LU80729A1

LU80729A1 - Procede de production d'un nouvel antibiotique du type peptide

Info

Publication number: LU80729A1
Application number: LU80729A
Authority: LU
Inventors: S Kondo
Original assignee: Kakenyaku Kako Kk
Priority date: 1977-12-28
Filing date: 1978-12-28
Publication date: 1980-01-22
Also published as: FR2413094A1; SE7813269L; DE2856410C2; US4221705A; NL175294C; SE432589B; AU4293978A; ES476430A1; FR2413094B1; GB2011425A; JPS5492914A; NL7812616A; SU786915A3; NL175294B; GB2011425B; JPS5744664B2; CA1115223A; DE2856410A1; AU518767B2; NZ189313A

Description

B 72-342 DP/AG

- 2 -

La présente invention est relative à l’antibiotique qu’est le K 582 M ainsi qu’à un procédé de production de cet antibiotique.

De manière plus spécifique, la présente inven--, » tion concerne un milieu de culture obtenu en procédant à la culture d’un micro-organisme producteur de K 582 M appartenant au genre Ketarhizium et un mélange de K 582 M - A et - B obtenu à partir dudit milieu soumis à culture et, au surplus, le K 582 M - A et le K 582 M - B obtenus en séparant le mélange précité de K 582 M - A et - B, aussi bien qu'un procédé de préparation des produits concernés.

La présente invention a plus particulièrement pour objet un antibiotique du type peptide à chaîne droite K 582 M, y compris le K 582 M - A et le K 582 M - B, possédant un effet antibiotique, un effet antitumoral et d’autres effets biologiques, comme aussi un procédé de production de l’antibiotique en question. K 582 M décrit dans le présent mémoire et les revendications qui le terminent est un nouvel antibiotique du type peptide à chaîne droite composé d’arginine:1, de thréonine:1, de tyrosine:1, d’ornithine:2, d'hydroxyarginine:m et de lysine:n, à titre de constituants du type amino-acide, comme aussi leurs sels. Le K 582 M - A décrit dans le présent mémoire est le K 582 M dans lequel le m de 1’ - 3 - hydroxyarginine et le n de la lysine correspondent respectivement à Λ et à 1 et le K 582 M - B est le K 582 M dans lequel le m de 1 ’ hydroxyarginine et le n de la lysine correspondent respectivement à 2 et à O.

Les figures 1 et 2 des dessins ci-annexés - s représentent les spectres infrarouges du K 582 M - A

(chlorhydrate) et du K 582 M - B (chlorhydrate) respectivement ; les figures 3 et 4 des dessins ci-annexés représentent le spectre ultraviolet du K 582 M - A (chlorhydrate) et du K 582 M - B (chlorhydrate) respectivement ; les figures 5 et 6 des dessins ci-annexés représentent le spectre de résonance magnétique nucléaire - C13 du K 582 M - A (chlorhydrate) et du K 582 M - B (chlorhydrate) respectivement; la figure 7 des dessins ci-annexés représente le spectre infrarouge du K 582 M - A (sulfate).

Dans le milieu de culture d’une souche appartenant au genre Metarhizium, utilisé à titre de microorganisme producteur de K 582 K, par exemple le Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorok. var. anisopliae 582 M, on dépose des substances qui inhibent efficacement la croissance de divers champignons vrais, en particulier Candida et les autres levures et également des substances qui inhibent efficacement la croissance de virus tels que - 4 - ceux de la poliomyélite, de la grippe, etc. et qui inhibent efficacement les tumeurs expérimentales provoquées sur des animaux.

La présente invention est fondée sur l’isolement couronné de succès des deux substances précitées possédant . l des caractéristiques similaires, à titre de nouvelles substances actives du type peptide issues du milieu de culture précité.

La souche Ketarhizium anisopliae (Metsch) Sorok. var. anisopliae 582 M a été déposée auprès de l’organisme Kogyogijutsuin-Biseibutsu-Kogyo-Gijutsu-Kenkyujo (Japon) ί . sous le numéro FERM-P 4217 le 25 novembre 1977 et auprès de l’organisme ATCC sous le numéro ATCC 20500 le 27 décembre 1977» | Les caractéristiques taxonomiques de cette ; souche sont données ci-dessous :

Observations macroscopiques : ; La croissance de la colonie sur gélose à ! extrait de malt est rapide et atteint un diamètre de ; 4,5 à 5,0 cm après 2 semaines de culture à 25°C. Elle ! présente quelque peu la forme d’une gaine. Elle est plane

II

i: et, à l’occasion, radialemsnt en entonnoir. La teinte de , la colonie varie du vert grisâtre foncé au vert jaunâtre dans la partie centrale sporogène et blanche à la lisière. Quelquefois, des parties vertes et des parties blanches sont mélangées ou forment des bandelettes. L’envers de , la colonie possède une teinte qui varie du jaune-algue - 5 - à une nuance crème et on ne peut pas déceler de sécrétion de fluide. La colonie exhale une odeur forte, comme celle appartenant à certaines cultures du genre Streptomyces. Observations microscopiques :

Le Mycélium est incolore et possède des cloisons : ' et des ramifications. Le Conidiophore est court, incolore et possède des cloisons. Il a une forme unique ou ramifiée. Plutôt que de se présenter sous une forme unique, il se termine par une forme finement ramifiée, comme celle du Pénicillium et engendre finalement une masse par assemblage étroit de fourches (ramification de 1Textrémité pointue). Une construction cylindrique constituée de conidies se développe en partie comme une couche lâche. La fourche est longue et de forme cylindrique élancée qui est incolore et ses extrémités pointues deviennent élancées.

Au surplus, à ses extrémités, sont raccordées de longues chaînes de conidies qui constituent un long ensemble cylindrique par raccordement mutuel. La conidie est du type hérospore plane sonocellulaire et présente une nuance vert-jaunâtre pâle et présente une forme cylindrique = ou ellipsoïdale allongés et quatre coins qui sont arrondis.

