CN101285085B

CN101285085B - 一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法

Info

Publication number: CN101285085B
Application number: CN2008100173575A
Authority: CN
Inventors: 牛卫宁; 钦传光; 王莉衡; 尚晓娅; 丁焰; 张瑞洁; 李洋
Original assignee: Northwestern Polytechnical University
Current assignee: Northwestern Polytechnical University
Priority date: 2008-01-22
Filing date: 2008-01-22
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2028-01-22
Also published as: CN101285085A

Abstract

本发明涉及一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，包括如下步骤：(1)发酵培养能大量表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组细胞；(2)使用有机溶剂或表面活性剂作为通透剂对用于催化合成腺苷甲硫氨酸的细胞进行通透化处理；(3)使用经过通透化处理的细胞以L-甲硫氨酸和三磷酸腺苷为原料合成腺苷甲硫氨酸。反应8小时腺苷甲硫氨酸合成量可达10-12g/L，底物转化率达到95％以上，并且反应液组份非常简单，大大简化了腺苷甲硫氨酸的提取纯化工艺。利用本发明的方法可以实现大规模、低成本、高效率生产高质量的腺苷甲硫氨酸，为腺苷甲硫氨酸的生产提供了一条新的途径。

Description

一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，是一种采用整细胞催化法制备腺苷甲硫氨酸的方法。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸(又称S-腺苷蛋氨酸，简称SAM)是甲硫氨酸和三磷酸腺苷相结合的代谢物，广泛存在于动植物和微生物体内，参与40多种生化反应，是人体内一种重要的生理活性物质。主要参与体内激素、神经递质、核酸、蛋白质和磷脂的生物合成和代谢以及抗氧化剂谷胱甘肽的形成，与体内各种解毒过程关系密切，是维护细胞膜正常功能、人体正常代谢和健康不可缺少的重要生命物质。同时SAM作为三种代谢途径(转甲基、转硫基、转氨丙基)的前体，临床上被广泛用于治疗肝病、抑郁症、关节炎等。SAM是双手性物质，有两种异构体：(+)SAM和(-)SAM，在体内只有(-)SAM具有生物活性。

SAM在欧洲一直被用作抑郁症及关节炎的处方治疗药物，后又发现其对肝病具有良好的治疗效果。1999年美国FDA批准其作为食品营养补充剂的形式推广出售。因而市场需求量大大增加。2002年SAM仅在美国销售额就达10亿美元。2000年我国开始进口，每年有1亿多元的销售，市场前景看好。目前国内使用的SAM主要是德国基诺(Knoll)和意大利RADIUM FARMAS.R.L.(IT)两个外资公司的产品，其价格昂贵，不能普及使用(汤亚杰，等.生物技术通报，2007，2：76-81)。我国人口众多，有相当数量的肝病和关节炎患者，且随着城市生活节奏加快和工作压力加大，抑郁症患者明显增多。同时SAM具有副作用小，疗效显著等特点，在我国必将有着巨大的应用前景。

SAM的制备始于20世纪50年代，目前的制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶促合成法三种。化学合成法是采用S-腺苷高半胱氨酸和甲基供体(CH₃I)合成SAM，但合成的SAM有(+)和(-)两种构型，只有(-)SAM具有生物活性，合成产物中少量的(+)-SAM难以分离，且存在产率低、反应底物S-腺苷高半胱氨酸价格昂贵和环境污染等问题，现已基本不用。

发酵法是近年来工业化生产SAM的主要途径。在含有一定量的甲硫氨酸(Met)的培养基中进行微生物发酵，在细胞内积累SAM，然后破碎细胞提取精制SAM。但发酵法的缺点是终产物积累量低、原料转化率低、产品生产周期长以及SAM的纯化工艺复杂等，从而导致了腺苷甲硫氨酸的价格居高不下，限制了SAM的广泛生产及应用。

