CN103772406A - 一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其步骤是发酵液经大孔树脂吸附，乙酸乙酯解析后，得粗品；粗品首先经微滤膜、超滤膜除去大分子等杂质；再将上述滤液经过埃博霉素B分子印迹聚合物膜过滤得到纯的埃博霉素B液体；最后经过结晶得到埃博霉素B。本发明便于连续操作、易于放大、操作简单、成本低、选择性高，可快速地将埃博霉素B分子从其结构类似物的混合物中分离出来，易于实现工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于抗生素分离提取领域，具体地涉及到一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法。
背景技术
埃博霉素B(Epothilone B)是微生物纤维堆囊菌产生的一类大环内酯类次级代谢产物。1994年美国国家癌症学会发现埃博霉素B对肿瘤细胞具有抑制活性，Merck实验室发现它和紫彬醇至少在微管蛋白聚合实验中具有相同作用，证明了埃博霉素对肿瘤细胞有抑制作用的事实，进一步的研究发现埃博霉素具有比紫彬醇优越的抗肿瘤特性，使得研究者把更多的精力投入到对其合成及分离提取上，以期更快的将其开发成为抗肿瘤药物。但是目前公开发表的分离提取埃博霉素B方法步骤繁琐，生产成本高，尚需研究大规模和简单廉价是分离纯化方法。
分子印迹技术以其预定性、识别性和实用性三大特点引起科学界广泛关注。将分子印迹技术与膜分离技术结合起来，制成的分子印迹聚合物膜（MolecularImprinted Membrane，MIM），兼具分子印迹技术与膜分离技术的优点，一方面，该技术具有便于连续操作、易于放大、能耗低、能量利用率高等优点，被看作是一种“绿色化学”的典型；另一方面，与传统的分子印迹微球材料相比，分子印迹聚合物膜具有材料更稳定，不需研磨等繁琐的制备过程，扩散阻力小，易于应用等独特的优点；另外，与目前商售膜如超滤、微滤及反渗透膜等无法实现单个物质的选择性分离的缺点相比，分子印迹膜的最大特点就是对模板分子的识别具有可预见性，针对性及高度选择性，为将特定目标分子从其结构类似物的混合物中分离出来提供了可行且有效的解决途径。分子印迹膜鉴于以上特点，将其应用到埃博霉素B的分离提取中将具有十分诱人的前景。
经过检索，目前还没有将分子印迹聚合物膜应用到埃博霉素B的分离纯化过程中的相关报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其操作简便，选择性高，极大地降低了提纯成本。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂，发酵结束后，过滤得到吸附树脂；其中，大孔树脂的加入量为液体培养基体积的2-5%；
（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提吸附树脂，收集浸提液；
（3）浸提液的初步过滤：将浸提液首先通过孔径为0.2-0.5um的微滤膜过滤，除去残留的菌体，得到滤液；再将滤液采用截留分子量为1000-5000的超滤膜过滤以去除大分子杂质，收集滤液，得到粗提物；
（4）埃博霉素B分子印迹膜过滤：首先将博霉素B分子印迹聚合物膜固定在透过装置的原料池和透过池之间，向原料池中加入粗提物，透过池中加入乙酸乙酯，将透过装置密封，搅拌下进行15-30min后，收集透过液得到埃博霉素B溶液；
（5）结晶：将埃博霉素B溶液进行真空浓缩，得到浓缩液，再将浓缩液于-20～-10℃下进行结晶，得到白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
所述的步骤（1）中的液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O 2.3～2.5g/L，CaCl23.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2；发酵的时间为120-150h。
所述步骤（1）中纤维堆囊菌菌株号为ATCC25532或ATCC25569。
所述步骤（1）中大孔树脂的采用如下方法进行处理：首先，用3～5倍大孔树脂体积的甲醇浸泡大孔树脂，摇床震荡12-16h后，去除甲醇溶液，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡12-16h后，水洗至无甲醇味；大孔树脂为XAD-16型大孔树脂。
所述步骤（2）中乙酸乙酯的用量为大孔树脂体积的3～5倍，浸提的时间为24-48h。
