CN103993055A - 一种生物合成腺苷蛋氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种腺苷蛋氨酸的合成方法，所述方法为：将腺苷蛋氨酸工程菌经发酵培养获得的发酵液过滤，取湿菌体在60～65℃干燥2～3h进行活化处理，获得的活化菌体加入腺嘌呤、葡萄糖、磷酸盐、硫酸盐、蛋氨酸和水构成反应体系，在33～37℃条件下进行转化反应，反应结束，获得的反应液即为含腺苷蛋氨酸的混合液；本发明构建了SAM工程菌，使用该菌种可以在已有腺嘌呤合成ATP反应液中添加蛋氨酸，从而省去了SAM合成酶的菌种培养、SAM合成酶的提取以及在反应中添加SAM合成酶等操作，使生产更为简便；腺嘌呤等原料都可以从市场大量较低价购得，利用本发明方法可以高效、大规模合成SAM。

Description

一种生物合成腺苷蛋氨酸的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种腺苷蛋氨酸的合成方法，特别涉及利益工程菌进行生物合成腺苷蛋氨酸的合成方法。

(二)背景技术

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)又名S-腺苷甲硫氨酸，在生物体内主要起着转甲基、转硫和转氨丙基的作用，参与众多重要的生化反应，从而具有多种治疗作用，对抑郁症、关节炎、肝胆疾病、胰腺炎等均有较好疗效。在欧洲一直将其作为忧郁症和关节炎的处方治疗药物。从1999年美国FDA批准其作为食品营养补充剂上市到现在，SAM的功效已经逐渐为大众了解。由于生产技术水平所限，目前SAM的价格还比较昂贵，因此研究开发低成本的SAM生产技术仍然具有现实意义。

由于SAM结构复杂，化学合成法原料价格昂贵、合成困难，因此国内外的合成研究和实际生产都集中在生物合成方法。生物合成SAM主要有两类方法：一类是采用添加蛋氨酸的发酵法；另一种是采用腺苷、腺苷三磷酸(ATP)等和蛋氨酸两种前体物的转化合成法。

在转化合成法中，发明专利CN1217002C(2005.08.31)、CN101285085B(2011.04.27)等公开了一种采用克隆了SAM合成酶的大肠杆菌工程菌，将ATP和蛋氨酸两种前体物转化合成SAM的方法；发明专利CN100363499C(2008.01.23)公开了一种采用ATP合成菌种，以腺苷合成分泌ATP，并添加蛋氨酸和SAM合成酶，偶联转化合成SAM的方法。

采用腺嘌呤合成ATP已经有许多报道(Akihiko Maruyama and TatsuroFujlo.Biosci.Biotechnol.Biochem.2001,65(3):644-650)，腺嘌呤比ATP和腺苷的相对分子量都小，采用腺嘌呤合成SAM，在相同分子转化率情况下，相同重量的腺嘌呤可以产生较多SAM，而且腺嘌呤的价格也较低，因此采用腺嘌呤合成ATP进而合成SAM，有望进一步降低SAM生产成本。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用ATP合成菌种构建的SAM工程菌，以腺嘌呤和蛋氨酸等原料转化合成腺苷蛋氨酸的方法，使该工程菌用腺嘌呤大量合成ATP的同时，高效转化合成分泌腺苷蛋氨酸的方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种生物合成腺苷蛋氨酸的方法，所述方法为：将SAM工程菌经发酵培养获得的发酵液过滤，取湿菌体在60-65℃干燥2-3h进行活化处理，获得活化菌体，活化菌体加入腺嘌呤、葡萄糖、磷酸盐、硫酸盐、蛋氨酸和水构成反应体系，在33～37℃条件下进行转化反应，反应结束后，获得的反应液即为含腺苷蛋氨酸的混合液；所述反应体系中活化菌体的用量为70～100g/L(即终浓度)，腺嘌呤的用量为2～4g/L(终浓度)、葡萄糖的用量为80～100g/L(终浓度)，磷酸盐的用量为70～90g/L(终浓度)，硫酸盐的用量为3～5g/L(终浓度)，蛋氨酸的用量为3～5g/L(终浓度)；