La longueur et la largeur varient respectivement de 4,0 à 8,0 microns et de 2,0 à 2,5 microns, mais habituellement de 5,0 à 7,0 microns. Candida est centripète de manière à former des chaînes multiples en collant les unes aux autres pour établir un grand cylindre vert-grisâtre.

Ses propriétés sur divers milieux de culture \ . .. _

s ί 3 © y © 4 ® ® S

P P ©' I 1 | I

O © P Ο H H Oq Μ Ή ni 4 11 O !Ü CB, O p H- ; P-- Oq Cq rh CQ 4 H X μ< M.

! H- Cn (Bi ro 0) H· ο I 4 n S 4 H H 4 4 o oq o g P o © 4 P ro <Dx § ï-1* CO Dl (D i—j /7* ni

4 CB (B I P, O j H

m H W

P o pl w ro

, H-

j ________ O

t—t "1 - .... C< 3 H S^Q S o w : P- CD CB' P CDs p p, c+ Os p O, LJ w 7 H· 1—1 P· CB H Q P 4 Π P H cr rv rf n O H PH H· H Ο ©' μ· H H· O O O £.

o p ο[ΰ o>û oh o a a a 2 4 p OP op OP o 4 g g g

(B 4 CD 4P ©-4P a P δ p S

4J © CDd-CD P Φ p CD y a) CD *0 δ

P © © 4 CD S

P P I P ω

bh^Sm ÏEff “S® o.œ ο,α, 0,0 I

lisvl" ®S‘ë'œ rsr” fST“1 vus oB »>» o* h, ggggg %>3 “<»3 SU3- 2-8 gç ίζ g 0 I " 7' 5.3.Î 2.3.? ®“® g g· t;s 5b ta I o p, ctctl d-crl d d I BP H CD Ocd HCD 4

-«P—______© 4__©____P

§ 2 © OQqP'pp o 40 HH

K P H 4 P 4 P P p- p, L· ft

P B* £ β* £ © „ 3 H H*d H PO

ui P. 4· P H 3 d- HOP μ· μ. a

©' £ £ jr" 2' £’ £ ©. © σ' c+ P P' M

P ©' H P' 4 4 4 H H ro μ- H 4

! M W M p O

Î! it < < < <î <! <J <! < H p W

2 2 22 222©ro©P c+ ° 4 4 44 444444 4

P ** 4- d ri- d- d-d- d-ri- d- < c+B

O H> HOq H Hcj. HCj. H 4 H d- P 2 2 2.4 O o p O p o d- 4 h p £ £ SH 4 4P 4P 4 1 d-o 2 © 0 © 0040400. P4 ©' ©' ©' P> p' Pi fü> P> 0}> (Bn fü

rt c+ d- p << H

S 4 4 4 CD

P P p p> 4 „ C+ p m P- p/ py 4 |_jy

P PO

c+ 4

P HP

P <! M

__________ P

g I 3 S S H 3 s 2 P r o 2 0000 oq

5 g g* g B

μ. μ. p £ £ P © ; t . H H μ· 4 i d-d- c+ d- d- d- : 2 P P ω ω fll rv. ^ ~ - 7 -

Les connaissances générales relatives à la culture de champignons peuvent s’appliquer à la mise en oeuvre de la culture conforme à l’invention. Comme milieu de culture et comme sources nutritives, on peut en utiliser 1 de très divers types, cependant, à titre de sources de carbone, on utilise, de préférence, des sucres, tels que le dextrose, le saccharose, le lévulose, le mannose, la glycérine, des amidons, le maltose, le xylose, le lactose, des mélasses et le mannane. A titre de sources d'azote, on peut utiliser des sels, tels que le nitrate de sodium, le nitrate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, etc., comme aussi des sources d’azote organiques, comme le bouillon, la peptone, la liqueur de macération de mais, l’extrait de levure, la fleur de fèves de soja, la fleur d’arachides, des amino-acides, etc. A l’occasion et selon les besoins, on peut également se servir d’autres sels inorganiques appropriés et d’agents auxiliaires, etc.

Quant au procédé de culture, même lorsqu’on la réalise sur un milieu de culture solide, on peut reconnaître la production du K 532 M, mais, cependant, il est des plus avantageux de procéder à la culture dans un milieu de culture liquide afin de^pouvoir réaliser une production à grande échelle.

La culture s’effectue de manière aérobie, à une température qui fluctue de 20 à 37°C, de préférence de 23 à 30°C et à une valeur de pH qui varie de 3,0 à 8,0 de préférence de 5,4 à 5,6. Si cela se révèle nécessaire, * . -V t -» « . Il - 8 -

Pour recueillir le K 582 M à partir du milieu de culture après l’achèvement de la fermentation, on peut mettre en oeuvre un procédé généralement employé pour recueillir les produits de fermentation, par exemple, un procédé de précipitation à l’aide d’un solvant organique hydrophile, par exemple l’éthanol, l’acétone, etc., un procédé de précipitation par un acide organique, par exemple l’acide picrique, l’acide flavianique, etc., un procédé de précipitation par des substances chimiques, par exemple l’acide phosphotungstique, le pentachloro-phénol sodique, le benzaldéhyde, etc., un procédé d’extraction par du méthanol ou par divers types d’absorbants actifs et aussi un procédé de purification par application ‘ d’un véhicule échangeur d’ions, une chromatographie sur des tamis moléculaires, un procédé d’orientation de la densité ou poids spécifique, un procédé de répartition à contre-courant, un procédé de fractionnement par des sels, des solvants ou des ions métalliques, un procédé d’électroforèse, un procédé d’isolement par la formation d’une substance complexe et toutes combinaisons appropriées des procédés précités permettant l’obtention de la substanc voulue.

r A titre d’exemple, on peut aisément séparer la substance voulue par mise en oeuvre d'un procédé qui allie une précipitation à une purification à l’aide d’une résine échangeuse d’ions, lequel procédé comprend les étapes de filtration par l’addition d’un adjuvant de filtration, .. . * . - . . . . . . _» f · - 9 - acide ou une résine échangeuse d’ions "basique et l’élution subséquente à l’aide d’un acide ou d’un alcali.

