CN103243134A - 一种基于埃博霉素b代谢途径的发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，属于发酵工程技术领域，包括以下步骤：1）将纤维堆囊菌接种于M26培养基中，摇床培养，得到种子液；2）将种子液接种至含有树脂的发酵液中，在25～35℃下摇床培养72～120h，向含有树脂的发酵液中添加前体物和小分子物质；3）将培养结束的发酵液过滤，收集树脂，树脂经水洗涤后再经甲醇振荡浸提，得到含有埃博霉素B的浸提液。本发明在发酵液中添加经筛选得到的前体物和与合成途径相关的小分子物质，对埃博霉素B的合成代谢途径进行扰动，使优良菌株充分发挥其合成代谢产物的能力，大幅度提高埃博霉素B的发酵水平，从而降低发酵成本，推动了抗癌药物的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及微生物发酵制药技术，具体涉及一种埃博霉素B的发酵生产方法。
背景技术
埃博霉素是纤维堆囊菌产生的一种次级代谢产物，是一种十六元大环内酯类抗癌药物，它与抗癌药物紫杉醇一样具有促微管聚合作用从而抑制肿瘤细胞的增殖，并且与紫杉醇相比，埃博霉素具有毒性更小，水溶性更好，对耐药性细胞作用更强，抗肿瘤谱更广等优点，同时化学结构简单，易于进行修饰，引起了生物、医学、制药及有机合成等学科领域的高度重视，因此是目前学术界密切关注的、医药界寄予厚望的、前景广阔的一类新型抗肿瘤药物。目前埃博霉素B已进入临床研究。
埃博霉素生物合成的调控机制并不清晰，综合文献可知，埃博霉素B的内酯环是由3个乙酸单位、4个丙酸单位和一个噻唑环缩合形成的，而乙酸单元和丙酸单元分别是以丙二酸单酰辅酶A和甲基丙二酸单酰辅酶A为前体的。目前埃博霉素B的产量还比较低，且不稳定，受培养条件和环境的等因素的影响很大。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，能够提高埃博霉素B的产量，同时降低发酵成本。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，包括以下步骤：
1）将纤维堆囊菌接种于M26培养基中，在25～35℃下摇床培养72～120h，得到种子液；
2）按100ml接种5～15ml的比例，将种子液接种至含有树脂的发酵液中，在25～35℃下摇床培养72～120h，在培养0～72h内向含有树脂的发酵液中添加前体物和/或小分子物质，所述的前体物为乙酸钠、丙酸钠、半胱氨酸中的一种或几种，小分子物质为甲基丙二酸、脂肪族类氨基酸、亚铁氰化钾、生物素中的一种或几种；
3）将培养后的发酵液过滤，收集树脂，树脂经水洗涤后再经甲醇振荡，得到含有埃博霉素B的浸提液。
所述乙酸钠、丙酸钠、甲基丙二酸的用量为0.25～7mmol/L，半胱氨酸及脂肪族类氨基酸的用量为40～80umol/L，亚铁氰化钾的用量为1×10-5～3×10-5mol/L，生物素的用量为：1～10ug/L。
所述的脂肪族类氨基酸为蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸中的一种或几种。
培养初始向含有树脂的发酵液中分别按5～8ug/L、40～60umol/L、30～50umol/L的量添加生物素、蛋氨酸和半胱氨酸。
培养初始向含有树脂的发酵液中分别按5～8ug/L、40～60umol/L、30～50umol/L的量添加生物素、缬氨酸和半胱氨酸。
培养初始向含有树脂的发酵液中按5～8ug/L的量添加生物素，发酵培养48h后分别按4～7mmol/L、4～7mmol/L、50～70umol/L的量添加乙酸钠、甲基丙二酸和半胱氨酸。
培养初始向含有树脂的发酵液中按5～8ug/L的量添加生物素，发酵培养48h后分别按4～7mmol/L、0.3～3mmol/L、50～70umol/L的量添加乙酸钠、丙酸钠和半胱氨酸。
所述的含有树脂的发酵液中树脂的添加量为15～30ml/L，添加的树脂为大孔树脂XAD16。
步骤1）、2）所述的摇床培养振荡速度为150～180r/min；步骤3）所述的 过滤为采用20～60目铁丝滤网夹筛过滤收集树脂。
所述的发酵液中含有酵母粉20～50g/L、玉米淀粉1～5g/L、磷酸二氢钠1～2g/L、磷酸氢二钠1～2g/L、MgSO4·7H2O2～5g/L、FeSO4·7H2O0.1～0.5g/L、CaCl22～5g/L、MnCl20.1～0.5g/L和葡萄糖10～15g/L，调节pH值为7.2～7.5。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
在抗生素生物合成过程中，前体物起着非常重要的作用，在合适的条件下可以控制菌体合成次级代谢产物的方向并增加其产量，本发明基于埃博霉素B的合成代谢途径，在发酵培养基中添加经筛选得到的前体物和/或与埃博霉素B合成途径相关的小分子物质，从而对埃博霉素B的合成代谢途径进行扰动，可以使优良菌株充分发挥其合成代谢产物的能力，大幅度提高埃博霉素B的发酵水平，从而降低发酵成本，且通过对前体物质和/或小分子物质添加量的控制，可以对埃博霉素的发酵代谢进行调控，本方法操作简单，环境友好，推动了抗癌药物的工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
对比例：
埃博霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、170r/min的条件下摇床培养72h后，得到作为发酵培养的种子液；其中，M26培养基组分为：土豆淀粉8.0g/L，大豆蛋白胨2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母粉2.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，CaCl21.0g/L，EDTA-Fe3+1mL/L，微量元素1mL/L，以KOH调节pH值为7.2；
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，发酵容器为250ml 三角瓶，在30℃、170r/min摇床培养96h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为20ml/L；其中，发酵培养基成分为：酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氢钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L、MgSO4·7H2O5g/L、FeSO4·7H2O0.1g/L、CaCl25g/L、MnCl20.1g/L和葡萄糖10g/L，用KOH调节pH值为7.2；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件为：色谱柱：YWG，C18，10μm，250×4.6mm；检测波长：249nm；流动相：甲醇：水=65:35（体积比）；进样体积：20μL；流速：1ml/min。测得埃博霉素B含量为32.7mg/L。
实施例1
基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，包括以下步骤：
