CN1312286C - 一种利用纤维堆囊菌高效生产埃博霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用纤维堆囊菌高效生产埃博霉素的方法。本发明通过对纤维堆囊菌的发酵培养基进行改良，并添加环式糊精或环式糊精的衍生物到发酵培养基中，使得发酵培养基更加适合菌体生长，埃博霉素的产量更高。

Description

一种利用纤维堆囊菌高效生产埃博霉素的方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体的说涉及一种埃博霉素的高效生产方法。

背景技术

粘细菌(Myxobacteria)是最高等的革兰氏阴性原核生物类群，具有复杂的多细胞行为，在细胞分化、发育和生物进化研究中占有重要地位。粘细菌可产生异常丰富的次级代谢产物，而且产物生物活性作用的多样性可以与著名的链霉菌类群相比拟，在微生物新药的开发研究中是极好的菌种资源。

纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)属于粘细菌的溶纤维素类群，它产生的大环类酯类化合物埃博霉素(epothilone)具有促微管聚合的活性，是目前引起医药界广泛关注的抗癌物质。Epothilone能与真核细胞中的微管骨架结合，导致染色体分离受阻，细胞核不能分裂，作用的有效浓度为10～20ng/ml。

Epothilone最早在纤维堆囊菌Sorangium cellulosum90菌株中发现。是由纤维素堆囊菌(Sorangium cellulosum)分泌的一类大环内酯类化合物，目前发现有两种天然衍生物，分别称为埃博霉素A(分子式C₂₆H₃₉NO₆S)与埃博霉素B(分子式为C₂₇H₃₉NO₆S)，分子结构如式(I)所示。它们的外观如无色的油，在乙酸乙酯中结晶形成粉末。

埃博霉素(Epothilones)有与紫杉醇(Taxol)相似的作用机制，对治疗癌症有较好的疗效。但Epothilones与紫杉醇相比有如下优点。

1.Epothilones的结构比紫杉醇更为简单，其离体抑制的效果比紫杉醇强2000～5000倍，并且带甲基的B的作用效果比A基本上大2倍。

2.Epothilones有更好的水溶性，且更易通过发酵来获得。

3.Epothilones不是P2糖蛋白的底物，对多药耐药细胞有很强的细胞毒性。因而埃博霉素的抗肿瘤性能不但要比紫杉醇的强得多，而且其抗肿瘤谱可能广得多。Epothilones有显著选择性的抗乳腺肿瘤细胞与结肠肿瘤细胞的活性。

4.施用紫杉醇会伴随一些临床的副作用(如中性白细胞减少症、外周神经病变、脱发与过敏反应)。

目前已有一些关于纤维堆囊菌株在发酵罐进行发酵合成Epothilones的实验的报道，以及关于影响Epothilones合成的营养控制的研究，但是现有Epothilones的生产方法普遍存在产量不稳定以及其产量偏低等问题。

为了达到Epothilones用于制药的目的，就必须得到足够量的含有Epothilones的发酵液混合物。至今为止，在粘细菌特别是其Soce90菌株中提取Epothiliones已经在文献中有所报道。为了能提取到相对高浓度的Epothilones，以前在即将提取的发酵培养基中经常加入以聚苯乙烯为材料的树脂，例如AmberliteXAD-1180。然而这种方法的缺点在于，在大规模的应用中会引发一系列的问题。发酵罐的阀门会被树脂小球损害；管道可能会堵塞并且仪器可能会由于机械摩擦力而导致更大的磨损。树脂是多孔渗水物质，因此会有较大的内表面积(大约825m2/g)，在高压灭菌的过程中，内部的空气就无法一起被灭菌。所以在实际大规模应用中，就不能用添加树脂的方法。但是，如果不添加树脂，在发酵培养基中又难以提取到较高浓度的Epothiliones。