Le concentré ainsi obtenu par l’utilisation de la résine échangeuse d'ions est ensuite davantage -concentré, puis additionné de quantités appropriées d'éthanol et d'acétone de manière à engendrer une poudre brute du mélange de K 582 M - A et de K 582 M - B. La poudre brute ainsi obtenue est alors traitée par du méthanol, de l’alumine, du carbone activé, soumis à une chromatographie sur des tamis moléculaires et ainsi de suite de façon à engendrer un produit purifié.

Le mélange de K 582 M - A et - B ainsi obtenu contient le K 582 M - A et le K 582 M - B et présente des propriétés comme si les deux antibiotiques, à savoir le K 582 M - A et le K 582 M - B existaient ensemble de par leurs propriétés physico-chimiques et le mélange possède également des effets physiologiques, comme une activité antibiotique, une activité inhibitrice des tumeurs, des effets d'accélération et d'inhibition de l'immunité, des effets inducteurs d'interferon, etc.

Le produit purifié ainsi obtenu ou le bouillon de culture ou l'éluat obtenu par l'intermédiaire du véhicule échangeur d'ions, etc., à partir du bouillon de culture, peut être traité par mise en oeuvre de divers procédés de chromatographie, par exemple par l'utilisation d’un gel de polyacrylamide, CE-Cephadex, etc., afin d’isoler le K 582 M - A et le K 582 M - 3. A partir du - 10 - K 582 Μ - A et du K 582 M - B ainsi isolés chacun, on peut produire des substances encore davantage purifiées par mise en oeuvre de divers procédés de purification respectifs.

Les propriétés physico-chimiques du K 582 K - A et du K 582 M - B ainsi obtenus sont indiquées dans le tableau qui suit.

K 582 M - A (chlorhydrate K 582 M - B (chlorhydrate sel) sel) 1. Analyse élémentaire (%) C : 39,35 C : 36,25 H : 7,24 H : 6,61 N : 18,03 N : 18,62 C : 14,83 C : 14,0o 2. Poids moléculaire (mesuré selon les trois procédés décrits ci-dessous; cependant, étant donné que ces procédés donnent d’importantes erreurs quant à la gamme de poids moléculaires qui suit, les caractéris- . tiques des substances selon l’invention ne sont pas limitées par les valeurs des poids moléculaires mesurées qui suivent) : environ 1300 (procédé de environ 1200 (procédé de filtration à travers gel) filtration à travers gel) . environ 1300 (procédé au environ 1220 (procédé au point de congélation) point de congélation) environ 1200 (procédé à la environ 1200 (procédé à la tension de vapeur) tension de vapeur) - 11 - 3. Point de fusion 192-198°C (décomp.) 197-203°C (décomp.) 4. Pouvoir rotatoire (étant donné que ces valeurs changent fortement en fonction des conditions de mesure, les caractéristiques des substances conformes à l’invention n’y sont pas limitées) : (cc)D22=+0,2° (C=1$S, H20) (a)D22=+0,6° (θ1^, HgO) 5. Spectre infrarouge : K 532 M -A (chlorhydrate) K 532 M - B (chlorhydrate) Fig. 1 Fig. 2 6. Spectre d’absorption dans l’ultraviolet : I Fig. 3 Fig. 4

I _ 7. Spectre de résonance magnétique nucléaire - C

Fig. 5 Fig. 6 8. Solubilité 1. Chlorhydrate idem qu’à gauche ! Aisément soluble dans l’eau, j méthanol, médiocrement t· ► i soluble dans l'éthanol.

i l

L

Insoluble dans l'éther, l'éther de pétrole, le butanol, le chloroforme, ΐ ' le benzène.

k t, : ' |i t - 12 - 2. Sulfate (on présente les solubilités particulières des sulfates)

Aisément soluble dans idem qu’à gauche l'eau, médiocrement soluble dans le méthanol.

Insoluble dans les autres solvants.

9- Réaction chromogène : Réaction à la ninhydrine + idem qu'à gauche Réaction à la xanthopro-téine + Réaction de Millon + Réaction de Sakaguchi + Réaction de Pauly + Réaction de Kolisch - ‘ Réaction de Tollen-Orcin - ! ! Réaction au nitroprusiate de sodium - 10. Nature (sous forme de base libre) i ! substance basique idem qu'à gauche i ~ | 11. Teinte j

Poudre amorphe blanche idem qu'à gauche 12. Réaction de précipitation I -- La précipitation se produit " par l'addition des réactifs jl il * ;; qui suivent : |: - 13 - pho sphoro-tungstate, acide picrique, acide flavianique, pentachlorophénol, benzaldéhyde.

13* Stabilité

Stable en milieu réaction- idem qu’à gauche nel acide et neutre.

Quelque peu instable en milieu réactionnel basique.

14. Composition après hydrolyse à l'acide chlorhydrique (rapport molaire) (rapport molaire) .Arginine 1 Arginine 1

Thréonine 1 Thréonine 1

Hydroxyarginine 1 ’Hydroxyarginine 2

Tyrosine 1 Tyrosine 1

Ornithine 2 Ornithine 2

Lysine 1 Lysine 0 15. Amino-acides terminaux C-terminal (procédé de digestion à l'hydrazine)

Tyrosine Tyrosine N-terminai (procédé de dancylation) . Arginine Arginine

Activités biologiques du K 582 M - A et du K 582 M - 3, tous deux sous la forme de leurs sels du type chlorhydrate.

- 14 - 1. Effets antibiotiques du K 582 M - A et du K 582 M - B (procédé de dilution).

Concentration minimale inhibitrice de croissance '' (mcg/ml)

Microorganismes__________;__ - 4*q ci"q c .

