CN103667387B

CN103667387B - 一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素b的方法

Info

Publication number: CN103667387B
Application number: CN201310637264.3A
Authority: CN
Inventors: 龚国利; 赵婷峰; 李慧
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: CN103667387A

Abstract

本发明提供了一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法，属于微生物发酵制药领域。采用的技术方案为：纤维堆囊菌菌株由摇瓶培养后逐级放大，发酵纤维堆囊菌，再经大孔树脂吸附、乙酸乙酯解析、甲醇复溶，得粗品；粗品经柱层析、HPLC分析得到埃博霉素B的初步组分，再加入分子印迹聚合物特异性吸附埃博霉素B，最后经甲醇洗脱、结晶，得到埃博霉素B。本发明通过逐级发酵生产纤维堆囊菌，同时在分离提取过程中采用具备特异性靶向吸附能力的分子印迹聚合物，不仅对埃博霉素B具有很强的吸附力，而且可以很容易地将埃博霉素B萃取出来，从而降低了分离提取埃博霉素药物的生产成本，具有更广阔的工业化应用前景和经济效益。

Description

一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵制药领域，涉及一种埃博霉素B的提取方法，具体涉及一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法。

背景技术

埃博霉素(epothilone)是一类大环内酯类化合物，具有多种生物活性，可以作为抗生素药物，由德国国家生物技术中心(GBF)的G.等人于1993年首次报道。从粘细菌亚目的纤维堆囊菌菌株发酵液中可以分离埃博霉素，其主要组分为Epothilone A和B。

不久以后，Merck实验室在对7000种天然提取产物筛选紫杉醇类似物实验中，再次发现了埃博霉素。并且发现它具有与紫杉醇相同的作用机制，可以促进GTP(三磷酸鸟苷)依赖性微管蛋白聚合形成微管，并且对微管有稳定作用。微管是B一微管蛋白异二聚物的聚合物，需要解聚以形成有丝分裂纺锤体，而埃博霉素则是通过稳定微管组装过程抑制其解聚，抑制有丝分裂，从而抑制肿瘤细胞的生长，甚至诱导其死亡。证明了埃博霉素对肿瘤细胞有抑制作用的这个事实。

进一步研究发现，埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性，主要体现在以下四个方面：①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化；②埃搏霉素没有紫杉醇细胞内毒素活性；③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒性；④在Richard等研究的紫杉醇敏感的人类细胞系中，埃博霉素B比埃博霉素A和紫杉醇具有更大的抗增殖活性，而埃博霉素A往往比紫杉醇的活性更低。另外，埃博霉素对一株多药耐药性直肠癌系和紫杉醇抗性卵巢癌系仍然具有敏感性。

然而，有关纤维堆囊菌的发酵条件及活性物质合成条件的研究报道很少，这一方面反映了纤维堆囊菌研究的困难；另一方面也是全球研究粘细菌生物活性物质合成的实验室太少的缘故。研究粘细菌，尤其是纤维堆囊菌的生长和次级代谢的条件对于开发粘细菌资源具有重要的意义。

目前通过发酵法制备埃博霉素B的方法成本高，培养所产生的活性物质中埃博霉素B产率低，生产波动性大，最高只占22%，有的甚至只有痕迹量。并且对于从发酵液中分离提纯埃博霉素B，目前一直采用哥特（Gerth）等人的方法。该方法包括树脂吸附，硅胶柱梯度分离，分子筛层析和高效液相色谱分离四步，其存在着一定的缺陷，步骤过于繁琐，使得操作的效率较低而过程费用较高，产物的得率较低。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法，该方法操作简单，环境友好，成本低，采用该方法制得的埃博霉素B收率高、纯度高。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

1）将纤维堆囊菌菌株摇瓶培养72-96h，将得到的摇瓶菌种液接种至一级种子罐中一级放大培养72-96h，将得到的一级菌种液接种至二级种子罐中二级放大培养72-96h，将得到的二级菌种液转入发酵罐中三级放大发酵培养12-96h后，得到发酵液；

2）向发酵液中加入发酵液总体积1%～5%的大孔吸附树脂，调节pH值至7.0～7.4后，继续培养100-150h后，停止发酵；

3）收集步骤2）发酵结束后的液体中的大孔吸附树脂，用大孔吸附树脂3～5倍体积的乙酸乙酯进行洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，浓缩，得到含有埃博霉素B的粗提物；