所述SAM工程菌是指将酿酒酵母(Saceharomuces cerevisiae)的SAM合成酶基因2(sam2)克隆至雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGB1中，构建的腺苷蛋氨酸工程菌，即SAM工程菌。具体，本发明采用SAM工程菌是选用能够大量合成ATP菌种为SAM工程菌的出发菌株，具体选用从腺嘌呤大量合成分泌ATP的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGB1(详见专利CN102154117A)为出发菌株；再选用SAM合成酶基因，具体选用基因数据库GeneBank所公布的酿酒酵母(Saceharomucescerevisiae)来源的SAM合成酶基因2(sam2，登陆号M23368)，依其序列设计引物，通过PCR扩增得到sam2；然后将sam2装配入重组质粒pCB1004-PgpdA(详见专利CN1285721C)，得到由强启动子PgpdA驱动的sam2基因的重组表达质粒pCB1004-PgpdA-sam2，将pCB1004-PgpdA-sam2线性化，转化上述雅致放射毛霉ZGB1菌株，筛选验证得到SAM工程菌。

进一步，优选所述磷酸盐为磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。

进一步，优选所述硫酸盐为硫酸镁。

进一步，优选所述反应体系中活化菌体的用量为80～90g/L(终浓度)，腺嘌呤的用量为3～3.5g/L(终浓度)、葡萄糖的用量为80～90g/L(终浓度)，磷酸盐的用量为70～80g/L(终浓度)，硫酸盐的用量为3.5～4.0g/L(终浓度)，蛋氨酸的用量为4.0～4.5g/L(终浓度)。

进一步，优选所述湿菌体在60～65℃干燥2～2.5h活化处理。

本发明反应结束后，SAM产量测定采用高效液相色谱法(HPLC)进行，具体条件：Inertsil ODS-SP柱(5μm，4.6×250mm)，流动相15％甲醇-85％缓冲液(含0.6％乙酸铵、0.01％辛烷磺酸钠的水溶液)，用甲酸调至pH3.0，流速0.5mL/min，检测波长254nm。

SAM合成酶基因2(sam2，登陆号M23368)序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的有益效果主要体现在：

1、本发明选用能够从腺嘌呤大量合成分泌ATP的菌株为出发菌株，构建SAM工程菌，使所构建的SAM工程菌能够从分子量较小、价格较低的腺嘌呤大量合成ATP进而合成SAM，以降低SAM合成成本；并且选用的出发菌株为毛霉菌，菌丝体培养和分离操作简便，有利于转化合成反应与产物分离操作；

2、本发明构建了上述SAM工程菌，使用该菌种可以在已有腺嘌呤合成ATP反应液中添加蛋氨酸，参照已有合成ATP技术直接大量合成分泌SAM，不用外加SAM合成酶，从而省去了SAM合成酶的菌种培养、SAM合成酶的提取以及在反应中添加SAM合成酶等操作，使生产更为简便。

3、腺嘌呤等原料都可以从市场大量较低价购得，利用本发明方法可以高效、大规模合成SAM。

(四)附图说明

图1为重组质粒pCB1004-PgpdA-sam2的构建示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1工程菌的构建

本发明采用的含有酿酒酵母SAM合成酶基因2(sam2)的SAM工程菌的具体构建方法如下(雅致放射毛霉原生质体制备，目的基因的克隆、酶切验证、重组质粒构建及转化、原生质体再生及转化子筛选的具体条件和方法，详见论文《ATP合成关键酶基因APT1在雅致放射毛霉中的克隆表达》(朱家荣、杨善岩、陈丽芬等.食品与发酵工业,2012,38(6),43-47.)：

1、实验材料

雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGB1已在专利CN102154117A中公开。

E.coli DH5α购于生工生物工程(上海)有限公司；

酿酒酵母1964(Saccharomyces cerevisiae1964)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；

质粒pCB1004-PgpdA(详见专利CN1285721C)；

pMD19-T simple vector购于Takara公司。

蜗牛酶(BR)、纤维素酶(BR)购自国药集团化学试剂有限公司；BamH I、Kpn I等限制酶及所有分子试剂均购自TaKaRa公司；孟加拉红购于生工生物工程(上海)有限公司；潮霉素B购于上海宝曼生物科技有限公司；其他常用试剂为国产生化或分析纯试剂。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl10，(琼脂20)，溶剂为水，pH7.0；

高渗缓冲液(mol/L)：山梨醇1.0，Tris0.01，pH7.0；

转化缓冲液(mol/L)：山梨醇1.0，Tris0.01，CaCL₂25，pH7.0；

种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，NaCl5，溶剂为水，pH6.0～6.2，(固体培养加20g/L琼脂)；

菌体培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母膏3，玉米浆10，NH₄Cl3，MgSO₄·7H₂O1，FeSO₄·7H₂O0.2，K₂HPO₄·3H₂O3，溶剂为水，pH6.0～6.5；

