CN102093378A - 一种从吸附树脂上高效解吸附埃博霉素的方法 - Google Patents

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赵林
刘新利
李亚伟
代继林
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Abstract

本发明涉及一种从吸附树脂上高效解吸附埃博霉素的方法，属于生物分离技术领域。该方法通过石油醚和四氯化碳对吸附了纤维堆囊菌埃博霉素发酵产物的树脂上解吸附埃博霉素。本方法解吸附埃博霉素的得率比用甲醇萃取的方法提高了121％，埃博霉素粗提液的HPLC纯度达到81.0％，比用甲醇萃取方法获得的纯度提高了21.5倍，可以大幅减少杂质对后续分离工艺造成的影响，简化分离工艺，降低操作成本，节约了时间。

Description

一种从吸附树脂上高效解吸附埃博霉素的方法
技术领域
本发明涉及一种从吸附树脂上高效解吸附埃博霉素的方法，该树脂上的埃博霉素是从纤维堆囊菌发酵液中吸附的，本发明属于生物分离技术领域。
背景技术
埃博霉素(epothilone)是一类由粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)合成的大环内酯类化合物，具有促微管聚合活性，其作用机制类似于紫杉醇
Figure BSA00000393097100011
。目前已经发现了多种埃博霉素结构类似物，埃博霉素已经成为了目前生物医药领域令人兴奋的研究热点之一。
Figure BSA00000393097100012
图1.埃博霉素A与紫杉醇的分子结构图
目前已经有多种埃博霉素类化合物进入不同阶段的临床评估，如BMS-247550、BMS310705、KOS-862以及ZK-EPO等，他们为纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)的发酵产物或者发酵产物的化学衍生物。其中美施贵宝公司生产的BMS-247550(ixabepilone，伊沙匹隆)注射剂，是埃博霉素B的大环内酰胺结构类似物，已经于2007年10月份经美国食品药品监督管理局批准上市销售。
图2.已经上市的Ixabepilone(BMS-247550)
鉴于其简单的化学结构和很好的抗肿瘤疗效，埃博霉素一经发现就成为生物有机化学家们关注的热点，目前已经有数十条全合成路线相继报道，且较为详尽的结构与活性关系也已经被推导，埃博霉素全合成工作也于上世纪末在我国开展，但是由于埃博霉素的结构相对仍较为复杂，化学全合成步骤冗长，产率非常低，不具备工业化生产的前景。因此国际上埃博霉素的生产还主要依赖微生物发酵法。
埃博霉素A和B是埃博霉素发酵生产的最主要产物，目前埃博霉素的提取主要是将吸附树脂加入发酵液中对埃博霉素加以吸附，获得吸附树脂后，使用甲醇或丙酮萃取发酵树脂将埃博霉素解吸附下来，然后进一步结合分子筛凝胶法、高效液相色谱法精制以获得产品。目前国内针对埃博霉素A和B的提取研究还处于起步阶段，相关报道极少，使用的萃取剂为甲醇或异丙醇。目前报道的方法使用甲醇、丙酮或异丙醇萃取，由于甲醇、丙酮以及异丙醇极高的溶解特性，在萃取埃博霉素的同时也将发酵树脂吸附的发酵液中大量杂质共同萃取出来，给后续的分离工作造成严重的影响。
发明内容
本发明针对目前使用的甲醇萃取发酵树脂技术的不足，提供了一种从吸附树脂上高效解吸附埃博霉素的方法。
本发明的技术方案如下：
本发明中所使用吸附树脂是吸附了纤维堆囊菌So0157-2发酵产物的树脂，从发酵液中经过滤干燥获得，经检测每公斤树脂中埃博霉素含量约4g。该生产菌株为山东大学李越中教授提供，目前保存于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 208078。
(1)接种纤维堆囊菌So0157-2至液体M26培养基中培养3-5天制成种子培养液，再将种子培养液按照1％接种量接种至含有0.5-2.5％ XAD-16树脂的液体发酵培养基中，30℃-32℃，培养5-8天后使用100-200目滤网过滤收集发酵树脂，干燥后即为本发明所使用的材料(图1)。
