CN102787148A

CN102787148A - 一种真菌发酵生产恩镰孢菌素类化合物的方法

Info

Publication number: CN102787148A
Application number: CN201210277943XA
Authority: CN
Inventors: 汪建平; 张勇慧
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2012-11-21

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体公开了一种固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物（Enniatins）的工艺。该方法以镰孢菌属（Fusarium）真菌为出发菌株，主要涉及发酵培养基的新配方、发酵条件控制及分离纯化工艺等步骤。通过本发明所述的方法，恩镰孢菌素类化合物在前期对数生长期内(10天)能迅速地获得目的产物，最终恩镰孢菌素类化合物的浓度可达2.0g／lkg培养基，具有极高的发酵效价；提取纯化工艺简单，质量可控，样品稳定好，通用性强，适合工业化生产。

Description

一种真菌发酵生产恩镰孢菌素类化合物的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体公开了一种固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的工艺。

背景技术

恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)是一类非典型的环肽化合物，结构颇为奇特，分子有3个D-2-羟基异戊酸(HylV)和3个N-甲基氨基酸交替地连接构成十八元环肽骨架，已报道的这类化合物大都是在Fasarium属真菌中找到，迄今为止人们发现了约10个这类化合物(其中EnniatinA，A1，B1，B比较常见，其它还有Enniatin B2、B3、B4、E、F、G等)。[参见：Tetrahedron 59(2003)：1015-1020]

恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)具有以下通式：

EnniatinA，A1，B1，B四种化合物中R1、R2、R3的取代基分别为：

Enniatins类化合物有很好的抗菌、杀虫、植物毒素活性和胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制作用，近几年这一类化合物的抗HIV和选择性抗肿瘤活性都得到了很多的关注。[参见：Toxicon 56(2010)：418-424]

关于enniatins类抗生素的作用机制，目前认为enniatins是一类离子传导剂，能形成一价离子的“Sandiwich”络合物，穿过细胞膜，尤其是线粒体膜，阻断呼吸链上的氧化磷酸化反应。P.Zavge等认为十八元环状的骨架与一价离子的络合物的亲和力是其支链骨架的100倍。它们的抗菌活性则是来源于这类物质对一价钾离子或钠离子的高度选择性络合。

1992年Tomoda等发现enniains有抑制脂酰辅酶A：胆固醇脂酰转移酶(Acyl-CoA：cholesterolacyltransferase ACAT)的活性，IC₅₀＝22～110μM。ACAT在生物体内催化胆固醇3位羟基，由长链脂酰CoA将酰基导入生成胆固醇酯，在胆固醇代谢过程中起着重要作用；因此ACAT被认为是降低胆固醇和防治动脉硬化药物的靶酶。1997年，MaKee等发现enniatins有抗HIV病毒的作用，体外试验显示enniains B，B1和A1混合物的anti-HIVEC₅₀＝0.01μg·mL^-1，IC₅₀＝1.9μg·mL^-1，其中enniain B的anti-HIV EC₅₀＝0.16μM，IC₅₀＝0.78μM。Enniain G是林永成等从海洋真菌Halosarpheia sp.培养液中分离到的一个新化合物，据初步的药理实验表明，新化合物enniain G具有抗肝癌Heps7402活性，ED₅₀＝12μg·mL^-1。Dometshuber R.等报道了enniains发挥p53依赖性抑制细胞生长，对人体的癌细胞和p53依赖的细胞毒活性[参见：Toxicon 56(2010)：418-424]。

目前国内外极少有关于enniatins生产的报道，仅有少量产品在实验室条件下获得，且主要是通过微生物菌种发酵产生，但是发酵水平普遍不高(0.1g/kg培养基)，而且没有提取纯化工艺方面的报道[参见：J Agric Food Chem 40(1992)：1976-1982]。因此提供一种新的制备enniatins的方法是非常必要的。

发明内容

本发明提供了一种利用镰孢菌属(Fusarium)真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的生产工艺。

本发明共涉及三方面的内容，即固体发酵培养、提取工艺和纯化工艺。

(1)固体发酵培养：

菌种：镰孢菌属产恩镰孢菌素类化合物的任何真菌；

培养基组成：0～5重量份的氨基酸或蛋白胨、100～2000重量份的水、1000重量份的豆类，PH值为4～8。

接种量：按质量百分比，将生长好的菌种按1％～20％的比例接种；

发酵培养条件：于16～32℃，光照培养或暗培养或明暗交替培养，培养周期为4～24天。

(2)提取工艺：采用1～30倍体积的有机溶剂提取，收集溶剂部分；回收溶剂后的干膏备用；将上述干膏溶散到体积比为20％～80％醇/水中，以0.5～20倍体积的正已烷萃取，收集正已烷部位，回收溶剂，干燥备用；

