CN103073551B - 桑黄菌中六氢-7-羟基-3 -（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离技术 - Google Patents

桑黄菌中六氢-7-羟基-3 -（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离技术 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桑黄菌（火木层孔菌<i>Phellinus</i><i>igniarius</i>(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌<i>phellinus</i><i>linteus</i>(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌<i>Phellinus</i><i>hartigii</i>(AlleschetSchnabl)Imaz）中六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，采用氯仿甲醇梯度洗脱，进行TLC检测，再次使用正相硅胶层析，然后是甲醇凝胶层析，经PLC检测后，进行反相硅胶层析，适当合并洗脱液，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，经HPLC检测，既得六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。

Description

桑黄菌中六氢-7-羟基-3 -（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离技术
技术领域
本发明属于生物工程制药领域。
背景技术
桑黄（Phellinus），子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。
目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类：一是只有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此发明可以精致到纯品。
发明内容
本发明公开了一种桑黄菌（火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）中六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，采用氯仿甲醇梯度洗脱，进行TLC检测，再次使用正相硅胶层析，然后是甲醇凝胶层析，经PLC检测后，进行反相硅胶层析，适当合并洗脱液，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，经HPLC检测，即得六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，即六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4-二酮。此化合物具有抑制鳗弧菌繁殖作用。
本发明的技术方案如下：
桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉1-5%葡萄糖1-5%
蛋白胨0.1-0.5%酵母膏0.1-0.5%
硫酸镁0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；
(4)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%；
(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
分离六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的方法：
桑黄菌粗提物→正相硅胶层析→氯仿与甲醇梯度洗脱→TLC检测→正相硅胶层析→甲醇凝胶层析→TLC检测→反相硅胶层析→甲醇凝胶层析HPLC检测→减压蒸干→六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。
具体方法为：
(1)制备桑黄菌粗提物；
(2)将上述步骤（1）所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱3-5次；
(3)收集步骤（2）中的最后一次洗脱液，减压干燥，与等体积硅胶拌样，再次进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；
(4)收集上述步骤（3）中得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(5)对步骤（4）得到的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇和水；
(6)收集洗脱液，减压蒸干，进行甲醇凝胶层析。
(7)HPLC检测，适度合并洗脱液，减压干燥，即为六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。
本发明由桑黄菌中六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离技术的显著优势：本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。技术路线成熟明确，高效精确。
附图说明
图1为六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的结构式；
图2为六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的一维核磁共振H谱。
具体实施方式
实例1：
桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉1%葡萄糖1%
蛋白胨0.1%酵母膏0.1%
硫酸镁0.1%磷酸二氢钾0.01%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25℃温度，摇瓶转速为110r/min，pH7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25℃，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH3，通气量0.5-1.1vvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55%；
(5)对步骤(4)所得提取液在70℃条件下，加热1小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
将上述粗提物称取300g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶，柱高1m，直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿：甲醇=100:1，50:1，10:1,5:1分别洗脱3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1,Fr-2，Fr-3，Fr-4，Fr-5。。将Fr-5等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。收集洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇。使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥，进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇：水=15%，TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，用甲醇洗脱，将洗脱液减压蒸干，进行HPLC检测，0min,100%A水→10min，100%甲醇，适当合并洗脱液，减压干燥，得到六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ7.35–7.13(m,5H),4.45(t,J=4.1Hz,1H),4.32(dd,J=10.9,5.2Hz,1H),4.24(d,J=4.7Hz,1H),3.66(dd,J=13.0,5.0Hz,1H),3.12(d,J=5.0Hz,2H),2.02(dd,J=13.0,5.9Hz,1H),1.36–1.26(m,1H).证明是六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。
实例2：
桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉3%葡萄糖2%
蛋白胨0.5%酵母膏0.5%
硫酸镁0.5%磷酸二氢钾0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30℃温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当pH值降到2.5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30℃，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH3，通气量0.5-1.1vvm，搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；
(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70%；
(5)对步骤(4)所得提取液在55℃条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
将上述粗提物称取150g与等体积正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶，柱高0.8m，直径14cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿：甲醇=100:1，50:1，10:1,5:1分别洗脱2个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1,Fr-2，Fr-3，Fr-4，Fr-5。。将Fr-5等体积硅胶拌样，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。收集洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇。使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥，进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇：水=15%，TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，用甲醇洗脱，将洗脱液减压蒸干，进行HPLC检测，0min,100%A水→10min，100%甲醇，出峰时间为5.45min，适当合并洗脱液，减压干燥，得到六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ7.35–7.13(m,5H),4.45(t,J=4.1Hz,1H),4.32(dd,J=10.9,5.2Hz,1H),4.24(d,J=4.7Hz,1H),3.66(dd,J=13.0,5.0Hz,1H),3.12(d,J=5.0Hz,2H),2.02(dd,J=13.0,5.9Hz,1H),1.36–1.26(m,1H).证明是六氢-7-羟基-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。

Claims (9)

1.桑黄菌中六氢-7-羟基-3-(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法，其步骤顺序如下：
(1)制备桑黄菌粗提物；
(2)将上述步骤(1)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱3-5次；
(3)收集步骤(2)中的最后一次洗脱液，减压干燥，与等体积硅胶拌样，再次进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；
(4)收集上述步骤(3)中得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(5)对步骤(4)得到的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇和水；
(6)收集洗脱液，减压蒸干，进行甲醇凝胶层析；
(7)HPLC检测，适度合并洗脱液，减压干燥，即为六氢-7-羟基-3-(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮；
其特征在于所述桑黄粗提物由下述方法制得：
(a)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉1-5％葡萄糖1-5％
蛋白胨0.1-0.5％酵母膏0.1-0.5％
硫酸镁0.1-0.5％磷酸二氢钾0.01-0.05％
(b)所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(c)取步骤(b)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；
(d)用体积百分比为60～95％的乙醇对上述步骤(c)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90％；
(e)对步骤(d)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；
(f)将步骤(e)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
2.如权利要求1所述的桑黄菌中六氢-7-羟基-3-(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述的正相硅胶为100-200目正相硅胶。
3.如权利要求1所述的桑黄菌中六氢-7-羟基-3-(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述硅胶正相柱层析中的层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿或甲醇。
4.如权利要求1所述的桑黄菌中六氢-7-羟基-3-(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积，洗脱剂为氯仿与甲醇。
5.如权利要求1所述的桑黄菌中六氢-7-羟基-3-(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法，其特征在于，步骤(4)中所述的凝胶为SephadexLH-20或者SephadexLH-25，洗脱剂为甲醇。
6.如权利要求1所述的桑黄菌中六氢-7-羟基-3-(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的反相硅胶为C-18或者C-8。
7.如权利要求1所述的桑黄菌中六氢-7-羟基-3-(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的洗脱剂为15％-70％的甲醇-水溶液。
8.如权利要求1所述的桑黄菌中六氢-7-羟基-3-(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法，其特征在于，步骤(7)所述的HPLC条件为，0min,100％A水→10min，100％甲醇。
9.如权利要求1所述的桑黄菌中六氢-7-羟基-3-(苯基甲基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法，其特征在于，步骤(7)所述的HPLC出峰时间为5.3-5.9min。
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