реакци  (сахарид Реакци  с о -иафтолом Пурпурный и серной кислотой Коричневый Реакци  с индолом и серной кислотой Реакци  с антроном Зеленовато голубой и серной кислотой Коричневый Реакци  с фенолом и серной кислотой Реакци  с триптофаном Пурпурнои серной кислотой .коричневый Цветна  реакци  (белок) Способ Лоури-Фолина - Голубой Реакци  с нингидринон Фиолетово после гидролиза с со- гойубой л ной кислотой (6 н. НС1, 20 ч )

г

Удельное вращение в J

л

ИК-спектры поглощени ,см 3600-3200

1600

+2

4-1

Присутст- Присутствует вует Пурпурный Пурпурный Пурпурный КоричнеКоричневый Коричневый вый ЗеленоватоЗеленоваЗеленоватоголубой голубой . то-голубой КоричнеКоричневый Коричневый вый ПурпурноПурпуриоПурпурнокоричневый коричневый коричневый Голубой Голубой Голубой Фиолетово-ФиолетовоФиолетовоголубой голубой голубой

парагиновой кислоты, .глутаминовой кислоты, серима, глицина, алани на, валика и лейцина

31

Противоопухолева  активность In vftro на ингибирование роста клеток асцитйческой гепатомы АН-13, умг/мл

105

Ингибирующее действие In vitro на рост клеток асцита Эрлита (ЕС-клеток) мышей

Поглощение Н-уридина РНК ЕС-клеток через 120 мин (контрольное прин то за 100),г/мл

71 6k

500

1000

59

2000

Поглощение Н-тимидина ДНК ЕС-клеток через 120 мий (контрольное прин то за 100,11г/мл

500 1000

2000

одавление роста клеток сцмта Эрлиха, г/мл Все выжи- Все вают Противоопухолева  активность In vivo (ингибирование роста) Саркома-180 мышей, мг/кг 10

1 1

250 500 500

РО 1000

32

961565 Продолжение табл. 7

98

97

100 выживают Все выжи- Все выживают вают Показатели Раковое новообразование Эрлиха мышей, мг/кг р 50 АН-13 крыс (выжившие)/ УЧИСЛО использованных крыс, через 60 дней , мг/кг if 2507/10 . - - - - - - -Штамм FEPM-P, W

Метод экстракционной обработки

Выход продукта на 100 г сухих грибко г

Молекул рный вес

Средний молекул рный вес

Цветные реакции сахарида

Реакци  с о -нафтолсу ьфокислотой Реакци  с индолсульфокислотой Реакци  с антронсульфокислотой

Реакци  с фенолсульфокислотой Реакци  с триптофансульфокислотой

Цветные реакции белка

По методике Лоури-Фолина

Реакци  с нингидрином после гидролиза 6 н. сол ной кислотой в течение 20ч 2711

2712

Гор чей водой

0.4

0,6 - 30 X Ю

8,3 X Ю

о

Пурпурна  Коричнева 

Зеленоватоголуба 

Коричнева 

чПурпурно-коричнева 

Голуба  Голуба  Пурпурно-голуба  Пурпурно-голуба  Продолжение табл. 7 , (Ш. IKflB Пример j;i;r j;;;i:;i::i: 100 100 100 . 8/10 8/10 В/10 - - - - - I Т а б Л И Ц а . 8 .... Corlolus pargamenus (Fr.) Pat

35

Удельное вращение Сс 3

Спектрограмма поглощен лучей, см Г

3600 - 3200

1600

1530

1200-1000

890

ЯМР-спектрограмма Зона поглощени , ррт

0,,1 l,2tO,1 ,1 1,,1

,7tO,1

5,OtO,1

5,,n 3.0tl,A

Коэффициент интенсивно дл  полисахарида дл  белка

Гликозидный анализ т св зи)

.

G/1-4

36

961565 Продолжение табл. 8

+

ч- 6

етс  полоса

Имеетс  полоса III

м ll

. II -,

н и

и .

Отсутствие-полос Отсутствие полос

Фиг. 6

Фиг. 5

Отсутствует

вует

II

Имеетс 

82,5 17.5

.З. 1.7 0.9 0,6

37

Вид ,

,8

i

Состав моносахарида

Содержание, % Peзyлbtaты аминокислотного

асларагинова  кислота

треонин

серин

глутаминова  кислота

пролин

глицин

аланин

цистеин

валин

метионин

изолейцин

лейцин

тирозин

фенилаланин

триптофанлизин

гистидин

аргинин

, {аммиак )

Общее содержание аспаргинолоты , глутаминовой кислоты

аланина, валина и лейцина

961565

38 Продолжение табл. 8

Coriolus hirsutus

Corfolus pargamenus (Fr.) auel ( Fr.) Pat.