所述步骤（3）中微滤膜与超滤膜的材质均为醋酸纤维素、聚砜、聚丙烯、聚丙烯腈、聚乙烯醇或聚酰胺。
所述步骤（3）中微滤膜过滤的操作压力为0.1-0.5Mpa，操作温度为0-40℃，控制流速5-10mL/min；超滤膜过滤的操作压力为0.1-0.6MPa，温度0-40℃，控制流速5-10mL/min。
所述的埃博霉素B分子印迹聚合物膜是采用如下方法得到的：将埃博霉素B、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩尔比1:4:20混合均匀后，溶解于体积比为4:1的乙醇和甲醇的混合溶液中，搅拌均匀加入偶氮二异丁氰，充N2反应12h；然后将尼龙微孔滤膜浸泡20min后取出放入两个玻璃片之间，在波长为365nm、功率为400W的紫外灯下照射10h后，将玻璃片分开，用乙酸:甲醇体积比为1:9的溶液清洗掉埃博霉素B，即得到以尼龙微孔滤膜为支撑材料的埃博霉素B分子印迹聚合物膜；其中，所述体积比为4:1的乙醇和甲醇的混合溶液的用量为20～25mL/1mmol埃博霉素B；偶氮二异丁腈与埃博霉素B的比为5mg：1mol。
所述步骤（4）埃博霉素B分子印迹膜过滤的具体过程如下：透过装置为H型透过装置，包括两个完全相同的500mL带有磨口支管的原料池和透过池，原料池和透过池中间用夹子将埃博霉素B分子印迹聚合物膜固定，保持原料池和透过池底部连通，H型透过装置中的渗透横截面的有效直径为5.5cm，原料池中加入粗提物250mL，透过池中加入乙酸乙酯250mL，将透过装置密封，在搅拌下进行15-30min后，收集透过液即得到埃博霉素B溶液。
所述步骤（5）中浓缩的温度为40～45℃，真空度为-0.085～-0.09MPa。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明一方面采用膜过滤技术初步分离埃博霉素B，可以有效地去除一些大分子物质，并且具有操作简便，选择性好，低污染等特点。本发明另一方面将滤液渗透过分子印迹聚合物膜的方法，不仅是因为埃博霉素B分子印迹聚合物膜具有与埃博霉素B分子相匹配的孔穴，这些孔穴具有高度的选择性及专一识别性，只能够使埃博霉素B快速顺利地通过孔道，而限制了其他分子的透过，最终得到纯净的埃博霉素B溶液；而且分子印迹膜在分离方面有着色谱分离所不具备的优势，它可以进行连续的分离，两且分离物的量也不受限制，简化了分离步骤，便于工业化大生产，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明中H型透过装置的结构示意图。
其中，1为原料池，2为透过池，3为埃博霉素B分子印迹聚合物膜。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌ATCC25532在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵120h后过滤得到吸附树脂；
其中，大孔树脂XAD-16的加入量为液体培养基体积的2%；
大孔树脂XAD-16的采用如下方法进行处理：首先，用3倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡12h后，去除甲醇溶液，纯水洗大孔树脂XAD-16至无甲醇味；再用甲醇浸泡12h后，纯水洗至无甲醇味；
液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O 2.3～2.5g/L，CaCl2 3.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用4倍树脂体积的乙酸乙酯浸提吸附树脂24h，收集浸提液，得埃博霉素B的粗提物。
（3）用超滤膜过滤浸提液：
将埃博霉素B的粗提物首先通过孔径为0.2-0.5um的醋酸纤维素材质的微滤膜过滤，除去残留的菌体，并用50mL的乙酸乙酯洗滤1次，合并滤液；其中，微滤膜过滤操作压力为0.2Mpa，操作温度为20℃，控制流速5mL/min。
再将合并后的滤液用超滤膜进一步过滤：采用截留分子量为1000的醋酸纤维素材质的超滤膜过滤，去除大分子杂质，并用50mL的乙酸乙酯洗滤1次，合并滤液，得粗提物；其中，超滤膜过滤的操作压力为0.2MPa，温度20℃，控制流速5mL/min。
（4）埃博霉素B分子印迹膜过滤：参见图1，首先取两个完全相同的500mL带有磨口支管的玻璃池，一个为原料池1，另一个为透过池2，于两个玻璃池中间用夹子将埃博霉素B分子印迹聚合物膜3固定，保持底部连通，保证两池没有渗漏，组成密封H型透过装置，透过装置中的渗透横截面的有效直径为5.5cm，向原料池1中加入上述滤液250mL，向透过池2中加入乙酸乙酯纯溶剂250mL，将透过装置密封，在电磁搅拌下进行15min后，再将埃博霉素B分子印迹聚合物膜取出，用50mL乙酸乙酯洗脱1次得洗脱液，将透过液与洗脱液合并即为埃博霉素B溶液。
