CN103073550B

CN103073550B - 桑黄菌中环(l-脯氨酸-l-缬氨酸)的分离技术

Info

Publication number: CN103073550B
Application number: CN201310035900.5A
Authority: CN
Inventors: 宋爱荣; 赵晨; 孙效乐; 杨松; 秦丹
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2033-01-30
Also published as: CN103073550A

Abstract

本发明公开了一种桑黄菌（火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）中环（L-脯氨酸-L-缬氨酸）的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，然后是甲醇氯仿梯度洗脱，然后进行氯甲凝胶层析，再次进行正相硅胶层析，再次甲醇凝胶层析，最后是常压反相制备，经HPLC检测，1D-HNMR检测后，最终得到环（L-脯氨酸-L-缬氨酸）。

Description

桑黄菌中环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的分离技术

技术领域

本发明属于生物工程制药领域。

背景技术

桑黄(Phellinus)，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。

目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类：一是只有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此发明可以精致到纯品。

发明内容

本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，然后是甲醇氯仿梯度洗脱，然后进行氯甲凝胶层析，再次进行正相硅胶层析，再次甲醇凝胶层析，最后是常压反相制备，经HPLC检测，1D-HNMR检测后，最终得到环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)。此化合物目前已报道具有抑制鳗弧菌繁殖的作用。

本发明的技术方案如下：

桑黄粗提物，由下述方法制得：

(a)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉1-5％葡萄糖1-5％

蛋白胨0.1-0.5％酵母膏0.1-0.5％

硫酸镁0.1-0.5％磷酸二氢钾0.01-0.05％

(b)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；

(c)取步骤(b)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；

(d)用体积百分比为60～95％的乙醇对上述步骤(c)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90％；

(e)对步骤(d)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

(f)将步骤(e)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。

桑黄菌粗提物→正相硅胶层析→氯仿与甲醇凝胶层析→TLC检测→正相硅胶层析→甲醇凝胶层析→TLC检测→反相硅胶层析→HPLC检测→减压蒸干→环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)。

具体方法为：

(1)制备桑黄菌粗提物；

(2)将上述步骤(1)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次；

(3)收集上述步骤(2)中最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇与氯仿溶解，氯甲凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；

(4)将步骤(3)中的产物再次进行一次正相硅胶层析，然后进行甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱；

(5)将步骤(4)中的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇和水；

(6)收集洗脱液，HPLC检测，减压干燥，即为环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)。

本发明由桑黄菌中环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的分离技术的显著优势：本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95％的环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)。技术路线成熟明确，高效精确。

附图说明

图1为环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的结构式；

图2为环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的一维核磁共振H谱。

具体实施方式

实例1：

桑黄粗提物，由下述方法制得：

(a)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉1％葡萄糖1％

蛋白胨0.1％酵母膏0.1％

硫酸镁0.1％磷酸二氢钾0.01％

(b)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25℃温度，摇瓶转速为110r/min，pH7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25℃，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH3，通气量0.5-1.1vvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；

(c)取步骤(b)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3；

(d)用体积百分比为70％的乙醇对上述步骤(c)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55％；

(e)对步骤(d)所得提取液在70℃条件下，加热1小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；

将上述所得粗提物称取50g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶，柱高0.5m，直径10cm，分别洗脱3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1,Fr-2。将Fr-2用氯仿：甲醇＝1:1，溶解，进行，氯甲凝胶层析，收集洗脱液，TLC检测，适当合并，然后与等体积100目正相硅胶混合，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。减压浓缩洗脱液，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析。使用TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压蒸干，10％甲醇溶解，进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇与水，HPLC检测，条件为0min：0％甲醇，10min：100％甲醇，出峰时间为4.82min。适当合并，减压干燥，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ6.64(s,1H),4.09(dd,J＝10.2,6.4Hz,1H),3.77–3.71(m,1H),3.71–3.65(m,1H),3.52(ddd,J＝11.7,8.8,2.6Hz,1H),2.45–2.36(m,1H),2.28–2.17(m,1H),2.07–1.98(m,1H),1.97–1.75(m,3H),1.04(d,J＝6.9Hz,3H),0.98(d,J＝6.8Hz,3H).证明是环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)。

实例2：

桑黄粗提物，由下述方法制得：

(a)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉3％葡萄糖2％

蛋白胨0.5％酵母膏0.5％

硫酸镁0.5％磷酸二氢钾0.05％

(b)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30℃温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当pH值降到2.5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30℃，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH3，通气量0.5-1.1vvm，搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；

(c)取步骤(b)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；

(d)用体积百分比为90％的乙醇对上述步骤(c)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70％；

(e)对步骤(d)所得提取液在55℃条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10；

称取粗提物200g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶，柱高1.2m，直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿：甲醇＝75:1分别洗脱3，4个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1,Fr-2。。将Fr-2经氯甲凝胶层析后，TLC检测，适当合并并减压蒸干，再次进行正相硅胶层析，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。进行甲醇凝胶柱层析。然后，进行反相硅胶层析，HPLC检测收集的洗脱液，条件为0min：100％水，10min：100％甲醇，出峰时间为4.25min。适当合并，减压干燥，将洗脱液减蒸干，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ6.64(s,1H),4.09(dd,J＝10.2,6.4Hz,1H),3.77–3.71(m,1H),3.71–3.65(m,1H),3.52(ddd,J＝11.7,8.8,2.6Hz,1H),2.45–2.36(m,1H),2.28–2.17(m,1H),2.07–1.98(m,1H),1.97–1.75(m,3H),1.04(d,J＝6.9Hz,3H),0.98(d,J＝6.8Hz,3H).证明是环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)。

Claims

1.桑黄菌中环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的分离方法，其步骤顺序如下：

(1)制备桑黄菌粗提物；

(3)收集上述步骤(2)中最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇与氯仿溶解，氯甲凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，所述的洗脱剂为氯仿与甲醇，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；

(6)收集洗脱液，HPLC检测，减压干燥，即为环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)；

其中所述桑黄粗提物，由下述方法制得：

(a)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉1-5％葡萄糖1-5％

蛋白胨0.1-0.5％酵母膏0.1-0.5％

硫酸镁0.1-0.5％磷酸二氢钾0.01-0.05％

(b)所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；

(c)取步骤(b)中所得桑黄菌丝体发酵液，进行减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；

(e)对步骤(d)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

2.如权利要求1所述的桑黄菌中环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述的硅胶为100-200目正相硅胶，洗脱剂为氯仿和甲醇。

3.如权利要求1所述的桑黄菌中环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的分离方法，其特征在于，步骤(4)中所述的正相硅胶为200-300目，凝胶为SephadexLH-20或者SephadexLH-25，洗脱剂为甲醇。

4.如权利要求1所述的桑黄菌中环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的反相硅胶为C-18与C-8。

5.如权利要求1所述的桑黄菌中环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的洗脱剂为20％-80％的甲醇-水溶液。

6.如权利要求1所述的桑黄菌中环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的反相硅胶层析的次数为2-3次。

7.如权利要求1所述的桑黄菌中环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)的分离方法，其特征在于，步骤(6)所述的HPLC出峰时间为4.12-4.87min。