目前为止，从粘细菌中获得Epothiliones并应用于工业技术生产领域而又没有上述缺点的方法，仍处于寻求阶段。

发明内容

本发明的目的在于针对现有埃博霉素生产方法存在的各种问题，提供一种利用纤维堆囊菌高效生产埃博霉素的方法。

纤维堆囊菌购于German Collection of Microorganisms and Cell Cukures(DSMZ.Braunschweig，Germany)，通过对其发酵培养基进行改良，并添加环式糊精或环式糊精的衍生物到发酵培养基中，使得发酵培养基更加适合菌体生长，Epothiliones的产量更高。由于环式糊精分子内存在疏水的空穴，而分子外亲水，这样不仅可以吸附产物同时不影响菌体的生长，还可以减弱产物抑制的现象。此外能将Epothiliones从发酵液中提取出来。

本发明利用纤维堆囊菌生产埃博霉素的方法，具体包括如下步骤：

(1)前培养：将已灭菌的培养基G52加入到摇瓶中，然后接入纤维堆囊菌到摇瓶中培养，培养时间为3～4天，培养条件为：120～250rpm，29～31℃；

所述培养基G52为：

干酵母粉          2g/L

MgSO₄             1g/L

CaCl₂             1g/L

脱脂奶粉          2g/L

马铃薯淀粉        8g/L

无水葡萄糖        2g/L

EDTA-Fe(III)-Na   1ml/L

调pH至7.4，120℃灭菌20分钟；

前培养的目的在于活化菌种，培育菌种。

(2)中间培养：将已灭菌的培养基G52加入到发酵槽中，然后接入前培养物到发酵槽中培养，培养时间为3～4天，培养条件为：29～31℃，200～300rpm，通风量为每升液体培养基每分钟0.5升空气，120～122℃，pH7.4；

中间培养的目的在于使菌种生长进入对数生长期，为接下来的发酵培养做好准备。

(3)发酵培养：在发酵罐中加入已灭菌的1B12改良培养基，接着加入已灭菌的环式糊精或其衍生物，然后将中间培养物接入发酵罐中培养，培养时间为6～7天，培养条件为：20～35℃，120～250rpm，即可得到含有埃博霉素的发酵液；环式糊精及其衍生物的添加是以其水溶液形式添加的，糊精及其衍生物添加的量为：1克糊精或其衍生物/每100ml发酵液。添加的糊精或其衍生物溶液体积为整个发酵液体积的10％。发酵液的体积包括培养基体积、糊精溶液体积和中间培养物体积。

所述1B12改良培养基为：

马铃薯淀粉         20g/L

胰蛋白胨           11g/L

MnCl₄              1mg/L

K₂HPO₄             0.06g/L

ZnCl₃              1mg/L

CuSO₄              1mg/L

EDTA-Fe(III)-Na    8mg/L

调pH至7.8，120℃灭菌20分钟。

上述步骤(3)所述发酵培养在发酵的第三天加入添加4mg/L氨基酸和4mg/L生长因子。最佳的氨基酸是丙氨酸，最佳的生长因子是乙酸钾。

上述步骤(1)所述前培养的最佳培养条件是：180rpm，30℃，摇瓶位移50mm。

上述步骤(2)所述中间培养的最佳培养条件是：30℃，250rpm，通风量为每升液体培养基每分钟0.5升空气，121℃，pH7.4。

上述步骤(3)所述发酵培养的最佳培养条件是：25℃，180rpm，pH7.8。

上述生产埃博霉素的方法，还包括埃博霉素的分离纯化，其方法为①发酵液经离心、过滤，得到的滤液与树脂按体积比65∶1，搅拌混合，离心，得到的树脂先用去离子水洗涤，然后用异丙醇洗涤，得到的洗涤液中加入水，萃取其中的异丙醇，剩下的水相中再用乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯萃取物在真空旋转蒸发器中浓缩、干燥，即可得粗结晶。将所得粗结晶加入异丙醇中，振荡，过滤，然后在真空干燥器中干燥，得到epothilones B白色晶体；对所得白色晶体进一步通过反相色谱柱RP-18柱纯化，乙腈作为洗脱液，最后用乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3的混合液来结晶，即可得到epothilone A。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