所述的埃博霉素B分子印迹聚合物膜是采用如下方法得到的：将埃博霉素B、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩尔比1:4:20混合均匀后，溶解于体积比为4:1的乙醇和甲醇的混合溶液中，搅拌均匀加入偶氮二异丁氰，充N2反应12h；然后将尼龙微孔滤膜放入混合液中浸泡20min；取出尼龙微孔滤膜置于两个玻璃片之间，在波长为365nm、功率为400W的紫外灯下照射10h后，将玻璃片分开，用乙酸:甲醇体积比为1:9的溶液清洗掉埃博霉素B，即得到以尼龙微孔滤膜为支撑材料的埃博霉素B分子印迹聚合物膜；其中，所述体积比为4:1的乙醇和甲醇的混合溶液的用量为20～25mL/1mmol埃博霉素B；偶氮二异丁腈与埃博霉素B的比为5mg：1mol。
（5）结晶：将埃博霉素B溶液在温度为40℃、真空度为-0.085MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液，再将浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
实施例2
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌ATCC25569在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵150h后过滤得到吸附树脂。
其中，大孔树脂XAD-16的加入量为液体培养基体积的3%；
大孔树脂XAD-16的采用如下方法进行处理：首先，用3倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡12h后，去除甲醇溶液，纯水洗大孔树脂XAD-16至无甲醇味；再用甲醇浸泡12h后，纯水洗至无甲醇味；
液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O 2.3～2.5g/L，CaCl2 3.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用3倍树脂体积的乙酸乙酯浸提吸附树脂36h，收集浸提液，得埃博霉素B的粗提物。
（3）用超滤膜过滤浸提液：
将埃博霉素B的粗提物首先通过孔径为0.2-0.5um的聚丙烯材质的微滤膜过滤，除去残留的菌体，并用乙酸乙酯洗滤2次，每次50mL，合并滤液；其中，微滤膜过滤操作压力为0.4Mpa，操作温度为30℃，控制流速8mL/min。
再将合并后的滤液用超滤膜进一步过滤：采用截留分子量为2000的聚丙烯材质的超滤膜过滤，去除大分子杂质，并用乙酸乙酯洗滤2次，每次50mL，合并滤液，得粗提物；其中，超滤膜过滤的操作压力为0.5MPa，温度30℃，控制流速8mL/min。
（4）埃博霉素B分子印迹膜过滤：首先取两个完全相同的500mL带有磨口支管的玻璃池，一个为原料池1，另一个为透过池2，于两个玻璃池中间用夹子将埃博霉素B分子印迹聚合物膜固定，保持底部连通，保证两池没有渗漏，组成密封H型透过装置，透过装置中的渗透横截面的有效直径为5.5cm，向原料池1中加入上述滤液250mL，向透过池2中加入乙酸乙酯纯溶剂250mL，将透过装置密封，在电磁搅拌下进行25min后，再将埃博霉素B分子印迹聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脱2次，每次50mL，得洗脱液，将透过液与洗脱液合并即为埃博霉素B溶液。
本实施例中的埃博霉素B分子印迹聚合物膜的制备方法同实施例1。
（5）结晶：将埃博霉素B溶液在温度为42℃、真空度为-0.088MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液，再将浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
实施例3
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌ATCC25532在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基加入经过处理的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵130h后过滤得到吸附树脂；