0,8 1

Глюко 99

17,8

7,2

10,1

1,5

0,7

8,6

8,1

Следы

6,5

1,3

3,

7,9 0,3

,1 Следы

3,2

0,8 3,0 2,5

73,5

961565

39 Т--

стра  токсичностьс/1) мышей, мг/кг

при внутривенном введении самцы самки

При подкожном введении самцы самки

При внутрибрюшинном введении самцы самки

При введении через рот самцы

Сёмки.

Остра  токсичность дл  крысi мг/кг При внутривенном введении: самцы самки

При подкожном введении самцы

. самки

При внутрибрюшинном введении:

самцы

самки X. При введении через рот

самцы самки П(отивоопухолева  активность.

40 Продолжение табл. 8 iCorlolus hirsutus I (Fr.) Quel

13оо

1300

5000 5000

5000 5000

20000 20000

600 600

5000 5000

5000 5000

20000 20000 р---Г iCortotus pargamenus I (Fr.) Pat, Подавление роста асцитной гепатомы в лабораторных услови х, клетки АН-13, Хс омкг/млtoo Способность подавл ть рост асЦитных клеток Эрлиха (клетки ЕС ) в организме мышей в лабораторных услови х: По истечениии 120-мииутного поглощени  Н-уридина РНК клеток ЕС (за контрольный результат вз то 100) МКГ/ЙЙ 50070 100063 200059 . По истечении 120-минутнрго поглощени  Н-тимидина ДНК клеток ЕС (за контрольный результат вз то 100 , икг/мп 500 .61 100060 200050 Подавление роста асцитны; клеток Эрхтха 3000 мкг/мл

Противоопухолева  активность бораторных услови х (подавлен

Мышина  саркома-180 .

I.

Внутрибрюшинное введение, мг/кг

10

250

500

Введение через рот, мг/кг

500

1000 Пол мос

98

100

100

85 Вид

Мышина  болезнь Эрлиха

Внутрйбрюшинное введение, мг/кг

50.

Крыса АН-13 (выживаемость: число использованных дл  опыта животных по истечении 60 дней)

Внутрйбрюшинное введение, мг/кг

29Р ,

Claims (1)

1. ;. Формула изобретени 

   Способ получени  мукопрлисахаридоо, Предусматривающийэкстракцию их из . мицели  и/или плодовых тел грибов зидиомицетов, выбранных из группы/ включающей Corlolus versfcolor (Fr.) Qdel,, Corlolus hirsutus (Fr.) Quel., Corlolus pargamenus (Fr.) Pat., с помощью воды или 0,01-0,5 н. водного 30 щелочного раствора при 95-10tf C, отделение экстракта, его концентрирование , фракционированное осаждение целевого продукта сульфатом аммони , диализ и хроматографйческую очистку диа|5 лизата, о т л и ч а ю щ и и с   теЦ,1 что, с целью улучшени  свойств полу чаемого продукта, из вида Corlolus Verslcplpr (Fr.) Quel используют штаммы FF.RM-P № ,,из вида Cor Т- 40 olus htrsutus,jFr.) Quel - штамм FERM-P (Г 2711, из вида Corlolus раг .gamenus (Fr.) Pat. - штамм FERM-P IP 2712, из сконцентрированного экст939 жение табл 8

   П

   у

   Corlplus hlrsutus

   Corlolus pargamenus (Fr.) Quel ( Fr.) Pat.

   100

   8/10

   ракта удал ют низкомолекул рные ве-гщества путем добавлени  сульфата аммони  в количестве, соответствующем 100% степени насыщени , с последующим перерастворением полученного осадка в воде и диализом, фракционированное осаждение сульфатом аммони  осуществл ют сначала в количестве от насыщени  с удалением полу енного осадка, затем в количестве 0% от насыщени  с последующим диализом , а хроматографическую очистку

   диализата осуществл ют на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюцией 1 н. раствором NaCt, после чего целевой продукт выдёл ют осаждением сульфатом аммони  в количестве kQ% от насыщени  с последующим диализом и сушкой распылением.

   Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

   Ь Патент Великобритании Н 133151, опублик. 1973.

   goo см

   «

   ОпЛ

   ОмА

   Ч3

   Фиг.5