1.本发明在发酵液中添加了环式糊精，由于环式糊精分子内存在疏水的空穴，而分子外亲水，这样不仅可以吸附产物同时不影响菌体的生长，还可以减弱产物抑制的现象。

2.本发明改良了Epothilone的发酵培养基的成分，并且对发酵条件液进行了改良，使其更适合Epothilone的产生，提高了产量。

3.本发明在发酵完毕进行提取时才加入树脂XAD-16吸附产物，有效的得到了较高浓度的Epothilone。

具体实施方式

一般种子液的接种量为10％(V/V)，发酵液的接种量为20％(V/V)。需要注意的是，发酵培养基的组成是按最终体积来计算的。比如20L的培养物就包括：18L的1B12改良培养基+2L的G52种子液，也就是说20L的发酵液只含有18L的发酵培养基。

实施例

1、菌种的活化：从-80℃冰箱中取出纤维堆囊菌DSM11999，首先将菌种置于冰水中使之缓慢升温溶化，取1ml转入10ml的G52培养基中(置50ml摇瓶)培养3天，180rpm，30℃，摇瓶位移25mm。然后取5ml此G52培养物转入45ml的G52培养基中(置200ml摇瓶)培养3天，180rpm，30℃，摇瓶位移25mm。再取50ml的G52培养物转入450ml的G52培养基中(置2L摇瓶)培养3天，180rpm，30℃，摇瓶位移50mm。培养基G52为：干酵母粉2g/L，MgSO₄1g/L，CaCl₂1g/L，脱脂奶粉2g/L，马铃薯淀粉8g/L，无水葡萄糖2g/L，EDTA-Fe(III)-Nalml/L，调pH至7.4，120℃灭菌20分钟；

2、维持培养：取50ml的上述培养物加入到450ml的G52培养基中(在2升的摇瓶中)培养。

3、摇瓶中前培养：1×450ml的G52培养基(置于2升摇瓶中)接入50ml的维持培养物，培养4天，180rpm，30℃，pH7.4，摇瓶位移50mm。目的在于活化菌种，培育菌种。

4、中间培养：90升的G52培养基置于150升的发酵槽中，接入10升的前培养物，培养4天，培养条件为：30℃，250rpm，通风量为每升液体培养基每分钟0.5升空气，121℃，pH7.4。目的在于使菌种达到对数生长期，为接下来的发酵培育做好准备。

5、发酵培养：发酵在750L的发酵罐中进行，加入350升灭菌的1B12改良培养基和50升灭菌的2-羟丙基-β-环式糊精溶液(含2-羟丙基-β-环式糊精5000g)，然后接入100升的中间培养物。此培养持续6天，培养条件为：25℃，180rpm，pH7.8。在发酵的第三天加入4mg/L丙氨酸和4mg/L乙酸钾。1B12改良培养基为：马铃薯淀粉20g/L，胰蛋白胨11g/L，MnCl₄1mg/L，K₂HPO₄0.06/L，ZnCl₂1mg/L，CuSO₄1mg/L，EDTA-Fe(III)-Na8mg/L，调pH至7.8，120℃灭菌20分钟。

6、产物的分离纯化：①500升的发酵物经离心、过滤，得到的发酵液与树脂按体积比65∶1，搅拌2h，产物从环式糊精中转移到树脂中，离心，得到的树脂先用12升的去离子水洗涤解吸附，然后用异丙醇洗涤2次，使产物转移到有机相，每次用30升的异丙醇搅拌30min，得到的洗涤液中加入水，萃取其中的异丙醇，剩下的水相中再用乙酸乙酯萃取3次，得到的乙酸乙酯萃取物在真空旋转蒸发器中浓缩、干燥，即可得粗结晶。

②以上获得的粗结晶悬浮于1ml异丙醇中，于25℃振荡24小时，过滤之后，在真空干燥器中干燥，得到epothilones B的白色晶体。epothilone B中还含有少量的epothilone A，可以进一步通过反相色谱柱RP-18柱来纯化，乙腈作为洗脱液。最后，用乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3的混合液来结晶，即可得到epothiloneA。

对比例

同样采用纤维堆囊菌DSM11999，按照实施例的生产方法生产epothilones。不同之处有三点：一、不使用1B12改良培养基，改为使用1B12培养基；二、不添加糊精；三、不添加丙氨酸和乙酸钾。