其中，大孔树脂XAD-16的加入量为液体培养基体积的5%；
大孔树脂XAD-16的采用如下方法进行处理：首先，用3倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡12h后，去除甲醇溶液，纯水洗大孔树脂XAD-16至无甲醇味；再用甲醇浸泡12h后，纯水洗至无甲醇味；
液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O 2.3～2.5g/L，CaCl2 3.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用5倍树脂体积的乙酸乙酯浸提吸附树脂48h，收集浸提液，得埃博霉素B的粗提物。
（3）用超滤膜过滤浸提液：将埃博霉素B的粗提物首先通过孔径为0.2-0.5um的聚乙烯腈材质的微滤膜过滤，除去残留的菌体，并用乙酸乙酯洗滤3次，每次50mL，合并滤液；其中，微滤膜过滤操作压力为0.5Mpa，操作温度为40℃，控制流速10mL/min。
再将合并后的滤液用超滤膜进一步过滤：采用截留分子量为3000的聚乙烯腈材质的超滤膜过滤，去除大分子杂质，并用乙酸乙酯洗滤3次，每次50mL，合并滤液，得粗提物；其中，超滤操作压力为0.6MPa，温度40℃，控制流速10mL/min。
（4）埃博霉素B分子印迹膜过滤：首先取两个完全相同的500mL带有磨口支管的玻璃池，一个为原料池1，另一个为透过池2，于两个玻璃池中间用夹子将埃博霉素B分子印迹聚合物膜3固定，保持底部连通，保证两池没有渗漏，组成密封H型透过装置，透过装置中的渗透横截面的有效直径为5.5cm，一池中加入上述滤液250mL，另一池中加入乙酸乙酯纯溶剂250mL，将透过装置密封，在电磁搅拌下进行30min后，再将埃博霉素B分子印迹聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脱3次，每次50mL，将透过液与洗脱液合并即为埃博霉素B溶液。
本实施例中的埃博霉素B分子印迹聚合物膜的制备方法同实施例1。
（5）结晶：将埃博霉素B溶液在温度为45℃、真空度为-0.09MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液，再将浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
实施例4
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌ATCC25532在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基加入经过处理的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵140h后过滤得到吸附树脂；
其中，大孔树脂XAD-16的加入量为液体培养基体积的4%；
大孔树脂XAD-16的采用如下方法进行处理：首先，用5倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡14h后，去除甲醇溶液，纯水洗大孔树脂XAD-16至无甲醇味；再用甲醇浸泡16h后，纯水洗至无甲醇味；
液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O 2.3～2.5g/L，CaCl2 3.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用3倍树脂体积的乙酸乙酯浸提吸附树脂30h，收集浸提液，得埃博霉素B的粗提物。
（3）用超滤膜过滤浸提液：将埃博霉素B的粗提物首先通过孔径为0.2-0.5um的聚乙烯醇材质的微滤膜过滤，除去残留的菌体，并用50mL的乙酸乙酯洗滤3次，合并滤液；其中，微滤膜过滤操作压力为0.1Mpa，操作温度为10℃，控制流速6mL/min。
再将合并后的滤液用超滤膜进一步过滤：采用截留分子量为4000的聚乙烯醇材质的超滤膜过滤，去除大分子杂质，并用乙酸乙酯洗滤3次，每次50mL，合并滤液，得粗提物；其中，超滤操作压力为0.1MPa，温度0℃，控制流速7mL/min。
（4）埃博霉素B分子印迹膜过滤：首先取两个完全相同的500mL带有磨口支管的玻璃池，一个为原料池1，另一个为透过池2，于两个玻璃池中间用夹子将埃博霉素B分子印迹聚合物膜3固定，保持底部连通，保证两池没有渗漏，组成密封H型透过装置，透过装置中的渗透横截面的有效直径为5.5cm，向原料池中加入上述滤液（即粗提物）250mL，向透过池中加入乙酸乙酯纯溶剂250mL，将透过装置密封，在电磁搅拌下进行20min后，再将埃博霉素B分子印迹聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脱3次，每次50mL，将透过液与洗脱液合并即为埃博霉素B溶液。