再生培养基：以高渗缓冲液配制的种子培养基。

2、实验方法

2.1目的基因sam2的获得

重组质粒pCB1004-PgpdA在Not I/BamH I位点已连接构巢曲霉(Aspergillus nidutans)甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的强启动子PgpdA，可将目的基因克隆至该启动子下游，强化目的基因的表达。此外，该质粒上含有潮霉素和氯霉素抗性基因，可用于阳性转化子的抗性筛选。

选用GeneBank所公布的酿酒酵母(Saceharomuces cerevisiae)来源的SAM合成酶基因2(sam2，登陆号M23368)，依其序列和pCB1004-PgpdA的PgpdA下游BamH I/Kpn I酶切位点设计引物:

sam-F5’-CGCGGATCCATGTCCAAGAGCAA-3’(BamH I)，

sam-R5’-CGGGGTACCTTAAAATTCCAATTTC-3’(Kpn I)

氯化苄法(参见：钟铃，汪天虹.氯化苄提取染色体DNA.微生物学杂志，1997(3):62-63.)提取酿酒酵母总DNA，PCR扩增sam2基因(见表1、表2，sam2基因片段回收、纯化采用生工生物工程(上海)有限公司胶回收试剂盒)，T/A克隆至pMD19-T simple vector(见表3)，转化E.coliDH5α(利用Takara公司的感受态细胞制备试剂盒制备DH5α感受态细胞，42℃水浴90s热击转化)，转化细胞涂布含x-gal40μg/ml与IPTG40μg/ml的氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基平板，37℃培养12-16h(蓝白斑试验)，挑出白斑转化子，转化子SDS碱裂解法(杨献光；齐志广；赵宝存等.碱裂解法提取质粒DNA的研究[J].生物技术通报2003(6):24-26)提取质粒，BamH I/Kpn I双酶切(见表4)，1％琼脂糖凝胶电泳验证后，由生工生物工程(上海)有限公司完成测序，其序列与GeneBank所公布sam2序列完全相同，双酶切回收sam2基因片段即获得目的基因sam2。

表1PCR体系

添加物	体积/μL
		ddH2O	30.5
Primer Star buffer	10
		dNTP	4
10μM Sam F	2
		10μM Sam R	2
酵母基因组(模板)	1
		PrimeSTAR HS DNA polymerase(5U/μL)	0.5

表2PCR条件

表3重组体系

添加物	体积/μL
		sam2	4.5
pMD19-T Simple Vector	0.5
		Solution I	5
总体积	10

表4双酶切体系

2.2重组表达质粒pCB1004-PgpdA-sam2的构建

如图1所示，通过对载体pCB1004-PgpdA和上述目的基因sam2用BamH I/Kpn I的双酶切(见表4)，经过T4ligase连接后，构建重组表达质粒pCB1004-PgpdA-sam2(见表5)，转化E.coli DH5α感受态细胞，转化细胞涂布含氯霉素34μg/ml的LB培养基平板，37℃培养12-16h，挑出转化子，SDS碱裂解法质粒提取后进行双酶切、凝胶电泳验证。

表5重组质粒连接体系

2.3重组表达质粒转化雅致放射毛霉

雅致放射毛霉斜面种子加入种子培养基洗下孢子，得孢子悬液，接种种子培养基，28℃、160r/min摇床培养4h使孢子适度萌发，用双层擦镜纸过滤除去菌丝片段，离心收集萌发孢子，按质量体积比1:20加酶解液(含蜗牛酶2％和纤维素酶0.5％的高渗缓冲液)在30℃酶解4h，获得毛霉原生质体。在100μL原生质体(1×10⁶)转化缓冲液悬液中，加入10μL(约1～10μg)线性化处理(Kpn I酶切)的重组表达质粒pCB1004-PgpdA-sam2，冰浴30min；加入25μL PEG-4000质量含量为60％的转化缓冲液，冰浴10min；再加入500μL PEG-4000质量含量为60％的转化缓冲液，室温放置10min。转化液加入1mL转化缓冲液稀释后混合于15mL冷却至60℃左右的固体再生培养基(含潮霉素B400μg/mL，孟加拉红100μg/mL)，覆盖在再生培养基平板上，28℃培养6-8d，长出的菌落可初步认为是转化子。

2.4SAM高产转化子的筛选

挑取上述平板上长出的单菌落，转接于含潮霉素B400μg/mL，孟加拉红100μg/mL的固体种子培养基的斜面进行复筛。

挑取上述斜面复筛菌分别经种子培养、菌体培养后收集菌体、菌体活化(具体方法见实施例2)，得活化菌体。SAM反应体系(g/L)：葡萄糖80，K₂HPO₄·3H₂O70，MgSO₄·7H₂O4，腺嘌呤3，L-蛋氨酸4，活化菌体80(其余为水)。配好的SAM反应体系于37℃，160r/min摇床反应12h终止，液相色谱法测定反应终止液SAM产量，选出SAM高产菌株。氯化苄法提取高产菌株DNA，以特异性引物sam F/sam R扩增sam2基因，1％琼脂糖凝胶电泳、转录水平检验等验证，菌株含sam2基因，获得SAM工程菌。