上述步骤(1)中所使用的M26种子培养基组分如下：马铃薯淀粉8g，蛋白胨2g，酵母浸粉2g，葡萄糖2g，Mg2SO4 1g，CaCl2 1g，FeCl3溶液1mL，水1L，pH 7.5，121℃30min灭菌处理。
步骤(1)中所使用的树脂为Amberlite公司生产的XAD-16大孔吸附树脂；
步骤(1)中所使用的滤网为100-200目的金属滤网。
(2)称取一定量的步骤(1)中制备的发酵树脂置于三角瓶中，加入一定量的石油醚后置于磁力搅拌器上，树脂和石油醚的比例为1∶1-3(M/V)，100-300rpm搅拌萃取1-3小时，过滤收集树脂，重新置于三角瓶中重复上述石油醚洗涤操作2-4次，过滤收集发酵树脂。
步骤(2)中树脂称取的量可以根据制备规模来确定，如实验室规模可以为10～100g，工业生产规模可以为10kg以上；
步骤(2)中所使用的石油醚为分析纯，沸程为60-90的石油醚溶剂；
步骤(2)中所使用的滤纸为快速定性分析滤纸，工业规模可以使用滤布或滤膜；
(3)将经过(1)中经过石油醚洗涤的树脂晾干后置于三角瓶中，加入四氯化碳，树脂和四氯化碳的比例为1∶1-4(M/V)，置于磁力搅拌器上100-300rpm萃取0.5-4小时，过滤后上清转入其他容器中，收集树脂后重复上述四氯化碳解吸附操作1-5次。将过滤所得上清液合并后采用真空浓缩蒸干。
步骤(3)中所使用的四氯化碳为分析纯级别以上的四氯化碳溶剂；
步骤(3)中所使用的真空浓缩干燥条件为：温度：40-60℃，真空度＜0.1大气压；
(4)将蒸干后的产物采用适当的有机溶剂溶解后即得埃博霉素的粗提液。
步骤(4)中的溶解埃博霉素粗提物的有机溶剂可以是甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯之一。
本发明有益效果如下：
本发明所述的从吸附树脂上高效解吸附埃博霉素方法与目前国际上采用的甲醇萃取法相比，提取率提高了121％，制备的埃博霉素粗提液较甲醇粗提液纯度由3.76％提高到81.0％，提高了21.5倍。这种杂质含量大幅减少的粗提液可以大大简化后续的精细分离工艺流程，提高生产效率，降低生产成本。
附图说明
图1吸附了纤维堆囊菌发酵产物的树脂；
图2采用甲醇萃取树脂所得萃取液的HPLC谱图；
图3采用四氯化碳解吸附树脂所得埃博霉素的HPLC谱图；
图4实施例制得埃博霉素A和B的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所用原料均可市场购得，实施例中所用质谱谱仪，高效液相色谱为为实验室常规仪器，高效液相色谱仪检测条件为流动相：甲醇∶水＝13∶7，流速0.8mL/min，检测波长249nm，进样量10μL。
实施例1
(1)接种纤维堆囊菌So0157-2至液体M26培养基中培养4天制成种子培养液，再将种子培养液按照1％接种量接种至含有2％ Amberlite XAD-16树脂的液体发酵培养基中，30℃，培养7天后使用200目滤网过滤收集树脂，干燥。
上述步骤(1)中所使用的M26种子培养基组分如下：马铃薯淀粉8g，蛋白胨2g，酵母浸粉2g，葡萄糖2g，Mg2SO4 1g，CaCl2 1g，FeCl3溶液1mL，水1L，pH 7.5，121℃ 30min灭菌处理。
(2)称取一定量的步骤(1)中制备的发酵树脂置于三角瓶中，加入一定量的分析纯石油醚(沸程为60-90)后置于磁力搅拌器上，树脂和石油醚的比例为1∶1(M/V)，100rpm搅拌萃取1小时，快速定性分析滤纸过滤收集树脂，重新置于三角瓶中重复上述石油醚洗涤操作2次，过滤收集发酵树脂。
(3)将经过(1)中经过石油醚洗涤的树脂晾干后置于三角瓶中，加入四氯化碳，树脂和四氯化碳的比例为1∶2(M/V)，置于磁力搅拌器上100rpm萃取0.5小时，过滤后上清转入其他容器中，收集树脂后重复上述四氯化碳解吸附操作1次。将过滤所得上清液合并后采用真空浓缩蒸干。
步骤(3)中所使用的四氯化碳为分析纯级别以上的四氯化碳溶剂；
步骤(3)中所使用的真空浓缩干燥条件为：温度：40℃，真空度＜0.1大气压；