酶促合成法是利用SAM合成酶在体外催化三磷酸腺苷(ATP)和L-Met合成(-)SAM。酶促转化法与化学合成法、发酵法相比，具有底物转化率高、产物积累量高、分离提纯容易、反应周期短及环境友好等优点，因而是较为有效的工业化生产方法。然而SAM合成酶在动物、植物和微生物中含量少、酶活低，且分离纯化困难，因此通过酶促转化法生产SAM受到SAM合成酶活力的限制。基因工程的发展使获得大量高活性的SAM合成酶成为可能，利用DNA重组技术构建高效表达SAM合成酶的基因工程菌，重组菌表达SAM合成酶活性为野生菌的几十倍到上百倍，经初步分离纯化后的游离酶或者固定化酶用于体外SAM的合成。但是在工业化规模上大量破碎重组菌提取SAM合成酶以及对酶进行固定化无疑大大增加了企业生产成本，并且在酶纯化及固定化过程中酶的活性会遭到一定的损失。

发明内容

要解决的技术问题

为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，是一种工艺简单、成本低廉且操作简便的整细胞催化ATP和L-Met合成 SAM的方法。以解决通过体外酶促转化法生产腺苷甲硫氨酸存在的SAM合成酶提取困难、酶活性损失较大的问题。

技术方案

本发明的技术特征在于包括以下步骤：

(1)发酵培养能大量表达腺苷甲硫氨酸合成酶的细胞，发酵过程中培养液的温度维持在15～38℃；

(2)使用有机溶剂或表面活性剂作为通透剂对用于催化合成腺苷甲硫氨酸的细胞进行通透化处理，反应温度维持在10～38℃；

(3)使用经过通透化处理的细胞以L-甲硫氨酸和三磷酸腺苷为原料合成腺苷甲硫氨酸，反应液的温度维持在25～38℃。

在本发明的一个优选例中，用于催化合成腺苷甲硫氨酸的细胞为基因工程重组细胞。所述的基因工程重组细胞为表达野生大肠杆菌K12腺苷甲硫氨酸合成酶基因的重组大肠杆菌，以及表达野生酿酒酵母腺苷甲硫氨酸合成酶2基因的重组毕赤酵母。

在本发明的另一个优选例中，重组大肠杆菌和重组毕赤酵母在启动子的调控下大量表达重组SAM合成酶，表达的SAM合成酶活性为野生菌的一百多倍；然后使用有机溶剂或表面活性剂对收获的重组细胞进行通透化处理用于催化合成SAM。

在本发明的另一个优选例中，步骤(A)中，培养液的温度为15-38℃；或在步骤(B)中，反应液的温度维持在10-38℃；或在步骤(C)中，反应液的温度维持在25-38℃。

更佳地，在表达SAM合成酶时培养液的温度为25-37℃；或对催化合成SAM细胞进行通透化处理的反应液温度为30-35℃。

在本发明的另一优选例中，所述的整细胞催化合成SAM的细胞选自：

(a)细菌；或

(b)酵母。

在本发明的另一优选例中，所述的整细胞催化合成SAM的细胞选自：大肠杆菌、毕赤酵母、或酿酒酵母。

在本发明的另一优选例中，所述通过整细胞催化合成SAM的细胞为游离的细胞；或为固定化的细胞。

在本发明的另一优选例中，所述用于催化合成SAM的游离细胞浓度为5-400g干燥细胞/L反应液；或

所述用于催化合成SAM的固定化细胞浓度为5-450g干燥细胞/L反应液。

在另一优选例中，所述用于催化合成SAM的游离细胞浓度为10-250g干燥细胞/L反应液；更优选的，所述用于催化合成SAM的游离细胞浓度为20-150g干燥细胞/L反应液。

在另一优选例中，所述用于催化合成SAM的固定化细胞浓度为20-350g干燥细胞/L反应液；更优选的，所述用于催化合成SAM的固定化细胞浓度为50-250g干燥细胞/L反应液。

在本发明的另一优选例中，所述对催化合成SAM的细胞进行通透化处理的试剂选自：

甲苯、二甲苯、或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

在另一优选例中，所述使用甲苯、二甲苯、或CTAB对催化合成SAM的细胞进行通透化处理时的浓度为0.25-20％；更优选的，所述对催化合成SAM的细胞进行通透化处理时甲苯的浓度为1-10％。

有益效果

本发明的有益效果可归纳如下：

1.本发明使用能大量表达SAM合成酶的重组菌作为酶源催化合成SAM，经验证，重组菌发酵获得的SAM合成酶的酶活相比野生菌提高了一百多倍。为整细胞催化合成SAM提供了大量廉价的酶源。