4）将含有埃博霉素B的粗提物用甲醇溶解后，离心，将上清液经葡聚糖凝胶柱层析进行分离，用HPLC进行检测，合并含有埃博霉素B的组分，得到埃博霉素B分离液；

5）向埃博霉素B分离液中加入该分离液总体积2%～5%的分子印迹聚合物，摇床处理18～30h后，用甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液；

6）将甲醇洗脱液浓缩后，得到浓缩液，将浓缩液低温结晶处理，析出的白色结晶即为埃博霉素B。

步骤1）所述的摇瓶、一级种子罐和二级种子罐中所用的培养基均为M26液体培养基，成分为：土豆淀粉7.5～8.0g/L，大豆蛋白胨1.5～2.0g/L，葡萄糖1.5～2.0g/L，酵母粉1.5～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0～1.2g/L，CaCl₂1.0～1.2g/L，EDTA-Fe³⁺1mL/L，微量元素1mL/L，pH值为7.2；

所述的发酵罐中的培养基成分为：土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O2.3～2.5g/L，CaCl₂3.0～3.5g/L，EDTA-Fe³⁺2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。

步骤1）所述的摇瓶中的培养温度为30℃，转速为180～220rpm；所述的一级种子罐、二级种子罐及发酵罐中的培养温度为30℃，转速为150～200rpm，空气流量比为1:0.5，罐压为0.04～0.1kg/cm²；步骤2）加入大孔吸附树脂后，转速调整至120～150rpm。

步骤2）所述的大孔吸附树脂为XAD-16型大孔吸附树脂。

步骤2）所述的大孔吸附树脂在使用前经过预处理，包括：先用3～5倍柱体积的甲醇浸泡大孔吸附树脂，摇床震荡12～24h后，去除甲醇，水洗至无醇味，再用甲醇浸泡12～24h后，水洗至无醇味，备用。

步骤3）所述的洗脱时间为18～32h，所述的浓缩是将乙酸乙酯洗脱液在40～45℃下，真空度为-0.09～-0.085MPa的条件下，真空浓缩至干。

步骤4）所述的葡聚糖凝胶柱层析选用Sephadex LH-20层析柱，流动相选用甲醇，上样量为柱体积的1%～2%，流动相流速为8～12mL/min，展开距离为7.2～7.8cm/h。

步骤4）所述的离心是在15～25℃下，5000～10000rpm，离心10～20min。

步骤5）所述的分子印迹聚合物是埃博霉素B分子印迹聚合物。

步骤6）所述的浓缩是将甲醇洗脱液在40～45℃下，真空度为-0.09～-0.085MPa的条件下，真空浓缩至甲醇洗脱液体积的1/10；所述的低温结晶处理是将浓缩液在-20～-15℃下低温处理至析出白色结晶。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明一方面采用逐级放大的培养方式来发酵培养纤维堆囊菌，扩大了菌株的生长，从而提高了埃博霉素B的产量，适用性强，适合于多种工业菌种，易于大规模生产，解决了现有技术中所产生的活性物质中埃博霉素B产率低，生产波动性大这一问题；另一方面，本发明用到一种具备特异性靶向吸附能力的聚合物——分子印迹聚合物，它不仅对埃博霉素B具有很强的吸附力，能够简化分离过程，而且可以很容易地将埃博霉素B萃取出来，直接进行低温结晶处理，即可得到产物，并且产物纯度较高。同时分子印迹聚合物经过干燥处理还可以重复使用，这样就极大降低了分离提取埃博霉素药物的生产成本，具有更广阔的应用前景和经济效益。本发明方法操作简单、环境友好、适合工业化大规模生产。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

1、纤维堆囊菌的发酵培养

摇瓶培养：首先将纤维堆囊菌菌株ATCC25532接种到装有M26液体培养基的三角瓶中，在30℃，200rpm摇床上振荡培养培养72h，得到摇瓶菌种液；

其中，所述的M26液体培养基的成分为：土豆淀粉7.5～8.0g/L，大豆蛋白胨1.5～2.0g/L，葡萄糖1.5～2.0g/L，酵母粉1.5～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0～1.2g/L，CaCl₂1.0～1.2g/L，EDTA-Fe³⁺1mL/L，微量元素1mL/L，pH值为7.2；