K 582 M - A K 582 M - B-

Candida albicans 0,2 0,¾ " tropicalis 0,2 0,¾ 11 pseudo- tropicalis 0,2 0,¾ 11 utilis 0,2 0,¾ " guilliermondii 0,2 0,¾ " krusei 0,2 0,¾

Saccharomyces cerevisiae 0,2 0,¾

Br—6θ

Saccharomyces rouxii bottlucue 0,2 0,¾

Zygosaccharomyces salsus 0,2 0,¾

Villia anoraala 0,2 0,¾

Torulaspora delbrückii 0,2 0,¾

Rhodotorula lupra 0,2 0,¾

Mycotorula 0,2 0,¾

Debaryomycea kloecheri 0,2 0,¾

Pullularia pullulans 0,2 0,¾

Proteus 0X-19 20 ¾0

Bacillus subtilis >100 } 100

Staphylococcus aureus 209-P >100 > 100

Escherichia coli ,)100 y 100

Shigella sonnei />100 ]> 100 - 15 -

Bacillus mycoides > 100 )> 100

Mycobacterium cymote >1000 >1000

Mycobacterium Smegmatis ^1000 >1000

Mycobacterium H RV >1000 y 1000

Trichohyton asteroides 1000 y 1000

Trichohyton lupulam >1000 > 1000

Trichomonas vaginal!S >1000 >1000

Comme il résulte de ce qui précède, K 582 M - A et K 582 M - B font preuve d’une puissante activité antibiotique contre les micro-organismes du type Candida, et d’autres levures.

2. Caractéristiques de toxicité aiguë du K 582 M - A et du K 582 M - B.

Souris : LD : mg/kg

Kode d’adminis- _ --— _ - -,_.__________ .

tration

K 582 M - A K 582 M - B

O 120 - l44 24,1 - 34,8 intraveineux 3ç l44 - 1728 24,1 - 34,8 £ nlus de 300 43,2 - 57,2 intraperitoneal 0 7

Sj. plus de 300 43?2 - 57^2 'J' 320 ou dus 86 8 - io4 ' sous-cutané jji 320 ou plus 104 - 125 plus de 6000 2400 - 3000 oral —r- nliic do finnn ohnn — onnn - 16 - 3. Effets d’inhibition des tumeurs du K 582 M - A et du K 582 M - B.

(a) Effets d’inhibition des tumeurs sur des rats porteurs de tumeurs.

Aux animaux constitués de groupes de 10 rats chacun d'origine Donryu (femelles : 150-200 g) on a transplanté ΙΟ*'7 cellules AH 44 et AH 66 respectivement de cellules de cancer du foie ascitique dans la veine caudale, puis, après un intervalle de 72 heures, on a administré du K 582 M - A ou du K 582 M - B par la voie orale sous forme d’une dose continue de 30 mg/kg pendant 10 fois et, après 60 jours, on a déterminé le taux de survie des rats. Ainsi qu’il ressort du tableau qui suit, i ' | on peut reconnaître, pour chaque groupe de rats porteurs de tumeurs, de puissants effets d’inhibition des tumeurs, en comparaison des animaux du groupe témoin ne recevant que leur ration alimentaire.

; Taux de survie (%) | Groupe d’animaux^-”—-———________

! Tfeoins__K 582 M - A K 532 M - B

; AH 44 o 100 50

AfI 66 o 80 40 !' i » » »

: . I

- 17 - (b) Effets à’inhibition des tumeurs sur des souris porteuses de tumeurs.

A chacun des animaux de groupes constitués chacun de 10 souris d’origine dd (femelles : 20 g + 1,0 g)

C

on a transplanté 10° cellules du cancer avec ascite r c d’Ehrlich, 10° cellules de sarcome S-180 et 10 cellules SN 36 de leucémie avec ascite, respectivement, dans la cavité péritonéale des souris et après un intervalle de 24 heures, on a administré du K 582 M — A ou du K 582 M — B à la dose de 25 mg/kg/jour pendant 10 jours dans la cavité péritonéale de chacune des souris respectives. Les résultats de cette expérience dans les cas d’administration des produits conformes à l’invention revelent l’existence de puissants effets d’inhibition des tumeurs (taux de survie après 60 jours) ainsi que le révèle le tableau suivant, j tandis que dans le cas des témoins, tous les animaux étaient j morts après 20 jours.

I Taux de· survie des souris (%) ! Groupe de sourig^-_^^_ I '(Pallullî^^ Témoins K 582 M — A K 582 M — b

Cellules de

Sarcome S-180 O 90 90

Cellules du cancer d’Ehrlich avec ascite 0 70 g0

Cellules ce leucémie ascitique

• SL 30 O 80 fJQ

- 18 - 4. Autres effets biologiques.

(a) Effets contre le système d’immunité d’un corps vivant.

Les résultats de diverses expériences ont ' ' révélé que le K 582 M - A et le K 532 M - B exerçaient des effets sur l’immunité de corps vivants (tant humoraux que cellulaires). En particulier, il a été constaté que les substances conformes à l’invention exerçaient des effets accélérateurs et inhibiteurs sur le système d'immunité selon le procédé du titre en hémolysine par l'administration d'hématies de moutons et, par conséquent, on donne ci-dessous un exemple des effets précités du K 582 M - B.

Des groupes d'animaux constitués chacun de 5 à 10 souris femelles d’origine ddl ont reçu du K 582 H - B en une dose de 25 mg/kg, aussi bien qu'en une dose de 2,5 mg/kg par jour pendant 4 jours par la voie intrapéritonéale et on a transplanté 4 x 10 héma-; ties de moutons dans les veines caudales et on a poursuivi l’administration de K 582 M - B pendant 4 jours et, après l’achèvement de l’administration, on a mesuré les valeurs en anticorps du sang. Chez les animaux du groupe ayant reçu une administration de 25 mg/kg de K 582 M - B, on a constaté une valeur d'anticorps de 77 % chez les animaux du groupe témoin et chez les animaux du groupe ayant reçu 2,5 mg/kg de K 582 K - B, on a constaté une valeur en anticorps de 234 c/ô chez les animaux témoins et chez les -19- groupes à administration en concentration supérieure, on a constaté des tendances d’inhibition de l’immunité et chez les groupes à administration en concentration inférieure, on a constaté une tendance à l’accélération de l'immunité.

(h) Action des effets analogues à ceux d’inducteurs d’interféron.

La demanderesse a constaté que lorsque l’on administrait du K 582 M - A ou du K 582 H - B à un corps vivant, on induisait d’importantes unités d’interféron dans le sang. A titre d’exemple, les effets provoqués par le K 582 M - B seront indiqués ci-dessous.