2.本发明使用甲苯、二甲苯、或CTAB等化学试剂对用于催化合成SAM的细胞进行通透化处理，然后使用经过通透化处理的整细胞催化合成SAM，经过通透化处理的细胞催化SAM合成的产率得到大幅度的提高，并且反应时间大大缩短；同时使用经过通透化处理的整细胞催化合成SAM不仅省去了纯化SAM合成酶的步骤，而且大大提高了SAM合成酶的稳定性和利用率，并且固定化细胞还能被反复用于催化ATP和L-Met合成SAM，大大降低了生产成本。

3.本发明利用整细胞催化合成SAM，可将95％的反应原料：L-Met和ATP在pH6-8、25-38℃、8-12小时的条件下转化为腺苷甲硫氨酸，由于通过整细胞催化合成SAM的反应液成份非常简单，而且反应完成后细胞催化剂很容易回收，所以大大简化了SAM的后续纯化。并且产物SAM中具有生物活性的(-)SAM占到95％左右。

4.本发明提供的方法可以通过大规模培养获得含有高活性SAM合成酶的细胞，然后对细胞进行通透化处理，最后使用经过通透化处理的整细胞(游离细胞或者固定化细胞)低成本、高效率、大规模的催化合成SAM。

附图说明

图1为反应0小时反应液的HPLC图谱。

图2为游离大肠杆菌细胞催化反应8小时的HPLC图谱。

图3为固定化大肠杆菌细胞催化反应8小时的HPLC图谱。

具体实施方式

现结合附图对本发明作进一步描述：

试验材料和方法：

1.细胞和试剂

大肠杆菌K12、大肠杆菌JM109、大肠杆菌表达质粒pBR322均为本室保存，也可以购买得到。毕赤酵母宿主菌X-33、酵母表达质粒pGAPZA均为Invitrogen公司产品。

大肠杆菌工程菌，携带有编码野生大肠杆菌K12腺苷甲硫氨酸合成酶基因。使用PCR方法以大肠杆菌K12基因组DNA为摸板扩增得到腺苷甲硫氨酸合成酶基因，将该基因连接到表达载体pBR322中在大肠杆菌JM109中进行表达，该基因的表达受到组成型启动子的调控。

毕赤酵母工程菌，携带有编码酿酒酵母腺苷甲硫氨酸合成酶2基因。使用PCR方法以酿酒酵母基因组DNA为摸板扩增得到腺苷甲硫氨酸合成酶2基因，将该基因连接到表达载体pGAPZA中在毕赤酵母宿主菌X-33中进行表达，该基因的表达受到组成型启动子的调控。

所用T₄ DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和限制性内切酶均购自Takara公司。质粒DNA抽提试剂盒、基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自北京博大泰克公司。其它所有试剂均为国产或进口分析纯试剂。

2.培养基

液体LB/Tet培养基：(10g/L蛋白胨；5g/L酵母粉；10g/L NaCl；15μg/ml四环素盐酸盐)。将蛋白胨、酵母粉和NaCl用去离子水溶解后调节pH＝7.0，在121℃灭菌20分钟，然后在接种时加入四环素盐酸盐，使其终浓度为15μg/ml。

固体LB/Tet培养基：在液体LB/Tet培养基中加入1.5％的琼脂，即制成固体琼脂平板培养基。

YPDS/Zeocin(10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、20g/L琼脂、1mol/L山梨醇、100mg/L Zeocin)，YPD(10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)，发酵培养基(0.1mol/L磷酸钠缓冲液pH 6.0、10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、13.4g/L YNB、4×10^-4g/L生物素，10g/L甘油)

3.常规分子生物学操作

大肠杆菌基因组DNA的提取、酿酒酵母基因组DNA的提取、SAM合成酶基因的PCR扩增、基因表达等技术参照精编分子生物学实验指南(奥斯伯等.1995)进行。重组毕赤酵母阳性菌株的筛选以及腺苷甲硫氨酸合成酶的表达参照Invitrogen公司的毕赤酵母操作手册进行。

