CN115747275B - 一种提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化工技术领域，具体为一种提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法包括：配置基础培养基溶液；向基础培养基溶液中添加一定量的S‑腺苷甲硫氨酸、月桂酰基谷氨酸钠和钙盐构成培养基溶液；向灭灭菌处理后培养基溶液中添加发酵菌种；在一定温度和转速下发酵。本发明通过特定甲醇培养基发酵培养甲基营养菌，并向培养基中添加一定比例的氨基酸表面活性剂月桂酰谷氨酸钠、氨基酸衍生物S‑腺苷甲硫氨酸（SAM）以及一定量的钙盐，能够有效地促进吡咯喹啉醌的生产，采用本发明的方法，能使吡咯喹啉醌的产量提升10‑18倍。本发明可利用低浓度甲醇添加一定的营养物后发酵获得高附加值产品吡咯喹啉醌，甲醇来源于工业废液，达到减少废弃物排放的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法。
背景技术
吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)在研究非磷酸化细菌的葡萄糖代谢过程中发现。二十世纪七十年代Durine首次分离出PQQ，随后Salisbury等人通过核磁等手段表征分析后对其结构进行了鉴定。2004年Kay等人通过绿脓假单胞菌产生PQQ的研究发现它是细菌脱氢酶氧化还原辅因子，是一种新型辅酶。吡咯喹啉醌是目前发现的四种醌式辅酶之一，参与氧化还原反应。PQQ是一种小分子化合物，分子中含有参与氧化还原反应的邻醌类结构，参与脱氢、氧化、水合和脱羧等反应，在微生物、动植物、人体以及食物中广泛存在，具有重要的生物学功能和巨大的经济价值。
无论对PQQ深入研究还是对PQQ巨大潜力的发掘应用，高效分离制备PQQ是一道巨大的障碍。目前从太岁“肉灵芝”中提取PQQ，受资源限制不可持续；化学合成法方法繁杂，合成步骤较多，提取效率不高，生产成本高，反应过程中有重金属参与，对环境产生巨大破坏；因此生物合成法制备PQQ成为未来发展的方向。
目前，PQQ主要存在于革兰氏阴性细菌中，少数革兰氏阳性细菌中也能产生PQQ，野生菌合成PQQ含量极低。PQQ生产菌种主要包括重组大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌、氧化葡萄糖酸杆菌等。而生产PQQ的野生菌有：甲基单胞菌属、假单胞菌属、甲基菌属、噬甲基菌属、甲基杆菌属、交替单胞菌属以及微环菌属等。其中合成PQQ最多的是甲基营养型细菌。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法，以解决现有技术中存在的菌株发酵PQQ产量低的问题。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法，其特征在于，包括：步骤一：配置基础培养基溶液；步骤二：向基础培养基溶液中添加一定量的S-腺苷甲硫氨酸、月桂酰基谷氨酸钠和钙盐构成培养基溶液；步骤三：向灭灭菌处理后培养基溶液中添加发酵菌种；步骤四：在一定温度和转速下发酵。
在上述的提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，所述步骤一中的基础培养基溶液按质量份数计包括：水1000份、甲醇5-10份、Na2HPO42份；Na2HPO41.4份、MgSO4·7H2O 1份、硫酸铵5份和微量元素溶液0.5-2份。
在上述的提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法，作为优选的方案，所述微量元素溶液按质量份数计包括：水1000000份、FeSO4·7H2O 80-100份、ZnSO4·7H2O 20-30份、KI0.09-0.59份、H3BO31-5份、CuSO4·5H2O 2-8份和NaCl 10-20份。
在上述的提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，所述步骤二中的S-腺苷甲硫氨酸、月桂酰基谷氨酸钠和钙盐按质量份数计为S-腺苷甲硫氨酸0.02-0.2份、月桂酰基谷氨酸钠1-3份、钙盐0.3-1份。