A une souris d’origine dd, on a administré du K 582 M - B par la voie orale en une dose de 2,5 mg/kg et on a mesuré le titre en interféron du sang en fonction de l’écoulement du temps et après 25 heures, on a constaté une valeur maximale de 20 x 10^ U.I. Ceci révèle l’existence de puissants effets d’induction d’interféron de la substance en question. On constate également l’existence de tels effets chez d’autres animaux, comme la volaille domestique, le lapin, le chien, le porc, etc.

Dans le cas d’expériences d’infections virales grippales chez des souris, lorsque l’on administre 2 rag/kg de K 582 M - B par la voie orale à des souris, 12 ou 24 heures avant l'infection, on constate une prolongation de la vie de 30 à 40 - 20 -

Les caractéristiques du K 582 K - A et du K 582 M - B telles qu'indiquées ci-dessous, montrent clairement que ces substances sont de nouvelles substances obtenues par la demanderesse. Lorsque l'on utilise le K 582 M - A (sel avec l'acide sulfurique) ou le K 582 M -B , - (sel avec l'acide sulfurique), on obtient des résultats similaires.

La présente invention sera à présent davantage illustrée à l'aide des exemples illustratifs qui suivent sans cependant s'y limiter et il est bien évident que pour autant que les diverses propriétés des substances conformes à l’invention aient été clairement décrites, les spécialistes de la technique comprendront parfaitement que même si on ne les a pas pratiquement décrites dans le présent mémoire, certaines variantes ou modifications sont couvertes par la portée de l'invention.

EXEMPLE 1 (a) On a inoculé 200 ml d'un milieu de culture liquide (pH d'environ 6), dont la composition était 1 la suivante : 3,0 % de glucose, 1,0 % de polypeptone, 0,2 % de nitrate de sodium, 0,1 de phosphate dihydrogéné de potassium, 0,05 % de chlorure de potassium, 0,05 % de sulfate de magnésium, 0,01 % de sulfate ferreux, de Hetarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. var. anisopliae 5S2 M (Bikoken FERK-P N° 4217, ATCC N° 20500) et on a secoué le milieu de culture, cependant qu'on laissait la culture se poursuivre à 30°C pendant 14 à 20 jours.

- 21 - (b) On a répété le mode opératoire décrit à l’exemple 1 (a), sauf qu’au lieu de 1,0 ç/o de polypeptone, on a ajouté 0,1 % d’un amino-acide (glycine, asparagine, arginine, histidine, alanine et d’autres encore, ajoutés séparément).

: EXEMPLE 2

On a filtré 5 litres du filtrat du bouillon de culture obtenu à l’exemple 1, avec addition d’Hiflo-supercel.

Après l’ajustement de la valeur du pH à 6,0 - 7,0 on a fait passer le filtrat obtenu à travers une colonne de résine échangeuse d’ions IRC-50 (type mixte H+, Na+) possédant un diamètre interne de 20 mm et une hauteur de 500 mm, de manière à y adsorber les substances recherchées. On a lavé la colonne avec de l’eau, puis on a fait passer 500 ml d’acide chlorhydrique 1,0 N à travers cette colonne à un débit de 10 ml/minute de façon à éluer les substances recherchées. On a ajusté la valeur du pH de l'éluat à 6,0 et on l’a ensuite concentré sous pression réduite. On a laissé reposer le concentré jusqu’au lendemain à 35°C, sous addition de pentachlorophénol sodique, de façon à obtenir une précipitation de pentachlorophénate . du mélange de K 582 M - A et de K 582 M - B. On a lavé le pentachlorophénate du mélange de K 582 M - A et de K 582 M - B ainsi obtenu avec de l’eau, puis on l'a dissous dans de l’acétate de butyle et on a extrait la solution obtenue à deux reprises avec une solution diluée - 22 - d'acide chlorhydrique d'une valeur de pH de 2,0 à 3,0, de façon à obtenir une solution aqueuse du mélange de K 582 M - A et - B (sel du type chlorhydrate). On a lavé la solution aqueuse à plusieurs reprises avec de l'acétate de butyle et on a ajusté le pH de la couche aqueuse à 4,0 et on l'a ensuite concentrée sous pression réduite.

On a ajouté au résidu une quantité suffisante d'éthanol pour précipiter le mélange de K 582 M - A et - B (sel du type chlorhydrate). Ainsi, on a obtenu 5,0 g d'une poudre, brute du mélange de K 582 M - A et - B (sel du type chlorhydrate).

On a de nouveau dissous la poudre ainsi obtenue dans du méthanol et, par l'addition d'une quantité suffisante d'acétone et d'éthanol à la solution méthanolique, on a précipité le mélange de K 582 M - A et - B (sel du type chlorhydrate), que l'on a recueilli par filtration. On a dissous le mélange de K 582 H - A et - B (sel du type chlorhydrate) dans du méthanol et on l'a purifié en utilisant une colonne de Cephadex LH-20, de façon à obtenir 4,0 g du mélange de K 582 M — A et - B (sel du type chlorhydrate) sous la forme d'une poudre blanche.

! EXEMPLE 5

I On a dissous 1 g du mélange de K 582 M - A

et - B (sel du type chlorhydrate) obtenu par la mise en : oeuvre du procédé décrit à l'exemple 2, dans 5 ml d'eau ! et on a soumis la solution aqueuse formée à une chroma- j.

| . tographie en utilisant une colonne (diamètre interne de - 23 - 26 mm, hauteur de 1200 mm) de Biogel P-2 (100-200 mesh).

On a procédé à l’élution en utilisant une solution aqueuse de NaCl 0,1 M au débit de 30 ml/h et on a d*abord obtenu la fraction de K 582 M - A (sel du type chlorhydrate) et en second lieu la fraction de K 582 M - 3 (sel du type chlorhydrate). On a de nouveau traité les éluats A et B ainsi obtenus par chromatographie et on les a concentrés sous pression réduite. On a ajouté un mélange d’acétone et d’éthanol (4:1) au résidu obtenu à des fins de précipitation et après séchage des précipités obtenus, on les a extraits de manière répétée avec du inéthanol.