(3)纯化工艺：以适当的溶剂溶解上述提取物后，采用无机基质为填料的色谱柱，以合适的流动相冲柱，收集高纯度的恩镰孢菌素洗脱部分，干燥后即可得到高纯度的恩镰孢菌素类化合物干粉。

本发明的优点：只需豆类、氨基酸或蛋白胨等简单培养基，繁殖周期4～24天，最终恩镰孢菌素类化合物的浓度可达2.0g/kg培养基，比当前文献报道的产率提高了近20倍，因此，具有成本低，繁殖周期短，提纯工艺简单等优点[参见：JAgric Food Chem 40(1992)：1976-1982]。

附图说明

图1本发明所获得的恩镰孢菌素化合物的ESI-MS图谱(示EnniainA，A1，B1，B)；

图2本发明所获得Enniain B的¹H-NMR谱；

图3本发明所获得的Enniain B的¹³C-NMR谱；

图4本发明所获得的Enniain B的¹H-¹HCOSY谱；

图5本发明所获得的Enniain B1的¹H-NMR谱；

图6本发明所获得的Enniain B1的¹³C-NMR谱；

图7本发明所获得的Enniain B1的¹H-¹HCOSY谱；

图8本发明所获得的Enniatin A1的¹H-NMR谱；

图9本发明所获得的Enniatin A1的¹³C-NMR谱；

图10本发明所获得的Enniatin A1的1H-1HCOSY谱；

图11本发明所获得的Enniatin A的1H-NMR谱；

图12本发明所获得的Enniatin A的13C-NMR谱；

图13本发明所获得的Enniatin A的1H-1HCOSY谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的技术方案并不限于如下实施例。

实施例1镰孢菌属真菌三线镰刀菌(Fusarfumtricinctum)的纯化

三线镰刀菌(Fusarfumtricinctum)购自中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号：CCTCC AF 93240

菌种的纯化：采用划线平板法，将保藏的原始菌种斜面用接种针接种到新鲜PDA平板上，在28℃下培养5-7d，挑出与记载中菌株表观特征描述相符的单菌落，传入两支PDA斜面，一支用于发酵培养和样品初筛，另一支用于菌种的冷冻保藏。

菌株特征：在PDA培养基上，菌落乳白色，边缘整齐，两周后直径达到9cm，气生菌丝不发达，短绒状，菌丝浅色，分枝，偶有隔，光滑。分生孢子梗浅色，直立，无隔，偶瓶梗状，顶端锐，简单，侧生，少有分枝，分生孢子顶生。分生孢子大小两型，大分生孢子浅色，光滑，弯曲，3-4隔有时分隔不清，有足细胞，24-35.5×3.5-4.5μm，小分生孢子浅色，不成链，光滑，0-1隔，梨形或棍棒形，4.5-13.5×1.5-3μm。厚垣孢子浅色，球形，单生或成串，直径11.5-13.5μm。符合三线镰刀菌(Fusarfumtricinctum)的菌株特征与特性。

实施例2 250mL三角瓶的固体发酵

三线镰刀菌(Fusarfumtricinctum)接种于斜面培养基上，25℃下培养5天。接着，斜面菌种接种于含100g大豆培养基的250mL三角瓶中，静止避光，25℃下培养10天。

各种培养基配方如下：

斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨5，牛肉膏3，酵母膏1，pH7.0。大豆培养基：大豆(soybean)100g，加水100mL，静置4小时后，115℃灭菌30min。实施例330L固态发酵生产

以三线镰刀菌(Fusarfumtricinctum)为出发菌株，菌种来源及斜面培养方式同实施例1。

发酵参数：发酵培养基装量为白豆(white bean)10kg、水10L，发酵罐内直接通入蒸汽，辅助以特殊搅拌系统，达到在位高温灭菌的目的。接种量10％，搅拌均匀后，25℃发酵培养，罐压0.05MPa，通气量0.6～1.2vvm，发酵时间8天。

实施例4恩镰孢菌素类化合物的固态发酵生产

发酵参数：发酵培养基装量为白豆(white bean)10kg、水8L，发酵罐内直接通入蒸汽，辅助以特殊搅拌系统，达到在位高温灭菌的目的；待温度达25℃时，加入氨基酸适量，搅拌均匀后，按10％接入菌株，搅拌均匀，25℃发酵培养，罐压0.05MPa，通气量0.6～1.2vvm，发酵时间8天。

所说的氨基酸是：L-缬氨酸(L-valine)、L-亮氨酸(L-leucine)或/和L-异亮氨酸(L-isoleucine)，加入前以水溶解，并经0.2μm孔径的滤膜过滤。