(4)将蒸干后的产物采用甲醇溶解后即得埃博霉素的粗提液。
经HPLC对上述粗提液检测，与目前普遍采用的甲醇萃取相比，萃取率提高了119％，萃取液纯度提高了20.25倍。
实施例2
(1)接种纤维堆囊菌So0157-2至液体M26培养基中培养4天制成种子培养液，再将种子培养液按照1％接种量接种至含有2％ Amberlite XAD-16树脂的液体发酵培养基中，30℃，培养7天后使用200目滤网过滤收集树脂，干燥。
上述步骤(1)中所使用的M26种子培养基组分如下：马铃薯淀粉8g，蛋白胨2g，酵母浸粉2g，葡萄糖2g，Mg2SO4 1g，CaCl2 1g，FeCl3溶液1mL，水1L，pH 7.5，121℃ 30min灭菌处理。
(2)称取一定量的步骤(1)中制备的发酵树脂置于三角瓶中，加入一定量的分析纯石油醚(沸程为60-90)后置于磁力搅拌器上，树脂和石油醚的比例为1∶2(M/V)，150rpm搅拌萃取2小时，用滤布过滤收集树脂，重新置于三角瓶中重复上述石油醚洗涤操作3次，过滤收集发酵树脂。
(3)将经过(1)中经过石油醚洗涤的树脂晾干后置于三角瓶中，加入四氯化碳，树脂和四氯化碳的比例为1∶3(M/V)，置于磁力搅拌器上150rpm萃取2小时，过滤后上清转入其他容器中，收集树脂后重复上述四氯化碳解吸附操作3次。将过滤所得上清液合并后采用真空浓缩蒸干。
步骤(3)中所使用的四氯化碳为分析纯级别以上的四氯化碳溶剂；
步骤(3)中所使用的真空浓缩干燥条件为：温度：50℃，真空度＜0.1大气压；
(4)将蒸干后的产物采用甲醇溶解后即得埃博霉素的粗提液。
经HPLC对上述粗提液检测，与目前普遍采用的甲醇萃取相比，萃取率提高了120％，萃取液纯度提高了21.40倍。
实施例3
(1)接种纤维堆囊菌So0157-2至液体M26培养基中培养4天制成种子培养液，再将种子培养液按照1％接种量接种至含有2％ Amberlite XAD-16树脂的液体发酵培养基中，30℃，培养7天后使用200目滤网过滤收集树脂，干燥。
上述步骤(1)中所使用的M26种子培养基组分如下：马铃薯淀粉8g，蛋白胨2g，酵母浸粉2g，葡萄糖2g，Mg2SO4 1g，CaCl2 1g，FeCl3溶液1mL，水1L，pH 7.5，121℃ 30min灭菌处理。
(2)称取一定量的步骤(1)中制备的发酵树脂置于三角瓶中，加入一定量的分析纯石油醚(沸程为60-90)后置于磁力搅拌器上，树脂和石油醚的比例为1∶3(M/V)，200rpm搅拌萃取3小时，快速定性分析滤纸过滤收集树脂，重新置于三角瓶中重复上述石油醚洗涤操作3次，过滤收集发酵树脂。
(3)将经过(1)中经过石油醚洗涤的树脂晾干后置于三角瓶中，加入分析纯四氯化碳，树脂和四氯化碳的比例为1∶4(M/V)，置于磁力搅拌器上200rpm萃取4小时，过滤后上清转入其他容器中，收集树脂后重复上述四氯化碳解吸附操作4次。将过滤所得上清液合并后采用温度：60℃，真空度＜0.1大气压下真空浓缩蒸干。
(4)将蒸干后的产物采用甲醇溶解后即得埃博霉素的粗提液。
经HPLC对上述粗提液检测，与目前普遍采用的甲醇萃取相比，萃取率提高了121％，萃取液纯度提高了21.50倍。

Claims (3)

1.一种从吸附树脂上高效解吸附埃博霉素的方法，其特征在于吸附树脂是吸附了纤维堆囊菌发酵埃博霉素产物的吸附树脂，该树脂从发酵液中经过滤干燥获得。
2.如权利要求1所述的高效解吸附的方法，其特征在于首先用石油醚(分析纯、沸程为60-90℃)洗涤树脂，具体方法是树脂和石油醚以比例为1∶1-3(M/V)混合，100-300rpm搅拌萃取1-3小时，过滤收集树脂，重复石油醚洗涤操作2-4次，过滤收集发酵树脂。
3.如权利要求1所述的高效解吸附的方法，其特征在于用分析纯四氯化碳解吸附埃博霉素，树脂和四氯化碳的比例为1∶1-4(M/V)，置于磁力搅拌器上100-300rpm萃取0.5-4小时，重复四氯化碳解吸附操作1-5次。将每次过滤所得上清液合并后采用真空浓缩蒸干，真空浓缩干燥条件为：温度：40-60℃，真空度＜0.1大气压。
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