本发明可以通过下述实施例进一步阐明：

实施例1 表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌的发酵

在固体LB/Tet平板上挑取单克隆，然后接入10ml液体LB/Tet培养基中，37℃培养16小时(220转/分钟)。

将上述菌液转接到2L液体LB/Tet培养基中，30℃培养16小时(280转/分钟)，使菌体生长达到稳定期。

该重组大肠杆菌也可以在15-38℃的条件下进行培养表达腺苷甲硫氨酸合成酶。当在15℃条件下进行培养，细胞生长到稳定期需要超过30小时，而且腺苷甲硫氨酸合成酶的表达量较低，酶活性为野生大肠杆菌的8倍左右；当在38℃条件下进行培养，细胞生长到稳定期仅需要8小时左右，但是表达的重组腺苷甲硫氨酸合成酶形成的包涵体较多，酶活性为野生大肠杆菌的58倍左右；当在30℃条件下进行培养时，经过16小时左右细胞就能生长达到稳定期，并且表达的腺苷甲硫氨酸合成酶活性最高，经测定为大肠杆菌K12腺苷甲硫氨酸合成酶活性的150多倍。所以重组大肠杆菌表达腺苷甲硫氨酸合成酶在30℃条件下为最佳。

将培养后的菌液进行离心，转速为6000rpm，离心10分钟，弃去上清液，收集沉淀的菌体用于后续试验。

实施例2 表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组毕赤酵母的发酵

将筛选出的高表达腺苷甲硫氨酸合成酶的毕赤酵母转化子接种到装有5mlYPD培养基的试管中，28-30℃280转/min培养过夜，以0.5％接种量转接到含250ml发酵培养基的2L的摇瓶中，30℃280转/min进行培养，每24小时取样监测表达腺苷甲硫氨酸合成酶的活力。结果表明当培养5天后，毕赤酵母表达腺苷甲硫氨酸合成酶的活力达到最高，为毕赤酵母X-33酶活力的80多倍。

实施例3 SAM合成酶酶活性的测定

将不同培养温度下发酵获得的大肠杆菌细胞分别用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)悬浮，并且以没有转入携带有SAM合成酶基因质粒的野生菌为对照。每克湿细胞加入3ml缓冲液悬浮，并且加入100ug/ml的溶菌酶在35℃下反应30分钟，然后在0℃下超声波破碎细胞。12000rpm 4℃离心收集SAM合成酶粗提液备用。

设定反应体系1ml，其中含有100mM Tris、100mM KCl、26mM MgSO4、10mM Met、13mM ATP、0.4M对甲基苯磺酸钠，将反应液pH值调至7。加入适量SAM合成酶粗提液催化反应，并同时以加入野生菌的粗提液做对照，以不加入Met的反应做空白对照。在37℃下温育30min后，加入10％的三氯乙酸终止反应。离心除去沉淀，通过 HPLC定量上清液中SAM的含量。

在4℃下6000rpm离心10分钟收集毕赤酵母细胞，加入3倍体积的细胞裂解缓冲液(0.05M pH8.0的Tris-HCl缓冲液、5％甘油、2mM二硫苏糖醇、1mM EDTA)，使用超声波(600W超声5秒间隔5秒)在0℃下处理15分钟裂解细胞，12000rpm离心15分钟，保留上清液用于酶活性的测定。

设定反应体系1ml，其中含有100mM Tris、100mM KCl、20mM MgSO4、20mM Met、20mM ATP、8mM还原型谷胱甘肽，将反应液pH值调至7。加入适量腺苷甲硫氨酸合成酶粗提液催化反应，并同时以加入野生菌的粗提液做对照，以不加入Met的反应做空白对照。在37℃下温育30min后，加入10％的三氯乙酸终止反应。离心除去沉淀，通过HPLC定量上清液中SAM的含量。

实施例4 细胞的固定化及通透化处理

分别采用海藻酸钠或卡拉胶包埋法对重组大肠杆菌和重组毕赤酵母细胞进行固定化。

海藻酸钠包埋：称取3g海藻酸钠，加入100ml水加热充分融化混匀，室温静置2h至气泡消失。取一定量的大肠杆菌或毕赤酵母细胞悬浮于0.9％的氯化钠溶液中，将海藻酸钠溶液与菌体溶液以相同比例混合均匀，然后用6号针头将混合物挤入0.2mol/L的CaCl₂溶液内，4℃静置5h，抽滤、30-35℃ 5％的甲苯通透处理1h，洗涤后备用。

卡拉胶包埋细胞：5％卡拉胶溶于去离子水，35℃与菌体以一定比例混匀，铺成2mm左右的膜，凝固后以20目的筛子切成颗粒，以0.5％戊二醛溶液交联1h，5％的甲苯通透处理1h，洗涤后置冰箱备用。