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、170r/min的条件下摇床培养72h后，得到作为发酵培养的种子液；其中，M26培养基组分为：土豆淀粉8.0g/L，大豆蛋白胨2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母粉2.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，CaCl21.0g/L，EDTA-Fe3+1mL/L，微量元素1mL/L，以KOH调节pH值为7.2；
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，并在初始发酵液中按照1×10-5～3×10-5mol/L的量添加亚铁氰化钾，发酵容器为250ml三角瓶，在30℃、170r/min摇床培养96h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为20ml/L；其中，发酵培养基成分为：酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氢钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L、MgSO4·7H2O5g/L、FeSO4·7H2O0.1g/L、CaCl25g/L、MnCl20.1g/L和葡萄糖10g/L，用KOH调节pH值为7.2。
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸 馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容进行高效液相色谱检测，色谱条件为：色谱柱：YWG，C18，10μm，250×4.6mm；检测波长：249nm；流动相：甲醇：水=65:35（体积比）；进样体积：20μL；流速：1ml/min。结果显示埃博霉素B的产量与对照组相比，提高了9.8%。
实施例2
基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，包括以下步骤：
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在25℃、160r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，并在初始发酵液中分别按照3×10-5mol/L和8ug/L的量添加亚铁氰化钾和生物素，发酵容器为250ml三角瓶，在25℃、160r/min条件下摇床培养72h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为20ml/L；其中，发酵培养基成分为：酵母粉25g/L、玉米淀粉4g/L、磷酸二氢钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L、MgSO4·7H2O3g/L、FeSO4·7H2O0.2g/L、CaCl25g/L、MnCl20.1g/L和葡萄糖15g/L，用KOH调节pH值为7.3；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量与对照组相比，提高了12.7%。
实施例3
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、160r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵 培养的种子液；其中M26培养基组分同实施例1；
2）将7.5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵培养基中，培养24h后向发酵液中按0.5mmol/L的量加入丙酸钠，发酵容器为250ml三角瓶，在30℃、160r/min条件下摇床培养96h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为30ml/L；其中，发酵培养基成分为：酵母粉35g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO4·7H2O5g/L、FeSO4·7H2O0.1g/L、CaCl22g/L、MnCl20.3g/L和葡萄糖10g/L，用KOH调节pH值为7.5；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量与对照组相比，提高了12.1%。
实施例4
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、170r/min的条件下摇床培养72h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将2.5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在35℃、150r/min摇床培养96h，其中，在培养24h后向发酵液中按照0.25mmol/L和7mmol/L的量添加乙酸钠和丙酸钠，发酵容器为250ml三角瓶，添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为20ml/L；其中，发酵培养基成分为：酵母粉20g/L、玉米淀粉1g/L、磷酸二氢钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L、MgSO4·7H2O3g/L、FeSO4·7H2O0.4g/L、CaCl23g/L、MnCl20.5g/L和葡萄糖15g/L，用KOH调节pH值为7.2；
3）发酵结束后用20目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸 馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量与对照组相比，提高了19.3%。
实施例5
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在35℃、150r/min的条件下摇床培养120h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1所用；
2）将4.5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵培养基中，在30℃、180r/min条件下摇床培养120h，其中，在培养72h后向发酵液中分别按2.5mmol/L和80umol/L的量加入丙酸钠和半胱氨酸，发酵容器为250ml三角瓶，添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为30ml/L；其中，发酵培养基成分为：酵母粉50g/L、玉米淀粉2g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO4·7H2O5g/L、FeSO4·7H2O0.1g/L、CaCl23g/L、MnCl20.3g/L和葡萄糖15g/L，用KOH调节pH值为7.5；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量与对照组相比，提高了22.4%。