On a concentré la solution méthanolique sous pression réduite et on a précipité le résidu par l’addition d’un mélange d'acétone et d'éthanol (4:1) et on a séché le tout de manière à obtenir une poudre de K 582 M - A (sel du type chlorhydrate) ou de K 5S2 M - B (sel du type chlorhydrate). On a ensuite dissous chacune des poudres A et B obtenues dans une petite quantité de méthanol à 80 % et on a purifié la solution méthanolique par dessalage avec chromatographie en utilisant une colonne de Cephadex LH-20 (diamètre interne : 26 mm, hauteur : 1200 mm), puis on a concentré l’éluat obtenu sous pression réduite et on a précipité le résidu avec .un mélange d'acétone et d'éthanol (4:1). On a séché les précipités et on a ainsi obtenu 0,41 g de K 582 M - A (sel du type chlorhydrate; rendement de 41,0 50 et 0,35 g de K 582 M - B (sel du type chlorhydrate; rende- - 24 - EXEMPLE 4

On a dissous 1 g du mélange de K 582 K - A et - B (sel du type chlorhydrate) obtenu par le procédé décrit à l’exemple 2, dans 5 ml d’eau et on a soumis la solution aqueuse à une chromatographie en utilisant une colonne (diamètre interne : 20 mm, hauteur : 500 mm) de CM-Cephadex C-25 (100-200 mesh). On a réalisé la chromatographie d’abord avec un tampon à l’acide phosphorique 0,1 M (pH 6), puis avec une solution de chlorure de sodium 0,4 K .et ensuite avec une solution de chlorure de sodium 0,9 M, à titre de solvants d’élution. L’élution avec la solution de chlorure de sodium 0,9 M a d’abord donné le K 582 M - A (sel du type chlorhydrate) et ensuite le K 582 M - B (sel du type chlorhydrate). On a concentré chacun des éluats de K 582 M - A (sel du type chlorhydrate) et de K 582 M - B (sel du type chlorhydrate), on les a séchés, extraits à plusieurs reprises et on a ensuite concentré la fraction soluble dans le méthanol et on a précipité le résidu par l’addition d'un mélange d’acétone et d'éthanol (4:1) de façon à obtenir respectivement le K 582 M - A (sel du type chlorhydrate) et le K 582 M - B (sel du type chlorhydrate) sous la forme d'une poudre. On a dissous chacune des poudres A et B ainsi obtenues dans uns petite quantité d’une solution aqueuse à 80 % de méthanol et on a purifié la solution méthanolique par dessalage par chromatographie en utilisant une colonne de Cephadex LH-20. Après concentration - 25 - sous pression réduite, on a précipité l'éluat par l’addition d’un mélange d’acétone et d’éthanol (4:1) et on a séché les précipités de façon à obtenir 0,40 g de K 582 K - A (sel du type chlorhydrate) purifié (rendement de 40,0 %) et 0,43 g de K 582 K - B (sel du type chlorhydrate) purifié (rendement de 43,0 $0, respectivement .

EXEMPLE 5

On a filtré 5 litres du milieu de culture obtenu par mise en oeuvre du procédé décrit à l’exemple 1, sous addition de 100 g d'Hiflo-supercel. On a ajusté la valeur du pH du filtrat obtenu à 5,0 - 6,0, on a concentré le filtrat jusqu’à un volume de 1/10 - 1/20, on en a séparé les sels inorganiques, puis on a poursuivi la concentration jusqu'à siccité, puis on a procédé à plusieurs extractions avec 200 ml de méthanol. On a concentré les extraits réunis, concentré que l'on a extrait à plusieurs reprises avec du méthanol, en réduisant la quantité de méthanol et après une dernière extraction, on a complètement dissous les extraits dans une petite quantité d’eau et on a traité la solution aqueuse ainsi obtenue par chromatographie avec une colonne (diamètre interne de 50 mm, hauteur de 1000 mm) de Biogel P-2 (100-200 mesh). On a ensuite procédé à l’élution avec une solution de chlorure de sodium 0,1 K (débit 30 ml/h), de façon à obtenir d’abord la fraction de K 582 K - A (sel du type chlorhydrate) et ensuite la fraction de - 26 - chacun des éluats de ces fractions par dessalage réalisé confor Elément au mode opératoire décrit à l’exemple 3 (extraction au méthanol, addition d’un mélange d’acétone et d’éthanol, traitement par une colonne de Cephadex LH-20) « “ de façon à obtenir 1,4 g de K 582 M - A (sel du type chlorhydrate) séché et 1,2 g de K 582 M - B (sel du type chlorhydrate) séché, respectivement.

EXEMPLE 6

On a filtré 5 litres du milieu de culture obtenu par la'mise en oeuvre du procédé décrit à l’exemple 1, sous addition d'Hiflo-supercel. Après concentration sous pression réduite, on a débarrassé le filtrat par filcration de la substance séparée et on en a ajusté le pH à une valeur de 5,0 - 7,0 et on a ensuite procédé à un passage à travers une colonne (diamètre interne : 20 mm, hauteur : 1000 mm) de CK-Cephadex C-25 (100-200 mesh), afin d’adsorber les substances recherchées sur cette colonne. On a ensuite élue la colonne d’abord avec une solution tampon à l’acide phosphorique 0,1 M possédant un pH de 6,0 puis avec une solution de chlorure de sodium 0,4 K et ensuite avec une solution de chlorure de sodium 0,9 M. L’élution avec la solution à base de chlorure de sodium 0,9 K a d’abord élue le K 582 M - A (sel du type chlorhydrate) et ensuite le K 5S2 M - B (sel du type chlorhydrate). On a concentré ces éluats fractionnés contenant l’un le K 5S2 M - A (sel du type chlorhydrate) et l’autre le K 582 K - 3 - 27 - (sel du type chlorhydrate), respectivement, on les a séchés, dessalés par mise en oeuvre du procédé décrit à l’exemple 4 (extraction au méthanol, addition d’un mélange d’acétone et d’éthanol, traitement par une colonne de Cephadex LH-20) et on les a séchés de manière à ainsi obtenir 1,2 g de K 582 M - A (sel du type chlorhydrate) séché et 1,3 g de K 582 M - B (sel du type chlorhydrate) séché, respectivement.