在上述的提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，所述钙盐为CaCl2或Ca(NO3)2。
在上述的提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，所述步骤三中的发酵菌种至少为甲基杆菌ACCC 40620、甲基杆菌ACCC 03242、鲍曼不动杆菌ACCC11038或鲍曼不动杆菌ACCC 01130中的一种。
在上述的提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，所述步骤四中的在一定温度和转速下发酵，实在发酵罐中进行的，其中发酵温度控制在28-36℃，转速控制在180-220r/min范围，发酵时间为30-80h。
本发明提供一种提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法，具有如下有益效果：
本发明通过特定甲醇培养基发酵培养甲基营养菌，并向培养基中添加一定比例的氨基酸表面活性剂月桂酰谷氨酸钠、氨基酸衍生物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)以及一定量的钙盐，能够有效地促进吡咯喹啉醌的生产，采用本发明的方法，能使吡咯喹啉醌的产量提升10-18倍。
研究表明：吡咯喹啉醌由pqq基因簇负责合成，该基因簇含有6个基因，经转录翻译生成6个蛋白或多肽。多肽PqqA经PqqE、PqqD酶催化发生偶联反应、PqqF酶水解切割除去多余氨基酸、PqqB、PqqC酶氧化修饰最终生成吡咯喹啉醌，合成路径如图2所示。在环化反应过程中，PqqED酶首先催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生成单电子自由基，激活多肽PqqA中谷氨酸和酪氨酸残基发生环化偶联反应。因此，本发明在该理论研究基础上，通过添加S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和月桂酰谷氨酸钠，提高合成通路代谢能力，促进PQQ的合成，提高发酵产量。
本发明可利用低浓度甲醇添加一定的营养物后发酵获得高附加值产品吡咯喹啉醌，甲醇可来源于工业废液，从而达到减少废弃物排放的目的，变废为宝。
附图说明
图1为本发明的反应步骤示意图；
图2为本发明的吡咯喹啉醌的合成路径图；
图3为本发明的PQQ检测标准曲线；
图4为本发明的实施例1发酵液中PQQ色谱图
图5为本发明的PQQ标准品HPLC色谱图；
图6为本发明的发酵液中PQQ纯品质谱图；
图7为本发明的发酵液中PQQ纯品紫外光谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下结合具体情况说明本发明的示例性实施例：
实施例1
如图1-图7所示，一种提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法，包括：步骤一：配置基础培养基溶液；步骤一种的基础培养基溶液按质量份数计包括：水1000份、甲醇5-10份、Na2HPO42份；Na2HPO41.4份、MgSO4·7H2O 1份、硫酸铵5份和微量元素溶液0.5-2份。微量元素溶液按质量份数计包括：水1000000份、FeSO4·7H2O 80-100份、ZnSO4·7H2O 20-30份、KI 0.09-0.59份、H3BO31-5份、CuSO4·5H2O 2-8份和NaCl 10-20份。
步骤二：向基础培养液中添加一定量的S-腺苷甲硫氨酸、月桂酰基谷氨酸钠和钙盐；其中，S-腺苷甲硫氨酸、月桂酰基谷氨酸钠和钙盐按质量份数计为S-腺苷甲硫氨酸0.02-0.2份、月桂酰基谷氨酸钠1-3份、钙盐0.3-1份；钙盐为CaCl2或Ca(NO3)2。
步骤三：向步培养基溶液中添加发酵菌种；发酵菌种至少为甲基杆菌ACCC 40620、甲基杆菌ACCC 03242、鲍曼不动杆菌ACCC 11038或鲍曼不动杆菌ACCC 01130中的一种。