在对固定化细胞进行通透化处理时，也可以选用10％的二甲苯溶液以及5％的 CTAB溶液处理1小时。同时细胞进行通透化时反应液的温度对通透化效果有较大的影响，如果在10-30℃对细胞进行通透化处理，就需要延长通透化时间2-3小时。

实施例5 游离细胞的通透化处理

将实施例1和2中培养好的大肠杆菌和毕赤酵母菌液进行离心，转速为6000rpm，离心10分钟，弃去上清液，收集菌体沉淀。将收集的菌体悬浮于去离子水中，加入终浓度为1-5％的甲苯在30-35℃处理1h，然后将反应液6000rpm离心10分钟，收集经过通透化处理的菌体用于后续的整细胞催化合成SAM。也可以用1-5％的二甲苯或者1-3％的CATB对细胞进行通透化处理。

同时如果在10-30℃下对细胞进行通透化处理，需要适当的增加通透剂的浓度或者延长反应时间。

实施例6 重组大肠杆菌整细胞催化合成SAM

大肠杆菌整细胞催化合成SAM反应液的配制如下：

100mM Tris 30mM ATP、30mM L-Met、60mM MgSO4、100mM KCl、0.8M对甲基苯磺酸钠、经通透化处理的游离细胞20-50g或者固定化细胞50-150g，加水到1L，将反应液pH值调至7.0-7.5。将上述反应液加到反应器中，35℃反应8小时。HPLC监测反应结束后，10000rpm离心15分钟，收集上清液储存于4℃备用。

实验结果表明经过通透化处理的大肠杆菌游离细胞和固定化细胞均能将几乎所有底物ATP转化为产物SAM，转化率超过95％。反应0小时的HPLC监测结果如图1所示，反应8小时的HPLC监测结果如图2和图3所示。同时大肠杆菌固定化细胞被重复使用5次，还能将30mM ATP完全转化为SAM。

实施例7 重组毕赤酵母整细胞催化合成SAM

毕赤酵母整细胞催化合成SAM反应液的配制如下：

100mM Tris 20mMATP、20mM L-Met、40mM MgSO4、100mM KCl、8mM还原型谷胱甘肽、经通透化处理的游离细胞30-70g或者固定化细胞80-200g，加水到1L，将反应液pH值调至7.0-7.5。将上述反应液加到反应器中，35℃反应8-12小时。HPLC监测反应结束后，10000rpm离心15分钟，收集上清液储存于4℃备用。实验结果表明经过通透化处理的毕赤酵母游离细胞和固定化细胞能将20mM底物ATP转化为产物SAM，转化率超过90％。

实施例8 高压液相色谱法(HPLC)测定SAM含量

反应液中SAM的含量可以通过HPLC的反相C18柱进行分析检测，通过在不同反应时间下取样可以监测底物ATP的峰以及产物SAM的峰，并确定反应进程和反应终点，具体测定条件如下：

色谱柱Kromasil C18 5μm 4.6×250mm；检测波长260nm；流动相为(40mM乙酸-乙酸钠缓冲液+5％甲醇，pH＝4.6)；流速0.6ml/min。SAM的保留时间约为8min，ATP的保留时间约为5.5min。

采用外标法，根据不同浓度的SAM标准品峰面积绘制的标准曲线就可以对样品中的SAM进行定量。

Claims

1.一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)发酵培养能大量表达腺苷甲硫氨酸合成酶的大肠杆菌细胞，发酵过程中培养液的温度维持在15～38℃；

(2)将上述大肠杆菌细胞进行固定化，然后使用5％的甲苯作为通透剂对固定化大肠杆菌细胞进行通透化处理，反应温度维持在10～38℃；

(3)使用经过通透化处理的固定化大肠杆菌细胞以L-甲硫氨酸和三磷酸腺苷为原料合成腺苷甲硫氨酸，反应液的温度维持在25～38℃。

2.根据权利要求1所述的利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于：

所述的用于催化合成腺苷甲硫氨酸的细胞为基因工程重组大肠杆菌细胞。

3.根据权利要求2所述的利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于：

所述的基因工程重组大肠杆菌细胞包含有来源于大肠杆菌Escherichia coli腺苷甲硫氨酸合成酶的基因；或包含有来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae腺苷甲硫氨酸合成酶2的基因。