EXEMPLE 7

On a dissous 2 g de K 582 M - A (chlorhydrate) selon le procédé décrit à l’exemple 3 ou à l’exemple 4, dans 5 ml d’eau distillée et on a appliqué la solution, ainsi obtenue à une colonne d'IRC-50 (4 x 25 cm). Après lavage de la colonne avec 400 ml d’eau distillée, on a élué le K 582 M - A (sulfate) avec de l’acide chlorhydrique 1N. On a ajouté de l’IRA-400 à l’éluat contenant le K 582 M - A (sulfate). Après réglage de la valeur du pH du mélange à 6,0 on a procédé à une filtration et à une concentration subséquente. On a additionné le concentré d’un mélange d’acétone et d’éthanol (4:1) et on a séparé les précipités formés par filtration.

On a soumis le K 582 K - A (sulfate) obtenu à une purification par dessalage, par l’utilisation d’une colonne de Cephadex LH-20 (2,2 x 80 cm). On a utilisé de l'eau distillée pour procéder à l’élution. On a obtenu 1,4 g de K 582 M - A (sulfate) par lyophilisation de l’éluat recueilli. Le snectre infrsrni^o rîn Tvr'nrîmt est donné - 28 - dans la figure 7· De manière similaire, on peut obtenir le K 582 M - B (sulfate) par un traitement réalisé d'une manière conforme à celle décrite ci-dessus.

EXEMPLE 8

Suite des amino-acides du K 582 M - A

Après avoir étudié la teneur en amino-acides du K 582 M - A, la demanderesse a constaté que ce produit était constitué d’arginine 1, de Ύ-hydroxyarginine 1, d’ornithine 2, de thréonine 1, de lysine 1 et de tyrosine 1 et que 1’amino-acide C-terminal était la tyrosine (procédé de décomposition d’hydrazine).

En utilisant la méthode d'élimination d'Edman, on a successivement analysé la suite d'amino-acides du K 582 M - A à partir du N-terminal. Pour ce faire, on a dissous 3 mg de K 582 M - A dans 0,5 ml d'eau et 1,0 ml de pyridine et on a réglé le pH de l'ensemble à 9,0 - 9,5 par l'addition de NaOH 1N. Après l'addition de 100 yul d'isothiocyanate de phényle et remplacement de l'atmosphère du ballon par de l'azote gazeux, on a maintenu le contenu du ballon à 40°C pendant 50 minutes. Après lavage à l'aide de benzène, on a lyophilisé le produit et on a remplacé l'atmosphère du ballon par de 1’azote-gazeux, on y a introduit 200yul d'acide trifluoracétique et on a maintenu le tout à 40°C pendant 15 minutes.

Après l'élimination de l'acide trifluoracétique, on a prélevé une fraction du résidu et on l'a hydrolysée à 1ΐη°π npnrinnt 22 heures, sous l'action d'acide chlorhvdri- - 29 - résultat, il se confirma une scission d'arginine du K 582 M - A, c'est-à-dire que l’amino-acide N-terminal était 1* arginine.

En répétant la méthode d’élimination d’Edman susmentionnée, on a analysé successivement la suite d'amino-acides à partir de l'amino-acide N-terminal jusqu'au troisième amino-acide dans le K 582 M - A et il se confirma que l’ordre était le suivant : arginine-γ-hydroxyarginine-ornithine.

Après chauffage à 55°C pendant 24 heures dans de l'acide trifluoracétique, suivi de l'élimination de l'acide trifluoracétique, on a soumis 50 mg de K 582 M - A à une électroforèse sur papier filtre sous pression élevée. En plus du K 582 M - A, on a reconnu deux substances positives à la ninhydrine, l'une de ces substances donnant une réaction de Sakaguchi positive. Lorsque l'on a filtré le produit de décomposition à l’acide trifluoracétique à travers gel à 1 ral/fraction avec une colonne de Sephadex LH-20 (calibre de la colonne : 18 x 840 mm; •1 solvant : méthanol à 80 %), on a élue le K 582 K - A et on a obtenu une substance positive à la ninhydrine et positive à la réaction de Sakaguchi, sous forme de mélange, dans les fractions n° 136-154.

On a également élue une substance positive à la ninhydrine et positive à la réaction de Sakaguchi, sous forme de substance unique dans les fractions 156-164.

» - 30 -

Après l’analyse de cette substance éluée dans les fractions n° 156-164, on a constaté qu'elle était constituée d’arginine 1 et de Y-hydroxyarginine 1.

Après concentration, on a provoqué 1’adsorbtion des fractions n° 136-154 sur une colonne de CK-cellulose équilibrée à l'aide d'acétate d'ammonium 0,01 K (calibre de la colonne : 17 x 160 mm) et on les a ensuite soumises à un gradient d’élution en utilisant une solution aqueuse de chlorure de sodium 2 M, à 1,5 ml/fraction, de façon à éluer une substance positive à la ninhydrine et négative à la réaction de Sakaguchi, dans les fractions n° 220-233* On a également élue le K 582 M - A dans les fractions n° 302-328. On a dessalé les fractions n° 220-230 avec du Sephadex LH-20 (méthanol à 80 %) et, après l’analyse des amino-acides, on a obtenu la composition d’amino-acides suivante : ornithine 2, thréonine 1, lysine 1 et tyrosine 1. Ensuite, le procédé de décomposition d'hydrazine a révélé que l’amino-acide C-terminal était la tyrosine.