步骤四：在一定温度和转速下发酵，主要包括将培养基溶液和发酵菌种放入到发酵罐中进行发酵。发酵罐中的培养条件为温度控制在28-36℃，转速控制在180-220r/min范围，发酵时间为30-80h。
实施例2
将甲基杆菌ACCC 40620活化后，接种到发酵培养基中发酵生产PQQ，其中发酵条件是：在30℃，200r/min的条件下发酵72h，发酵结束后，测定发酵液上清液中PQQ的含量。
发酵培养基中含有：水，1000g；Na2HPO4，2g；KH2PO4，1.4g；MgSO4·7H2O，1g；微量元素液，1g；甲醇，8g；(NH4)2SO4，5g；初始pH7.0。其中微量元素溶液的组成为：水，1000g；FeSO4·7H2O，80mg；ZnSO4·7H2O，20mg；KI，0.09mg；H3BO3，1mg；CuSO4·5H2O，2mg；NaCl，10mg。
实施例3
将甲基杆菌ACCC 40620活化后，接种到发酵培养基中发酵生产PQQ，其中发酵条件是：在30℃，200r/min的条件下发酵72h，发酵结束后，测定发酵液上清液中PQQ的含量。
发酵培养基中含有：水，1000g；Na2HPO4，2g；KH2PO4，1.4g；MgSO4·7H2O，1g；微量元素液，1g；甲醇8g；(NH4)2SO4，5g；S-腺苷甲硫氨酸0.025g；月桂酰基谷氨酸钠1g；CaCl2，0.5g。
其中微量元素溶液的组成为：水1000g；FeSO4·7H2O，80mg；ZnSO4·7H2O，20mg；KI，0.09mg；H3BO3，1mg；CuSO4·5H2O，2mg；NaCl，10mg。
实施例4
将甲基杆菌ACCC 40620活化后，接种到发酵培养基中发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在30℃，180r/min的条件下发酵68h，发酵结束后，测定发酵液上清液中PQQ的含量。
发酵培养基中含有：水，1000g；Na2HPO4，2g；KH2PO4，1.4g；MgSO4·7H2O，1g；微量元素液，1g；甲醇8g；(NH4)2SO4，5g；S-腺苷甲硫氨酸0.020g；月桂酰基谷氨酸钠1g；Ca(NO3)2，0.5g。
其中微量元素溶液的组成为：水1000g；FeSO4·7H2O，80mg；ZnSO4·7H2O，20mg；KI，0.09mg；H3BO3，1mg；CuSO4·5H2O，2mg；NaCl，10mg。
实施例5
将甲基杆菌ACCC 03242活化后，接种到发酵培养基中发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在30℃，200r/min的条件下发酵72h，发酵结束后，测定发酵液上清液中PQQ的含量。
发酵培养基中含有：水，1000g；Na2HPO4，2g；KH2PO4，1.4g；MgSO4·7H2O，1g；微量元素液，1g；甲醇8g；(NH4)2SO4，5g；S-腺苷甲硫氨酸0.120g；月桂酰基谷氨酸钠1g；Ca(NO3)2，0.5g。
其中微量元素溶液的组成为：水1000g；FeSO4·7H2O，80mg；ZnSO4·7H2O，20mg；KI，0.09mg；H3BO3，1mg；CuSO4·5H2O，2mg；NaCl，10mg。
实施例6
将甲基杆菌ACCC 03242活化后，接种到发酵培养基中发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在30℃，200r/min的条件下发酵72h，发酵结束后，测定发酵液上清液中PQQ的含量。
发酵培养基中含有：水，1000g；Na2HPO4，2g；KH2PO4，1.4g；MgSO4·7H2O，1g；微量元素液，1g；甲醇8g；(NH4)2SO4，5g；S-腺苷甲硫氨酸0.120g；月桂酰基谷氨酸钠1g；CaCl2，0.8g。
其中微量元素溶液的组成为：水1000g；FeSO4·7H2O，80mg；ZnSO4·7H2O，20mg；KI，0.09mg；H3BO3，1mg；CuSO4·5H2O，2mg；NaCl，10mg。
实施例7