一级种子罐培养：将得到的摇瓶菌种液接种到装有上述M26液体培养基的5L发酵罐中，在温度为30℃，转速为150rpm，空气流量比为1:0.5，罐压为0.04～0.1kg/cm²，pH值为7.2的条件下，培养72h，得到一级菌种液；

二级种子罐培养：将生长旺盛的一级菌种液接种到装有上述M26液体培养基50L发酵罐中，在温度为30℃，转速为150rpm，空气流量比为1:0.5，罐压为0.04kg/cm²，pH值为7.2，培养72h，得到二级菌种液；

发酵罐培养：最后将生长旺盛的二级菌种液转入500L发酵罐中，在温度为30℃，转速为150rpm，继续发酵培养24h，空气流量比为1:0.5，罐压为0.04kg/cm²，得到发酵液；其中，发酵罐中的培养基成分为：土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O2.3～2.5g/L，CaCl₂3.0～3.5g/L，EDTA-Fe³⁺2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2；

2、埃博霉素B的粗提取

大孔树脂预处理：首先，用3倍树脂体积的甲醇浸泡，摇床震荡12h后，取出倒掉甲醇溶液，用纯水洗至无甲醇味；然后再用甲醇浸泡12h后，用纯水洗至无甲醇味，以备用。

向步骤1）所述的发酵罐中，加入发酵液总体积约为1%的XAD-16型大孔吸附树脂作为吸附剂，调整转速至120rpm，调节pH值至7.2左右，再培养100h后，停止发酵；

收集培养结束后的发酵液体中的大孔吸附树脂，用上述大孔吸附树脂3倍体积的乙酸乙酯洗脱24h，收集乙醇乙酯洗脱液，将乙醇乙酯洗脱液在温度为40℃，真空度-0.085MPa下，真空浓缩至干，得到含有埃博霉素B的粗提物。

3、分离提取埃博霉素B

用甲醇溶解含埃博霉素B的粗提物，在15℃下，8000rpm的条件下，离心15min，取上清液。将上清液经葡聚糖凝胶柱层析Sephadex LH-20进行初步分离，条件为：葡聚糖凝胶LH-20，10×100cm，流动相：甲醇。上样量为柱体积的2%，流动相流速为10mL/min，展开距离7.5cm/h。

再利用HPLC进行检测，合并含有埃博霉素B的组分，得到埃博霉素B分离液；其中，HPLC分析的基本参数:分析柱:反相C18(4.6mm×250mm;填料粒径5um)；流动相:甲醇/水=65:35；流速:1ml/min；进样体积:20uL；检测波长:249nm；检测时间:25min。

在埃博霉素B分离液中加入该分离液总体积约为2%的埃博霉素B分子印迹聚合物对埃博霉素B进行吸附，摇床处理24h后，用甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液；

结晶：将上述甲醇洗脱液在40℃，真空度-0.085MPa的条件下真空浓缩至甲醇洗脱液体积的十分之一，得到浓缩液，将浓缩液放入洁净的结晶器皿中，在-20℃下低温结晶处理，在结晶器皿底部，析出大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。

实施例2

1、纤维堆囊菌的发酵培养

摇瓶培养：首先将纤维堆囊菌菌株ATCC25569接种到装有M26液体培养基的三角瓶中，在30℃，180rpm摇床上振荡培养培养84h，得到摇瓶菌种液；

其中，所述的M26液体培养基的成分与实施例1相同；

一级种子罐培养：将得到的摇瓶菌种液接种到装有上述M26液体培养基的5L发酵罐中，在温度为30℃，转速为200rpm，空气流量比为1:0.5，罐压为0.05kg/cm²，pH值为7.2的条件下，培养84h，得到一级菌种液；

二级种子罐培养：将生长旺盛的一级菌种液接种到装有上述M26液体培养基50L发酵罐中，在温度为30℃，转速为200rpm，空气流量比为1:0.5，罐压为0.05kg/cm²，pH值为7.2，培养84h，得到二级菌种液；

发酵罐培养：最后将生长旺盛的二级菌种液转入500L发酵罐中，在温度为30℃，转速为200rpm，空气流量比为1:0.5，罐压为0.05kg/cm²，继续发酵培养32h，得到发酵液；其中，发酵罐中的培养基成分与实施例1相同；中的发酵培养纤维堆囊菌方法相同。