对实施例和对比例的产物进行分析：

每个摇瓶中添加2％(V/V)XAD-16树脂，180rpm摇2h。使树脂充分吸附培养物中的产物。然后用150um的尼龙筛过滤，过滤后的树脂用少许水洗涤，水是极性溶剂，用水洗涤可以解吸附树脂中的产物，洗涤液装入容器。

再用60ml异丙醇(＞99％)洗涤树脂，滤液装入密封管中，于室温下在Rota-Mixer(Labinco BV，Netherlands)上摇3min，然后取2ml液体，离心，取上清液用于HPLC。

HPLC结果：将实施例所得到的粗晶体溶于1ml异丙醇，浓缩，采用HPLC分析可知epothilones产量为16.2mg/L；将对比例所得到的粗晶体溶于1ml异丙醇，浓缩，采用HPLC分析可知epothilones产量为11mg/L。可见，采用本发明的生产方法所得到的epothilones产量比采用原有方法的产量提高了47.3％。

Claims (8)

1、一种生产埃博霉素的方法，是利用纤维堆囊菌发酵生产，其特征是通过改良纤维堆囊菌的发酵培养基，包括如下步骤：

(1)前培养：将已灭菌的培养基G52加入到摇瓶中，然后接入纤维堆囊菌到摇瓶中培养，培养时间为3～4天，培养条件为：120～250rpm，29～31℃；所述培养基G52为：

干酵母粉           2g/L

MgSO₄             1g/L

CaCl₂             1g/L

脱脂奶粉           2g/L

马铃薯淀粉         8g/L

无水葡萄糖         2g/L

EDTA-Fe(III)-Na    1ml/L

调pH至7.4，120℃灭菌20分钟；

(2)中间培养：将已灭菌的培养基G52加入到发酵槽中，然后接入前培养物到发酵槽中培养，培养时间为3～4天，培养条件为：29～31℃，200～300rpm，通风量为每升液体培养基每分钟0.5升空气，120～122℃，pH7.4；

(3)发酵培养：在发酵罐中加入已灭菌的1B12改良培养基，接着加入已灭菌的环式糊精或其衍生物，然后将中间培养物接入发酵罐中培养，培养时间为6～7天，培养条件为：20～35℃，120～250rpm，即可得到含有埃博霉素的发酵液：

所述1B12改良培养基为：

马铃薯淀粉        20g/L

胰蛋白胨          11g/L

MnCl₁             1mg/L

K₂HPO₁            0.06g/L

ZnCl₂             1mg/L

CuSO₁             1mg/L

EDTA-Fe(III)-Na       8mg/L

调pH至7.8，120℃灭菌20分钟。

2、如权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于还包括添加环式糊精到发酵培养基中。

3、如权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于步骤(3)所述发酵培养在发酵的第三天加入添加4mg/L氨基酸和4mg/L生长因子。

4、如权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于步骤(1)所述前培养的培养条件是：180rpm，30℃。

5、如权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于步骤(2)所述中间培养的培养条件是：30℃，250rpm，通风量为每升液体培养基每分钟0.5升空气，121℃，pH7.4。

6、如权利要求1所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于步骤(3)所述发酵培养的培养条件是：25℃，180rpm，pH7.8。

7、如权利要求1～6任一项所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于还包括埃博霉素的分离纯化，其方法为①发酵液经离心、过滤，得到的滤液与树脂按体积比65∶1，搅拌混合，离心，得到的树脂先用去离子水洗涤，然后用异丙醇洗涤，得到的洗涤液中加入水，萃取其中的异丙醇，剩下的水相中再用乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯萃取物在真空旋转蒸发器中浓缩、干燥，即可得粗结晶。

8、如权利要求7所述的生产埃博霉素的方法，其特征在于所述分离纯化方法还包括如下步骤：将所得粗结晶加入异丙醇中，振荡，过滤，然后在真空干燥器中干燥，得到epothilones B白色晶体：对所得白色晶体进一步通过反相色谱柱RP-18柱纯化，乙腈作为洗脱液，最后用乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3的混合液来结晶，即可得到epothilone A。