将甲基杆菌ACCC 03242活化后，接种到发酵培养基中发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在30℃，200r/min的条件下发酵72h，发酵结束后，测定发酵液上清液中PQQ的含量。
发酵培养基中含有：水，1000g；Na2HPO4，2g；KH2PO4，1.4g；MgSO4·7H2O，1g；微量元素液，1g；甲醇，8g；(NH4)2SO4，5g；初始pH7.0。其中微量元素溶液的组成为：水，1000g；FeSO4·7H2O，80mg；ZnSO4·7H2O，20mg；KI，0.09mg；H3BO3，1mg；CuSO4·5H2O，2mg；NaCl，10mg。
实施例8
将鲍曼不动杆菌ACCC 11038活化后，接种到发酵培养基中发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在30℃，200r/min的条件下发酵72h，发酵结束后，测定发酵液上清液中PQQ的含量。
发酵培养基中含有：水，1000g；Na2HPO4，2g；KH2PO4，1.4g；MgSO4·7H2O，1g；微量元素液，1g；甲醇，8g；(NH4)2SO4，5g；初始pH7.0。其中微量元素溶液的组成为：水，1000g；FeSO4·7H2O，80mg；ZnSO4·7H2O，20mg；KI，0.09mg；H3BO3，1mg；CuSO4·5H2O，2mg；NaCl，10mg。
实施例9
将鲍曼不动杆菌ACCC 11038活化后，接种到发酵培养基中发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在30℃，200r/min的条件下发酵72h，发酵结束后，测定发酵液上清液中PQQ的含量。
发酵培养基中含有：水，1000g；Na2HPO4，2g；KH2PO4，1.4g；MgSO4·7H2O，1g；微量元素液，1g；甲醇8g；(NH4)2SO4，5g；S-腺苷甲硫氨酸0.180g；月桂酰基谷氨酸钠1g；CaCl2，1g。
其中微量元素溶液的组成为：水1000g；FeSO4·7H2O，80mg；ZnSO4·7H2O，20mg；KI，0.09mg；H3BO3，1mg；CuSO4·5H2O，2mg；NaCl，10mg。
实施例10
将鲍曼不动杆菌ACCC 01130活化后，接种到发酵培养基中发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在30℃，200r/min的条件下发酵72h，发酵结束后，测定发酵液上清液中PQQ的含量。
发酵培养基中含有：水，1000g；Na2HPO4，2g；KH2PO4，1.4g；MgSO4·7H2O，1g；微量元素液，1g；甲醇8g；(NH4)2SO4，5g；S-腺苷甲硫氨酸0.180g；月桂酰基谷氨酸钠1g；CaCl2，1g。
其中微量元素溶液的组成为：水1000g；FeSO4·7H2O，80mg；ZnSO4·7H2O，20mg；KI，0.09mg；H3BO3，1mg；CuSO4·5H2O，2mg；NaCl，10mg。
实施例11
将鲍曼不动杆菌ACCC 01130活化后，接种到发酵培养基中发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在30℃，200r/min的条件下发酵72h，发酵结束后，测定发酵液上清液中PQQ的含量。
发酵培养基中含有：水，1000g；Na2HPO4，2g；KH2PO4，1.4g；MgSO4·7H2O，1g；微量元素液，1g；甲醇，8g；(NH4)2SO4，5g；初始pH7.0。其中微量元素溶液的组成为：水，1000g；FeSO4·7H2O，80mg；ZnSO4·7H2O，20mg；KI，0.09mg；H3BO3，1mg；CuSO4·5H2O，2mg；NaCl，10mg。
实验例1
HPLC法检测发酵液中PQQ
HPLC检测方法：流动相为1‰三氟乙酸溶液，甲醇＝80：20(v/v)；进样量1μL；流速0.3mL/min；检测波长249nm；柱温30℃；检测器为DAD；色谱柱为Agilent GH0515046C18AQ反向柱(5μm，12nm)。