SAM产量测定采用高效液相色谱法(HPLC)进行，具体条件：InertsilODS-SP柱(5μm，4.6×250mm)，流动相15％甲醇-85％缓冲液(含0.6％乙酸铵、0.01％辛烷磺酸钠的水溶液)，用甲酸调至pH3.0，流速0.5mL/min，检测波长254nm，采用外标法以不同SAM浓度标样的峰面积作标准曲线，未知浓度样品检测的峰面积在标准曲线上查出对应的腺苷蛋氨酸浓度，确定检样中的SAM含量。

实施例2SAM工程菌培养收集及活化处理

液体种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，NaCl5，溶剂为水，pH6.0～6.2；(斜面培养基加琼脂20)。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母膏3，玉米浆10，NH₄Cl3，MgSO₄·7H₂O1，FeSO₄·7H₂O0.2，K₂HPO₄·3H₂O3，溶剂为水，pH6.0～6.5。

将SAM工程菌的菌种接种于斜面培养基(试管或茄型瓶)，28-30℃培养3-4d；用适量液体种子培养基洗下孢子，得孢子悬液，再将孢子悬液以体积浓度10％的接种量接种于含有上述100mL种子培养基的250mL三角瓶中，150-220r/min摇床，28-30℃培养10-14h，得种子液；种子液以体积浓度10％的接种量接种于含有上述300mL菌体培养基的500mL三角瓶中，150-220r/min摇床，28-30℃培养10-14h，得菌体发酵培养液，经二层纱布过滤得到湿菌体。

湿菌体60-65℃干燥2-3h活化处理，得到活化菌体。

实施例3SAM工程菌转化合成SAM

活化菌体按比例投入如下SAM反应液(g/L)：葡萄糖80，K₂HPO₄·3H₂O70，MgSO₄·7H₂O4，腺嘌呤3，L-蛋氨酸4，活性菌体80(实施例2方法制备)，余量为水。于33-37℃，160r/min摇床，反应10-14h终止，液相色谱法(实施例1所述检测条件及方法)测得反应终止清液中SAM产量为1.0g/L。

实施例4SAM工程菌转化合成SAM

活化菌体按比例投入如下SAM反应液(g/L)：葡萄糖90，K₂HPO₄·3H₂O70，MgSO₄·7H₂O4，腺嘌呤3，L-蛋氨酸4，活性菌体80(实施例2方法制备)，余量为水。于33-37℃，160r/min摇床，反应10-14h终止，液相色谱法(实施例1所述检测条件及方法)测得反应终止清液中SAM产量为1.3g/L。

Claims (4)

1.一种腺苷蛋氨酸的合成方法，其特征在于所述方法为：将腺苷蛋氨酸工程菌经发酵培养获得的发酵液过滤，取湿菌体在60～65℃干燥2～3h进行活化处理，获得的活化菌体加入腺嘌呤、葡萄糖、磷酸盐、硫酸盐、蛋氨酸和水构成反应体系，在33～37℃条件下进行转化反应，反应结束，获得的反应液即为含腺苷蛋氨酸的混合液；所述反应体系中活化菌体的用量为70～100g/L，腺嘌呤的用量为2～4g/L、葡萄糖的用量为80～100g/L，磷酸盐的用量为70～90g/L，硫酸盐的用量为3～5g/L，蛋氨酸的用量为3～5g/L；

所述腺苷蛋氨酸工程菌是指将来源于酿酒酵母(Saceharomucescerevisiae)的SAM合成酶基因2克隆至雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)ZGB1中，构建的腺苷蛋氨酸工程菌；所述来源于酿酒酵母的SAM合成酶基因2在GeneBank的基因登陆号为M23368。

2.如权利要求1所述腺苷蛋氨酸的合成方法，其特征在于所述磷酸盐为磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。

3.如权利要求1所述腺苷蛋氨酸的合成方法，其特征在于所述硫酸盐为硫酸镁。

4.如权利要求1所述腺苷蛋氨酸的合成方法，其特征在于所述反应体系中活化菌体的用量为80～90g/L，腺嘌呤的用量为3～3.5g/L、葡萄糖的用量为80～90g/L，磷酸盐的用量为70～80g/L，硫酸盐的用量为3.5～4g/L，蛋氨酸的用量为4～4.5g/L。