本实施例中的埃博霉素B分子印迹聚合物膜的制备方法同实施例1。
（5）结晶：将埃博霉素B溶液在温度为41℃、真空度为-0.09MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液，再将浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
实施例5
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌ATCC25532在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基加入经过处理的大孔树脂XAD-16，大孔树脂XAD-16存在于整个发酵流程之中，发酵125h后过滤得到吸附树脂；
其中，大孔树脂XAD-16的加入量为液体培养基体积的2%；
大孔树脂XAD-16的采用如下方法进行处理：首先，用4倍大孔树脂XAD-16体积的甲醇浸泡大孔树脂XAD-16，摇床震荡16h后，去除甲醇溶液，纯水洗大孔树脂XAD-16至无甲醇味；再用甲醇浸泡14h后，纯水洗至无甲醇味；
液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O 2.3～2.5g/L，CaCl2 3.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。
（2）乙酸乙酯浸提：用5倍树脂体积的乙酸乙酯浸提吸附树脂40h，收集浸提液，得埃博霉素B的粗提物。
（3）用超滤膜过滤浸提液：将埃博霉素B的粗提物首先通过孔径为0.2-0.5um的聚砜材质的微滤膜过滤，除去残留的菌体，并用乙酸乙酯洗滤2次，每次50mL，合并滤液；其中，微滤膜过滤操作压力为0.5Mpa，操作温度为40℃，控制流速10mL/min。
再将合并后的滤液用超滤膜进一步过滤：采用截留分子量为3000的聚砜材质的超滤膜过滤，去除大分子杂质，并用乙酸乙酯洗滤3次，每次50mL，合并滤液，得粗提物；其中，超滤操作压力为0.6MPa，温度40℃，控制流速10mL/min。
（4）埃博霉素B分子印迹膜过滤：首先取两个完全相同的500mL带有磨口支管的玻璃池，一个为原料池1，另一个为透过池2，于两个玻璃池中间用夹子将埃博霉素B分子印迹聚合物膜3固定，保持底部连通，保证两池没有渗漏，组成密封H型透过装置，透过装置中的渗透横截面的有效直径为5.5cm，向原料池1中加入上述滤液250mL，向透过池2中加入乙酸乙酯纯溶剂250mL，将透过装置密封，在电磁搅拌下进行30min后，再将埃博霉素B分子印迹聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脱3次，每次50mL，将透过液与洗脱液合并即为埃博霉素B溶液。
本实施例中的埃博霉素B分子印迹聚合物膜的制备方法同实施例1。
（5）结晶：将埃博霉素B溶液在温度为45℃、真空度为-0.09MPa下进行真空浓缩，得到浓缩液，再将浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
本发明提供了一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其步骤是发酵液经大孔树脂吸附，乙酸乙酯解析后，得粗品；粗品首先经微滤膜、超滤膜除去大分子等杂质；再将上述滤液经过埃博霉素B分子印迹聚合物膜过滤得到纯的埃博霉素B液体；最后经过结晶得到埃博霉素B的晶体。本发明具有以下优点：便于连续操作、易于放大、操作简单、成本低、选择性高，可快速地将埃博霉素B分子从其结构类似物的混合物中分离出来，易于实现工业化生产，具有十分诱人的前景。
本发明所提供的分子印迹膜的方法便于连续操作、易于放大，并且具有可预见性，针对性及高度选择性等特点，实现了特定的目标分子从其结构类似物的混合物中分离出来的目的。
Claims (10)
1.一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂，发酵结束后，过滤得到吸附树脂；其中，大孔树脂的加入量为液体培养基体积的2-5%；
（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提吸附树脂，收集浸提液；