配置1mg/mL的PQQ标准溶液，将标准溶液梯度稀释至50、100、200、300、400mg/L的标准溶液，以稀释后的5组标准溶液确定标准曲线，使用HPLC检测方法对上述标准溶液进行高效液相色谱检测，所得数据以色谱图的峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，得到峰面积-浓度标准曲线，由此计算发酵液中PQQ的产量如图3、图4、图5所示。
表1实施例发酵液PQQ含量
结果分析：通过对实施例2-11发酵液中PQQ含量检测，结果表明向培养基中添加一定比例的氨基酸表面活性剂月桂酰谷氨酸钠、氨基酸衍生物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)以及一定量的钙盐，能使吡咯喹啉醌的产量提升5-18倍。
实验例2
吡咯喹啉醌的分离纯化：
将得到的发酵上清液浓缩至原始体积的四分之一，再过滤后先经过hp20ss柱，然后依次用2-3倍柱体积的去离子水、5％乙醇溶液、20％乙醇溶液以及纯乙醇洗脱，得到初步纯化后呈红色的PQQ产物。然后将得到的初步纯化的PQQ产物经过聚酰胺柱，用同样的方法进行洗脱，分别收集洗脱下来的溶液，得到再次纯化的PQQ产物。
纯化产物的鉴定
利用质谱对所得产物进行分析，分析条件:离子源：ESI，脱溶解温度扫描方式：阴离子，干燥气流速：5-7L/min，鞘气温度：350-410℃，毛细管电压：2500-3200v，鞘气流速：500-600L/h，碰撞能量：10-35V，锥孔电压：2.5-3.5V，质量扫描范围：100-1700m/z，每0.2s采集1次。
利用紫外-可见分光光度计对1mg/L纯化产物进行扫描，扫描范围190-365nm。
产物分析：通过质谱和紫外光谱鉴定纯化产物，结果如图6和7所示，质谱图中分子离子峰[M+NH4]+为348.11，确定分子量为330，与文献报道PQQ分子量一致。紫外光谱显示纯化产物紫外吸收峰为348和330nm，与文献报道PQQ紫外光谱图一致。
最后，还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (1)
1.一种提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法，其特征在于，包括：
步骤一：配置基础培养基溶液；所述基础培养基溶液按质量份数计包括：水 1000份、甲醇 5-10份、Na2HPO4 2份；KH2PO4 1.4份、MgSO4·7H2O 1份、硫酸铵5份和微量元素溶液0.5-2份；所述微量元素溶液按质量份数计包括：水1000000份、FeSO4·7H2O 80-100份、ZnSO4·7H2O 20-30份、KI 0.09-0.59 份、H3BO3 1-5 份、CuSO4·5H2O 2-8 份和NaCl 10-20 份；
步骤二：向基础培养基溶液中添加一定量的S-腺苷甲硫氨酸、月桂酰基谷氨酸钠和钙盐构成培养基溶液，S-腺苷甲硫氨酸、月桂酰基谷氨酸钠和钙盐按质量份数计为S-腺苷甲硫氨酸0.02-0.2份、月桂酰基谷氨酸钠1-3份、钙盐0.3-1份；所述钙盐为CaCl2 或Ca（NO3）2；
步骤三：向灭菌处理后培养基溶液中添加发酵菌种，发酵菌种为甲基杆菌ACCC 40620、甲基杆菌ACCC 03242、鲍曼不动杆菌ACCC 11038或鲍曼不动杆菌ACCC 01130中的一种；
步骤四：在一定温度和转速下发酵；具体为，在发酵罐中进行，其中发酵温度控制在28-36 ℃，转速控制在180-220 r/min范围，发酵时间为30-80 h。
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| 鲍曼不动杆菌生物合成吡咯喹啉醌的研究;周留柱;中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑;摘要、第6-7页1.2.2.5PqqE、第8页1.2.4PQQ的产生菌、第23页3.1.1菌株、第24页3.1.4培养基、第25页3.2.1培养方法 * |
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