实施例6
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、170r/min的条件下摇床培养72h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在35℃、150r/min 摇床培养96h，其中，在培养24h后向发酵液中分别按照3mmol/L、0.25mmol/L和1～10ug/L的量添加乙酸钠、丙酸钠和生物素，发酵容器为250ml三角瓶，添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为15ml/L；其中，发酵培养基成分为：酵母粉20g/L、玉米淀粉1g/L、磷酸二氢钠2g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO4·7H2O2g/L、FeSO4·7H2O0.5g/L、CaCl24g/L、MnCl20.2g/L和葡萄糖12g/L，用KOH调节pH值为7.2；
3）发酵结束后用20目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了26.8%。
实施例7
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在35℃、150r/min的条件下摇床培养120h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1所用；
2）将4.5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵培养基中，在30℃、160r/min条件下摇床培养72h，其中，在培养24h后向发酵液中分别按40umol/L、60umol/L和50umol/L的量加入苏氨酸、天冬氨酸和异亮氨酸；发酵容器为250ml三角瓶，添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为30ml/L；其中，发酵培养基成分为：酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO4·7H2O4g/L、FeSO4·7H2O0.1g/L、CaCl23g/L、MnCl20.3g/L和葡萄糖10g/L，用KOH调节pH值为7.5；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色 谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量与对照组相比，提高了14.5%。
实施例8
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、170r/min的条件下摇床培养72h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在35℃、180r/min摇床培养120h，其中，在培养24h后向发酵液中分别按照2mmol/L和5mmol/L的量添加乙酸钠和甲基丙二酸；发酵容器为250ml三角瓶，在35℃、180r/min摇床培养120h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为15ml/L；其中，发酵培养基成分为：酵母粉30g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氢钠2g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO4·7H2O5g/L、FeSO4·7H2O0.4g/L、CaCl24g/L、MnCl20.2g/L和葡萄糖12g/L，用KOH调节pH值为7.5；
3）发酵结束后用40目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了27.1%。
实施例9
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、180r/min的条件下摇床培养120h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在30℃、180r/min摇床培养120h，其中，在初始发酵液中添加6ug/L生物素，发酵培养48h后， 按照4mmol/L、0.3mmol/L和60umol/L的量加入乙酸钠、丙酸钠和半胱氨酸；发酵容器为250ml三角瓶；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为20ml/L；其中，发酵液成分为：酵母粉25g/L、玉米淀粉2g/L、磷酸二氢钠2g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO4·7H2O2g/L、FeSO4·7H2O0.5g/L、CaCl22g/L、MnCl20.2g/L和葡萄糖10g/L，用KOH调节pH值为7.3；
3）发酵结束后用60目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了31.9%。
实施例10
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、180r/min的条件下摇床培养120h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在30℃、180r/min摇床培养120h，其中，在初始发酵液中添加5ug/L生物素，发酵培养48h后，按照5mmol/L、1.0mmol/L和50umol/L的量加入乙酸钠、丙酸钠和半胱氨酸；发酵容器为250ml三角瓶，添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为20ml/L；其中，发酵液成分同实施例9；
3）发酵结束后用60目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了28.7%。
实施例11
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、180r/min的条件下摇床培养120h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1。
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在30℃、180r/min摇床培养120h，其中，在初始发酵液中添加8ug/L生物素，发酵培养48h后，按照7mmol/L、3.0mmol/L和70umol/L的量加入乙酸钠、丙酸钠和半胱氨酸；发酵容器为250ml三角瓶，添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为20ml/L；其中，发酵液成分同实施例9；
3）发酵结束后用60目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了29.9%。
实施例12