2.埃博霉素B的粗提取

大孔树脂预处理：首先，用4倍树脂体积的甲醇浸泡，摇床震荡24h后，取出倒掉甲醇溶液，用纯水洗至无甲醇味；然后再用甲醇浸泡24h后，用纯水洗至无甲醇味，以备用。

在500L发酵罐中培养了32h之后，通过在发酵罐中加入发酵液总体积约为4%的XAD-16型大孔吸附树脂作为吸附剂，调整转速至150rpm，调节pH值至7.0，再培养了120h后，停止发酵；

收集培养结束后的发酵液体中的大孔吸附树脂，用上述大孔吸附树脂4倍体积的乙酸乙酯进行洗脱32h，收集乙醇乙酯洗脱液，将乙醇乙酯洗脱液在温度为45℃，真空度-0.085MPa下，真空浓缩至干，得到含有埃博霉素B的粗提物。

3.分离提取埃博霉素B

用甲醇溶解含有埃博霉素B的粗提物，在20℃下，10000rpm，离心10min，取上清液。将上清液经葡聚糖凝胶柱层析SephadexLH-20进行初步分离，条件为：葡聚糖凝胶LH-20，10×100cm。流动相：甲醇。上样量为柱体积的2%，流动相流速为8mL/min，展开距离7.2cm/h。

在埃博霉素B分离液中加入该分离液总体积约为4%的埃博霉素B分子印迹聚合物对埃博霉素B进行吸附，摇床处理18h后，用甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液。

结晶：将上述甲醇洗脱液在温度45℃、真空度-0.085MPa的条件下真空浓缩至甲醇洗脱液体积的十分之一，得到浓缩液，将浓缩液放入洁净的结晶器皿中，在-20℃低温结晶处理，在结晶皿底部，析出大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。

实施例3

1、纤维堆囊菌的发酵培养

摇瓶培养：首先将纤维堆囊菌菌株ATCC25532接种到装有M26液体培养基的三角瓶中，在30℃，220rpm摇床上振荡培养培养96h，得到摇瓶菌种液；

其中，所述的M26液体培养基的成分与实施例1相同；

一级种子罐培养：将得到的摇瓶菌种液接种到装有上述M26液体培养基的5L发酵罐中，在温度为30℃，转速为160rpm，空气流量比为1:0.5，罐压为0.1kg/cm²，pH值为7.2的条件下，培养96h，得到一级菌种液；

二级种子罐培养：将生长旺盛的一级菌种液接种到装有上述M26液体培养基50L发酵罐中，在温度为30℃，转速为160rpm，空气流量比为1:0.5，罐压为0.1kg/cm²，pH值为7.2，培养96h，得到二级菌种液；

发酵罐培养：最后将生长旺盛的二级菌种液转入500L发酵罐中，在温度为30℃，转速为160rpm，继续发酵培养96h，空气流量比为1:0.5，罐压为0.1kg/cm²，得到发酵液；其中，发酵罐中的培养基成分与实施例1相同；中的发酵培养纤维堆囊菌方法相同。

2.埃博霉素B的粗提取

大孔树脂预处理：首先，用5倍树脂体积的甲醇浸泡，摇床震荡20h后，取出倒掉甲醇溶液，用纯水洗至无甲醇味；然后再用甲醇浸泡20h后，用纯水洗至无甲醇味，以备用。

在500L发酵罐中培养了96h之后，通过在发酵罐中加入发酵液总体积约为5%的XAD-16型大孔吸附树脂作为吸附剂，调整转速至140rpm，调节pH值至7.4，再培养150h后，停止发酵；

收集培养结束后的发酵液体中的大孔吸附树脂，用上述大孔吸附树脂5倍体积的乙酸乙酯进行洗脱18h，收集乙醇乙酯洗脱液，将乙醇乙酯洗脱液在温度为45℃，真空度-0.09MPa下，真空浓缩至干，得到含有埃博霉素B的粗提物。

3.分离提取埃博霉素B

用甲醇溶解含有埃博霉素B的粗提物，在25℃下，5000rpm，离心20min，取上清液。将上清液经葡聚糖凝胶柱层析LH-20进行初步分离，条件为：葡聚糖凝胶LH-20，10×100cm。流动相：甲醇。上样量为柱体积的1%，流动相流速为12mL/min，展开距离7.8cm/h。

在埃博霉素B分离液中加入该分离液总体积约为5%的埃博霉素B分子印迹聚合物对埃博霉素B进行吸附，摇床处理30h后，用甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液。

