CN116042731B - 利用酒糟酶解液生产1,3-丙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酒糟再利用技术领域,公开了利用酒糟酶解液生产1,3‑丙二醇的方法。包含以下步骤:向经过预处理的酒糟中加入水解酶,在45‑55℃条件下酶解24 h,离心过滤后取上清液,调节pH为6‑7后作为酒糟酶解液;将酒糟酶解液与发酵培养基混合,接种经过活化的肺炎克雷伯菌种子液发酵4‑6h后,加入甘油继续发酵6‑8h,补料发酵后,检测并分离1,3‑丙二醇。本发明中1,3‑丙二醇的产量及收率得到了提升,甘油的用量也减少至原来的60%。实现了工业废弃物资源充分利用,减少了环境污染。
Description
技术领域
本发明属于酒糟再利用技术领域,具体涉及利用酒糟酶解液生产1,3-丙二醇的方法。
背景技术
酒糟是酒生产过程中产生的典型的有机固体废弃物,据报道,我国每年产生的酒糟约1亿吨以上。除少部分用于畜禽饲料和农田堆肥外,大部分酒糟只能作为废弃物被丢弃,不仅导致环境的严重污染,还造成了资源的严重浪费。
1,3-丙二醇是一种非常重要的化工原料,是合成多种性能优异的高分子聚合物的单体,尤其制备的新型聚酯纤维聚对苯二甲酸丙二醇酯(polytrimethyleneterephthalate,简称 PTT)具有巨大的市场需求。目前,利用原材料来源广泛、环境污染小、反应条件温和的微生物发酵生产1,3-丙二醇成为近年来的研究热点。
甘油在微生物中的代谢途径主要分为两类:一类是还原途径,甘油经过甘油脱水酶的催化作用后,脱去一分子水生成3-羟基丙醛,在NADH存在下,通过1,3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛生成1,3-丙二醇。另一类是氧化途径,甘油被甘油脱氢酶催化脱氢,生成2-羟基丙酮,然后在2-羟基丙酮激酶作用下生成磷酸二羟丙酮,磷酸二羟丙酮进一步转化成丙酮酸,进入糖代谢途径生成其他小分子醇和酸等物质,同时释放出ATP,为微生物生长提供能量。氧化途径与还原途径通过NADH和NAD+相互转换偶联。目前,利用微生物发酵将甘油转化成1,3-丙二醇的技术研究取得了较大进展,但是仍然存在一些问题,如甘油转化率较低,甘油的价格忽高忽低不太稳定等问题。
发明内容
为解决背景技术中的问题,本发明提供了利用酒糟酶解液生产1,3-丙二醇的方法,其原材料为白酒工业废弃物,原料丰富,成本低廉,副产物比较少,不仅能够实现工业废弃物资源的充分利用,还能够减少环境污染,同时为1,3-丙二醇的工业化生产提供一条成本较低的新途径。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案为:
利用酒糟酶解液生产1,3-丙二醇的方法,包含以下步骤:
向经过预处理的酒糟中加入水解酶,在45-55℃条件下酶解24 h,离心过滤后取上清液,调节pH为6-7后作为酒糟酶解液;
将酒糟酶解液与发酵培养基混合,接种经过活化的肺炎克雷伯菌种子液发酵4-6h后,加入甘油继续发酵6-8h,补料发酵后,检测并分离1,3-丙二醇。
优选的,对酒糟的预处理方法为:
将干燥的酒糟粉碎后加入缓冲液混合均匀为第一混合溶液;
对第一混合溶液使用微波处理5-10min,冷却至室温后再加入缓冲液混合均匀为第二混合溶液;
向第二混合溶液中加入漆酶,在40-50℃条件下反应3-5 h。
优选的,所述缓冲液为pH 4.5-5.5的乙酸缓冲液;
所述微波处理的功率300-500 W;
所述漆酶的添加量为0.5-2 mg/g干酒糟。
优选的,所述水解酶为纤维素酶和淀粉酶,添加量分别为15-20 mg/g干酒糟和5-10 mg/g干酒糟。
优选的,肺炎克雷伯菌的活化方法为:
将肺炎克雷伯菌接种到液体培养基中,37 ℃ 培养8-12 h获得肺炎克雷伯菌种子液。
优选的,所述发酵培养基中酒糟酶解液浓度为4-10 g/L,甘油浓度为10-20 g/L。
优选的,所述肺炎克雷伯菌种子液的接种量为1%-5%。
优选的,所述补料发酵的方法为:在加入甘油继续发酵6-8h后,进行第一次补料,每12 h补料一次,发酵总时间为36-60 h。
优选的,所述补料的成分为:甘油浓度10-20 g/L、酒糟酶解液浓度4-10 g/L、(NH4)2SO4浓度1.25g/L;完成补料后体系中甘油浓度为40-70g/L,酒糟酶解液浓度15-45 g/L。
本发明还公开了采用上述任一所述利用酒糟酶解液生产1,3-丙二醇的方法得到的1,3-丙二醇。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明使用微波辅助漆酶对酒糟进行预处理,能够显著提高酒糟后续酶解生成的可发酵糖的产量,以预处理后的酒糟为原料,添加纤维素酶与淀粉酶进行酶解糖化得到酒糟酶解液,将酒糟酶解液添加至肺炎克雷伯菌的发酵培养基中,与甘油作为共同碳源,发酵生产1,3-丙二醇,在优化调节发酵培养基中的甘油与酒糟酶解液的比例后,1,3-丙二醇的产量及收率得到了提升,甘油的用量也减少至原来的60%。本发明使用的是工业废弃物酒糟酶解液作为碳源,在实现工业废弃物资源充分利用,减少环境污染的同时,也为1,3-丙二醇的工业化生产提供了更为低廉和丰富的原材料,从而创造更大的经济效益。