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在25℃、180r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将6ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在初始发酵液中按照6ug/L、50umol/L、40umol/L量添加生物素、缬氨酸和半胱氨酸，发酵容器为250ml三角瓶，在25℃、180r/min摇床培养96h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为15ml/L；其中，发酵液成分为：酵母粉50g/L、玉米淀粉1g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO4·7H2O3g/L、FeSO4·7H2O0.2g/L、CaCl25g/L、MnCl20.1g/L和葡萄糖12g/L，用KOH调节pH值为7.3；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸 馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了31.6%。
实施例13
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在25℃、180r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将6ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在初始发酵液中按照5ug/L、60umol/L、30umol/L量添加生物素、缬氨酸和半胱氨酸，发酵容器为250ml三角瓶，在25℃、180r/min摇床培养96h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为15ml/L，其中，发酵液成分同实施例12；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了30.2%。
实施例14
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在25℃、180r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1。
2）将6ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在初始发酵液中按照8ug/L、40umol/L、50umol/L量添加生物素、缬氨酸和半胱氨酸，发酵容器为250ml三角瓶，在25℃、180r/min摇床培养96h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为15ml/L，其中，发酵液成分同实施例12；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了31.7%。
实施例15
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在35℃、160r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1，
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在初始发酵液中，中按6ug/L、50umol/L、40umol/L的量加入生物素、蛋氨酸和半胱氨酸，发酵容器为250ml三角瓶，在30℃、170r/min摇床培养96h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为25ml/L；其中，发酵液成分为：酵母粉30g/L、玉米淀粉4g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠2g/L、MgSO4·7H2O5g/L、FeSO4·7H2O0.2g/L、CaCl25g/L、MnCl20.1g/L和葡萄糖15g/L，用KOH调节pH值为7.2；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了30.7%。
实施例16
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在35℃、160r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1，
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在初始发酵液中，中按5ug/L、60umol/L、30umol/L的量加入生物素、蛋氨酸和半胱氨酸，发酵容器为250ml三角瓶，在30℃、170r/min摇床培养96h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为25ml/L，其中，发酵液成分同实施例15；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了29.3%。
实施例17
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在35℃、160r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1，
2）将5ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在初始发酵液中，中按8ug/L、40umol/L、50umol/L的量加入生物素、蛋氨酸和半胱氨酸，发酵容器为250ml三角瓶，在30℃、170r/min摇床培养96h；添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为25ml/L，其中，发酵液成分同实施例15；
3）发酵结束后用30目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量比对照组提高了30.9%。
实施例18
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、170r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵 培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将6ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在30℃、170r/min摇床培养96h，其中，在初始发酵液中加入6ug/L生物素，发酵培养48h后，按照4mmol/L、6mmol/L和60umol/L的量加入乙酸钠、甲基丙二酸和半胱氨酸；发酵容器为250ml三角瓶，添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为20ml/L；其中，发酵液成分为：酵母粉30g/L、玉米淀粉1g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO4·7H2O3g/L、FeSO4·7H2O0.2g/L、CaCl23g/L、MnCl20.2g/L和葡萄糖10g/L，用KOH调节pH值为7.2；