结晶：将上述甲醇洗脱液在温度45℃、真空度-0.09MPa的条件下真空浓缩至甲醇洗脱液体积的十分之一，得到浓缩液，将浓缩液放入洁净的结晶器皿中，在-15℃低温结晶处理，在结晶皿底部，析出大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。

综上所述，本发明通过逐级发酵生产纤维堆囊菌，提高了产量。同时在分离提取过程中用到一种特异性靶向吸附能力的聚合物：分子印迹聚合物。它不仅对埃博霉素B具有很强的吸附力，而且可以很容易地将埃博霉素B萃取出来，直接进行结晶，即可得到产物，印迹聚合物经过干燥处理还可以重复使用，这样就极大降低了分离提取埃博霉素药物的生产成本。

本发明所提供的方法操作步骤简单易行，可以放大至工业化生产，为埃博霉素B的工业化生产奠定了实验基础。

Claims

1.一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将纤维堆囊菌菌株摇瓶培养72-96h，将得到的摇瓶菌种液接种至一级种子罐中一级放大培养72-96h，将得到的一级菌种液接种至二级种子罐中二级放大培养72-96h，将得到的二级菌种液转入发酵罐中三级放大发酵培养12-96h后，得到发酵液；

步骤1)所述的摇瓶中的培养温度为30℃，转速为180～220rpm；所述的一级种子罐、二级种子罐及发酵罐中的培养温度为30℃，转速为150～200rpm，空气流量比为1:0.5，罐压为0.04～0.1kg/cm²；

2)向发酵液中加入发酵液总体积1％～5％的大孔吸附树脂，转速调整至120～150rpm，调节pH值至7.0～7.4后，继续培养100-150h后，停止发酵；所述的大孔吸附树脂为XAD-16型大孔吸附树脂；

3)收集步骤2)发酵结束后的液体中的大孔吸附树脂，用大孔吸附树脂3～5倍体积的乙酸乙酯进行洗脱18～32h，收集乙酸乙酯洗脱液，将乙酸乙酯洗脱液在40～45℃下，真空度为-0.09～-0.085MPa的条件下，真空浓缩至干，得到含有埃博霉素B的粗提物；

4)将含有埃博霉素B的粗提物用甲醇溶解后，离心，将上清液经葡聚糖凝胶柱层析进行分离，用HPLC进行检测，合并含有埃博霉素B的组分，得到埃博霉素B分离液；

所述的葡聚糖凝胶柱层析选用Sephadex LH-20层析柱，流动相选用甲醇，上样量为柱体积的1％～2％，流动相流速为8～12mL/min，展开距离为7.2～7.8cm/h；

5)向埃博霉素B分离液中加入该分离液总体积2％～5％的埃博霉素B分子印迹聚合物，摇床处理18～30h后，用甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液；

6)将甲醇洗脱液浓缩后，得到浓缩液，将浓缩液低温结晶处理，析出的白色结晶即为埃博霉素B。

2.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步骤1)所述的摇瓶、一级种子罐和二级种子罐中所用的培养基均为M26液体培养基，成分为：土豆淀粉7.5～8.0g/L，大豆蛋白胨1.5～2.0g/L，葡萄糖1.5～2.0g/L，酵母粉1.5～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0～1.2g/L，CaCl₂ 1.0～1.2g/L，EDTA-Fe³⁺1mL/L，微量元素1mL/L，pH值为7.2；

所述的发酵罐中的培养基成分为：土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 2.3～2.5g/L，CaCl₂3.0～3.5g/L，EDTA-Fe³⁺2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。

3.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步骤2)所述的大孔吸附树脂在使用前经过预处理，包括：先用3～5倍柱体积的甲醇浸泡大孔吸附树脂，摇床震荡12～24h后，去除甲醇，水洗至无醇味，再用甲醇浸泡12～24h后，水洗至无醇味，备用。

4.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步骤4)所述的离心是在15～25℃下，5000～10000rpm，离心10～20min。

5.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法，其特征在于，步骤6)所述的浓缩是将甲醇洗脱液在40～45℃下，真空度为-0.09～-0.085MPa的条件下，真空浓缩至甲醇洗脱液体积的1/10；所述的低温结晶处理是将浓缩液在-20～-15℃下低温处理至析出白色结晶。