实施例5恩镰孢菌素类化合物的提取纯化

以10倍体积的乙酸乙酯分2次振荡提取实施例1或实施例2的发酵物，减压回收后，将干膏以10倍体积的乙醇∶水＝1∶1溶解分散后，以20倍体积的正已烷分2次液-液萃取，合并正已烷萃取液，回收溶剂，即得灰白色粉末状粗提物(恩镰孢菌素类化合物粗品)。

将上述粗品，以甲醇按体积比1∶1溶解，过RP-18反相色谱柱，以甲醇/水冲柱洗脱，分段收集，真空干燥或冷冻干燥，获得类白色粉末(恩镰孢菌素类化合物干粉)。

实施例6恩镰孢菌素类化合物的纯化

取实施4之恩镰孢菌素类化合物粗品，以甲醇按体积比1∶1溶解，过半制备高效液相色谱柱，以70-80％甲醇/水冲柱洗脱，分段收集，真空干燥或冷冻干燥，获得类白色粉末(恩镰孢菌素类化合物干粉)。

所获得的恩镰孢菌素类化合物中，EnniatinB约占43％，EnniatinB1约为37％，EnniatinA1约占12％，EnniatinA约占7％(W/W)。

实施例7恩镰孢菌素类化合物(EnniatinA，A1，B1，B)的结构表征

应用质谱、一维和二维核磁谱等对本发明所获得的恩镰孢菌素类化合物的结构进行表征，并与文献报道的数据进行比对[参见：J Agric Food Chem 40(1992)：1976-1982]，确证本发明所获得的4个主要恩镰孢菌素类化合物为EnniatinA，A1，B1，B，本发明所获得的恩镰孢菌素化合物(EnniatinA，A1，B1，B)的质谱图见图1；本发明所获得的Enniatin B的¹H-NMR，¹³C-NMR，¹H-¹HCOSY谱见图2-4；本发明所获得的Enniatin B1的¹H-NMR，¹³C-NMR，¹H-¹HCOSY谱见图5-7；本发明所获得的EnniatinA1的¹H-NMR，¹³C-NMR，¹H-¹HCOSY谱见图8-10；本发明所获得的EnniatinA的¹H-NMR，¹³C-NMR，¹H-¹HCOSY谱见图11-13。

Claims

1.一种利用镰孢菌属（Fusarium）真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物（Enniatins）的方法，包括以下步骤：

步骤一：固体发酵培养

菌种：镰孢菌属产恩镰孢菌素类化合物的真菌（可以是从其寄主中分离纯化得到，也可以从菌种保藏中心等机构获得)；

培养基组成：0～5重量份的蛋白胨、500～1500重量份的水、1000重量份的大豆，PH值为5～8；

接种量：将生长好的菌种按质量百分比1%～20%的比例接种；

普通发酵培养条件：于16～32℃，光照培养或暗培养或明暗交替培养，培养周期为4～24天；

发酵罐中的条件：罐压0.05MPa，通气量0.6～1.2vvm，发酵时间5-10天；

步骤二：目标产物的分离纯化

发酵物的预处理：采用1～30倍体积的乙酸乙酯提取，收集溶剂部分；回收溶剂后得干膏；

分离工艺：将所得干膏溶散到体积比为20%～80%醇/水中，以0.5～20倍体积的正已烷萃取，收集正已烷部位，回收溶剂，经干燥得灰白色粉末状粗提物；

纯化工艺：以适当的溶剂溶解上述粗提物，采用无机基质为填料的色谱柱，以反相流动相冲柱，收集恩镰孢菌素洗脱部分，干燥后即得到恩镰孢菌素类化合物干粉。

2.根据权利要求1所述的利用镰孢菌属（Fusarium）真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物（Enniatins）的方法，其特征在于，培养基组成中的大豆可以是其它豆类或豆类的加工品，蛋白胨也可以替换为氨基酸。

3.如权利要求1所述的利用镰孢菌属（Fusarium）真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物（Enniatins）的方法，其特征在于，在分离工艺中，是将所得干膏溶散到醇/水（体积比1：1）中。

4.如权利要求1所述的利用镰孢菌属（Fusarium）真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物（Enniatins）的方法，其特征在于，所述的无机基质为填料的色谱柱是反相色谱柱。

5.根据权利要求1所述的利用镰孢菌属（Fusarium）真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物（Enniatins）的方法，其特征在于，所述的镰孢菌属产恩镰孢菌素类化合物的真菌是镰孢菌属真菌三线镰刀菌(Fusarfumtricinctum)。

6.根据权利要求5所述的利用镰孢菌属（Fusarium）真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物（Enniatins）的方法，其特征在于，所述的三线镰刀菌(Fusarfumtricinctum)购自中国典型培养物保藏中心，其菌株保藏编号为CCTCCAF 93240。