On a utilisé les fractions n° 220-230 pour analyser la suite des amino-acides successifs à partir du N-terminal, c’est-à-dire que l’on a dissous 2 mg des fractions n° 220-233 dans 0,2 ml d’eau et 0,3 asl de pyridine et que l’on a ajusté la valeur du pH à 9,0 -9,5* On a ajouté 100 jal d'isothiocyanate de phényle et on a remplacé l’atmosphère du ballon par de l’azote gazeux et on a maintenu le contenu du ballon à 40°C

- 31 - pendant 90 minutes. Après lavage avec du benzène, on a procédé à une lyophilisation et on a remplacé l’atmosphère du ballon par de l’azote gazeux, on y a introduit 200 yul d’acide trifluoracétique et on a maintenu le contenu du ballon à 40°C pendant 15 minutes. Après l’élimination de l’acide trifluoracétique, on a prélevé une partie du résidu et on l’a hydrolysée à 110°C pendant 22 heures, sous l’action d’acide chlorhydrique ôN, afin d’analyser la teneur en amino-acides. Il a ainsi été confirmé que de l’ornithine se sépara des fractions n° 220-233, c’est-à-dire que 1’amino-acide H-terminal des fractions n° 220-233 était l’ornithine.

En utilisant la méthode d’élimination d’Edman susmentionnée, on a analysé la suite des amino-acides des fractions n° 220-233 en partant du N-terminal et il se confirma que la suite des amino-acides était la suivante : ornithine-thréonine-ornithine-lysine-tyrosine.

A partir des résultats susmentionnés, on a déterminé que la suite des amino-acides du K 582 M - A était la suivante : arginine-Y-hydroxyarginine-ornithine-thréonine-ornithine-lysins-tyrosine.

EXEMPLE 9

Suite des amino-acides du K 582 M - B

L’analyse des amino-acides du K 582 M - B a révélé que ces amino-acides constituants étaient l’arginine 1, la Y-hydroxyarginine 2, l’ornithine 2, la thréonine 1 et la tyrosine 1 et la décomposition à l’hydrazine - 32 - a indiqué que 1'amino-acide C-terminal était la tyrosine.

On a déterminé 1’amino-acide N-terminal du K 582 M - B par la mise en oeuvre de la méthode d’élimination d'Edman. Pour ce faire, on a dissous 1 mg de K 582 M - B dans 0,2 ml d’eau et 0,3 ml de pyridine et ! on a ajusté la valeur du pH à 9,0 - 9,5 par l’addition d’hydroxyde de sodium 1N. On a ensuite ajouté 100 ^il d’isothiocyanate de phényle et on a remplacé l’atmosphère du ballon par de l’azote gazeux et on a maintenu le contenu du ballon à A0°C pendant 90 minutes. Après lavage avec i ! du benzène, on a lyophilisé le contenu du ballon et on a j ! remplacé l’atmosphère du ballon par de l'azote gazeux, I , puis on y a introduit 200 jil d’acide trifluoracétique et | on a maintenu le contenu du ballon à AO°C pendant 15 mi- nutes. Après l'élimination de l'acide trifluoracétique, ! on a prélevé une fraction du résidu et on l'a hydrolysée i à 110°C pendant 22 heures, sous l'action d’acide chlor hydrique 6N, afin d’analyser les amino-acides. Il se confirma de cette manière que de l’arginine s'était | séparée du K 582 M - B, c'est-à-dire que 1'amino-acide ; K-terrninal était de l'arginine.

: On a chauffé 100 mg de K 582 K - B dans as l'acide trifluoracétique, à 40°C, pendant 9 heures.

j:

Après l'élimination de l'acide trifluoracétique, on a | soumis le tout à une filtration à travers gel en utilisant une colonne de Sephadex LH-20 (calibre de la colonne : j] 18 x 970 mm; solvant : eau), dans laauelle après coupe - 33 - de 105 ml d’éluat initial, on a recueilli des fractions au débit de 1,15 ml/fraction. On a ainsi élue un mélange dans les fractions n° 40-83 et un dipeptide constitué d’arginine et d'hydroxyarginine 1 à titre d1amino-acides constituants dans les fractions n° 84-92, comme aussi de tyrosine dans les fractions n° 114-134. Après concentration, on a adsorbé les fractions n° 40-83 sur une colonne de CM-cellulose (calibre de la colonne : 15 x 600 π équilibrée à l’aide d’acétate d'ammonium 0,01 M et on l'a ensuite traitée par un gradient d’élution à 1,0 ml/frac-tion, en utilisant du chlorure de sodium 1î·!. Dans les : fractions n° 191-204, on a élue un tétrapeptide dont l'analyse des amino-acides a révélé qu'il était constitué d'ornithine 2, de thréonine 1 et d'hydroxyarginine 1.

Conformément à la méthode d'élimination d'Edman, on a analysé les fractions n° 191—204 dans les mêmes conditions que celles décrites à propos du K 582 M - B, afin d’établir la suite des amino-acides successifs. On a ainsi déterminé que les fractions n° 191-204 étaient constituées d'un tétrapeptide dont la suite des amino-acides était la suivante : ornithine-thréonine-ornithine-y-hydroxyarginine.

Des résultats indiqués ci-dessus, on a finalement déterminé que la suite des amino-acides du K 5Ö2 M - B était la suivante : arginine-γ-hydroxy-arginine-omithine-tliréonine-ornithine-y-hydroxyarginine-tyrosine.

Claims

1. Antibiotique K 532 K du type peptide à chaîne droite, constitué d’arginine 1, de thréonine 1, de tyrosine 1, d’ornithine 2, d’hydroxyarginine m et de lysine n à titre d’amino-acides constituants.

2. K 582 M - A suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le m de 1’hydroxyarginine est égal à 1 et le n de la lysine est égal à 1.

3. K 532 M - B suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le m de 1’hydroxyarginine est égal à 2 et en ce que le n de la lysine est égal à 0.

4. Procédé de préparation de K 582 M (antibiotiques du type peptide à chaîne droite, constitués d’arginine 1, de thréonine 1, de tyrosine 1, d'ornithine 2, d’hydroxyarginine m et de lysine n à titre d’amino-acides constituants) par l’utilisation d'un micro-organisme producteur de K 582 M appartenant au genre Ketarhizium.

5. Procédé de préparation du K 582 M - A suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le m de l’hydroxyarginine est égal à 1 et le n de la lysine est égal à 1.

6. Frocédé de préparation de K 582 M - B * suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le m de 1’hydroxyarginine est égal à 2 et le n de la lysine est égal à 0.