（3）浸提液的初步过滤：将浸提液首先通过孔径为0.2-0.5um的微滤膜过滤，除去残留的菌体，得到滤液；再将滤液采用截留分子量为1000-5000的超滤膜过滤以去除大分子杂质，收集滤液，得到粗提物；
（4）埃博霉素B分子印迹膜过滤：首先将博霉素B分子印迹聚合物膜固定在透过装置的原料池和透过池之间，向原料池中加入粗提物，透过池中加入乙酸乙酯，将透过装置密封，搅拌下进行15-30min后，收集透过液得到埃博霉素B溶液；
（5）结晶：将埃博霉素B溶液进行真空浓缩，得到浓缩液，再将浓缩液于-20～-10℃下进行结晶，得到白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。
2.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述的步骤（1）中的液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO4·7H2O2.3～2.5g/L，CaCl2 3.0～3.5g/L，EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2；发酵的时间为120-150h。
3.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中纤维堆囊菌菌株号为ATCC25532或ATCC25569。
4.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述的步骤（1）中大孔树脂的采用如下方法进行处理：首先，用3～5倍大孔树脂体积的甲醇浸泡大孔树脂，摇床震荡12-16h后，去除甲醇溶液，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡12-16h后，水洗至无甲醇味；大孔树脂为XAD-16型大孔树脂。
5.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（2）中乙酸乙酯的用量为大孔树脂体积的3～5倍，浸提的时间为24-48h。
6.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中微滤膜与超滤膜的材质均为醋酸纤维素、聚砜、聚丙烯、聚丙烯腈、聚乙烯醇或聚酰胺。
7.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中微滤膜过滤的操作压力为0.1-0.5Mpa，操作温度为0-40℃，控制流速5-10mL/min；超滤膜过滤的操作压力为0.1-0.6MPa，温度0-40℃，控制流速5-10mL/min。
8.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述的埃博霉素B分子印迹聚合物膜是采用如下方法得到的：将埃博霉素B、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩尔比1:4:20混合均匀后，溶解于体积比为4:1的乙醇和甲醇的混合溶液中，搅拌均匀加入偶氮二异丁氰，充N2反应12h；然后将尼龙微孔滤膜浸泡20min后取出放入两个玻璃片之间，在波长为365nm、功率为400W的紫外灯下照射10h后，将玻璃片分开，用乙酸:甲醇体积比为1:9的溶液清洗掉埃博霉素B，即得到以尼龙微孔滤膜为支撑材料的埃博霉素B分子印迹聚合物膜；其中，所述体积比为4:1的乙醇和甲醇的混合溶液的用量为20～25mL/1mmol埃博霉素B；偶氮二异丁腈与埃博霉素B的比为5mg：1mol。
9.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（4）埃博霉素B分子印迹膜过滤的具体过程如下：透过装置为H型透过装置，包括两个完全相同的500mL带有磨口支管的原料池和透过池，原料池和透过池中间用夹子将埃博霉素B分子印迹聚合物膜固定，保持原料池和透过池底部连通，H型透过装置中的渗透横截面的有效直径为5.5cm，原料池中加入粗提物250mL，透过池中加入乙酸乙酯250mL，将透过装置密封，在搅拌下进行15-30min后，收集透过液即得到埃博霉素B溶液。
10.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（5）中浓缩的温度为40～45℃，真空度为-0.085～-0.09MPa。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20160518 |