3）发酵结束后用50目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量与对照组相比，提高了32.3%。
实施例19
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、170r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将6ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在30℃、170r/min摇床培养96h，其中，在初始发酵液中加入5ug/L生物素，发酵培养48h后，按照5mmol/L、4mmol/L和50umol/L的量加入乙酸钠、甲基丙二酸和半胱氨酸；发酵容器为250ml三角瓶，添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为20ml/L，发酵液成分同实施例18；
3）发酵结束后用50目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色 谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量与对照组相比，提高了31.0%。
实施例20
1）将纤维堆囊菌ATCC25531菌种接种于一瓶含有50ml M26培养基的250ml三角瓶中，在30℃、170r/min的条件下摇床培养96h，得到作为发酵培养的种子液；其中M26培养基成分同实施例1；
2）将6ml种子液接种到50ml含有树脂的发酵液中，在30℃、170r/min摇床培养96h，其中，在初始发酵液中加入8ug/L生物素，发酵培养48h后，按照7mmol/L、7mmol/L和70umol/L的量加入乙酸钠、甲基丙二酸和半胱氨酸；发酵容器为250ml三角瓶，添加的树脂为大孔树脂XAD16，添加量为20ml/L，发酵液成分同实施例18；
3）发酵结束后用50目铁丝滤网夹筛过滤发酵液后收集树脂，树脂经蒸馏水洗涤三次再经甲醇振荡浸提，所得浸提液烘干后定容，进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，结果显示埃博霉素B的产量与对照组相比，提高了29.1%。
埃博霉素B的内酯环是由3个乙酸单位、4个丙酸单位和一个噻唑环缩合形成的，而乙酸单元和丙酸单元分别是以丙二酸单酰辅酶A和甲基丙二酸单酰辅酶A为前体的，添加的缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸与甲基丙二酸单酰辅酶A的合成有关，亚铁氰化钾可以降低ATP含量，有利于解除ATP的反馈抑制作用，生物素是代谢途径中有关酶的辅酶。因此添加的前体物质乙酸钠，丙酸钠，半胱氨酸和/或与埃博霉素合成途径相关的小分子物质甲基丙二酸、氨基酸分子、亚铁氰化钾、生物素会大幅度提高埃博霉素B的产量，以降低生产成本。
综上，本发明通过在发酵培养基中添加埃博霉素B合成相关的前体物和 小分子物质，在很大程度上提高了埃博霉素B的产量，降低了生产成本，本发明的工艺可以进行发酵罐放大生产，为抗癌药物的工业化生产奠定了实验基础。
Claims (10)
1.一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将纤维堆囊菌接种于M26培养基中，在25～35℃下摇床培养72～120h，得到种子液；
2）按100ml接种5～15ml的比例，将种子液接种至含有树脂的发酵液中，在25～35℃下摇床培养72～120h，在培养0～72h内向含有树脂的发酵液中添加前体物和/或小分子物质，所述的前体物为乙酸钠、丙酸钠、半胱氨酸中的一种或几种，小分子物质为甲基丙二酸、脂肪族类氨基酸、亚铁氰化钾、生物素中的一种或几种；
3）将培养后的发酵液过滤，收集树脂，树脂经水洗涤后再经甲醇振荡，得到含有埃博霉素B的浸提液。
2.根据权利要求1所述的一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，其特征在于，所述乙酸钠、丙酸钠、甲基丙二酸的用量为0.25～7mmol/L，半胱氨酸及脂肪族类氨基酸的用量为40～80umol/L，亚铁氰化钾的用量为1×10-5～3×10-5mol/L，生物素的用量为1～10ug/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，其特征在于，所述的脂肪族类氨基酸为蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，其特征在于，在培养初始向含有树脂的发酵液中分别按5～8ug/L、40～60umol/L、30～50umol/L的量添加生物素、蛋氨酸和半胱氨酸。
5.根据权利要求3所述的一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，其特征在于，在培养初始向含有树脂的发酵液中分别按5～8ug/L、40～60umol/L、30～50umol/L的量添加生物素、缬氨酸和半胱氨酸。
6.根据权利要求2所述的一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，其特征在于，在培养初始向含有树脂的发酵液中按5～8ug/L的量添加生物素，发酵培养48h后分别按4～7mmol/L、4～7mmol/L、50～70umol/L的量添加乙酸钠、甲基丙二酸和半胱氨酸。
7.根据权利要求2所述的一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，其特征在于，在培养初始向含有树脂的发酵液中按5～8ug/L的量添加生物素，发酵培养48h后分别按4～7mmol/L、0.3～3mmol/L、50～70umol/L的量添加乙酸钠、丙酸钠和半胱氨酸。
8.根据权利要求1所述的一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，其特征在于，所述的含有树脂的发酵液中树脂的添加量为15～30ml/L，添加的树脂为大孔树脂XAD16。
9.根据权利要求1所述的一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，其特征在于，步骤1）、2）所述的摇床培养振荡速度为150～180r/min；步骤3）所述的过滤为采用20～60目铁丝滤网夹筛过滤收集树脂。
10.根据权利要求1所述的一种基于埃博霉素B代谢途径的发酵生产方法，其特征在于，所述的发酵液中含有酵母粉20～50g/L、玉米淀粉1～5g/L、磷酸二氢钠1～2g/L、磷酸氢二钠1～2g/L、MgSO4·7H2O2～5g/L、FeSO4·7H2O0.1～0.5g/L、CaCl22～5g/L、MnCl20.1～0.5g/L和葡萄糖10～15g/L，调节pH值为7.2～7.5。
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