具体实施方式
为更好的理解本发明的技术方案,下面将结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。实现本发明的方式包括但不仅限于以下实施例,以下实施例用于说明本发明,但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明,实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法,如无特别说明,均为常规方法。
本发明实施方式提供了利用酒糟酶解液生产1,3-丙二醇的方法,包含以下步骤:
向经过预处理的酒糟中加入水解酶,在45-55℃条件下酶解24 h,离心过滤后取上清液,调节pH为6-7后作为酒糟酶解液;
将酒糟酶解液与发酵培养基混合,接种经过活化的肺炎克雷伯菌种子液发酵4-6h后,加入甘油继续发酵6-8h,补料发酵后,检测并分离1,3-丙二醇。
本发明将预处理后的酒糟酶解为酒糟酶解液,以酒糟酶解液和甘油为碳源,调节酶解液与甘油的比例,通过肺炎克雷伯菌进行1,3-丙二醇发酵,提高了1,3-丙二醇的产量及收率,甘油的用量也减少至原来的60%。
需要说明的是,本发明实施方式中使用的肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, K. pneumoniae),购自美国典型培养物保藏中心,保藏编号为ATCC 25955。
对酒糟的预处理方法为:
将干燥的酒糟粉碎后加入缓冲液混合均匀为第一混合溶液;
对第一混合溶液使用微波处理5-10 min,冷却至室温后再加入缓冲液混合均匀为第二混合溶液;
向第二混合溶液中加入漆酶,在40-50℃条件下反应3-5 h。
本发明实施方式通过先微波后漆酶的方式对酒糟进行预处理,能够显著提高酒糟酶解生成的可发酵糖的产量。
作为一些优选实施方式,预处理中使用的缓冲液为pH 4.5-5.5的乙酸缓冲液;所述微波处理的功率300-500 W;所述漆酶的添加量为0.5-2 mg/g干酒糟。
在一些具体实施方式中,对酒糟预处理的方法可以为:将10g干燥的酒糟粉碎后,加入乙酸缓冲液(pH 4.5-5.5)50-80 mL,混合均匀,然后使用微波处理5-10 min,取出后放至室温,再加入20-75 mL乙酸缓冲液,使酒糟的固液比在7-10%之间,加入漆酶溶液,在40-50℃条件下反应3-5 h。
所述水解酶为纤维素酶和淀粉酶,添加量分别为15-20 mg/g干酒糟和5-10 mg/g干酒糟。在一些优选实施方式中,酶解的条件为:在50 ℃、180 rpm条件下反应24 h;酶解液经过离心过滤保留上清液,离心条件为8000-10000 rpm,时间为10 min。
对肺炎克雷伯菌活化的具体方法为:将肺炎克雷伯菌K. pneumoniaeATCC 25955接种到液体培养基中,37 ℃ 培养8-12 h获得肺炎克雷伯菌种子液。其中,使用的液体培养基成分为:甘油 20 g/L,酵母浸粉7 g/L,K2HPO4•3H2O 7 g/L,KH2PO42 g/L,(NH4)2SO41.25g/L,MgSO4•7H2O 0.1 g/L,微量元素1.0 mL/L;所述微量元素溶液的成分为:CaCl2•2H2O3.2 mg/L,ZnCl23.8 mg/L,FeCl3•6H2O 30mg/L,MnCl2•4H2O 11.4 mg/L,CuCl2•2H2O 0.96mg/L,CoCl2•6H2O 2.64 mg/L,H3BO40.35mg/L,NaMoO4•2H2O 24.5 μg/L。
所述发酵培养基成分为:酒糟酶解液浓度为4-10 g/L,甘油浓度为10-20 g/L(此甘油是在接入肺炎克雷伯菌种子液发酵4-6 h后加入的甘油),温度为30-37 ℃,培养基配方为:碳源,酵母浸粉7 g/L,K2HPO4•3H2O 7 g/L,KH2PO42 g/L,(NH4)2SO41.25 g/L,MgSO4•7H2O 0.1 g/L,微量元素1.0 mL/L;所述微量元素溶液的成分为:CaCl2•2H2O 3.2 mg/L,ZnCl23.8 mg/L,FeCl3•6H2O 30mg/L,MnCl2•4H2O 11.4 mg/L,CuCl2•2H2O 0.96 mg/L,CoCl2•6H2O 2.64 mg/L,H3BO40.35mg/L,NaMoO4•2H2O 24.5 μg/L。其中,酒糟酶解液和甘油共同作为碳源。
所述肺炎克雷伯菌种子液的接种量为1%-5%。
所述补料发酵的方法为:在加入甘油继续发酵6-8h后,进行第一次补料,每12 h补料一次,发酵总时间为36-60 h。其中,所述补料的成分为:甘油浓度10-20 g/L、酒糟酶解液浓度4-10 g/L、(NH4)2SO4浓度1.25g/L;完成补料后体系中甘油浓度为40-70g/L,酒糟酶解液浓度15-45 g/L。
在一些具体实施方式中,肺炎克雷伯菌种子液按照1%-5%的比例接种于酒糟酶解液与未加甘油的发酵培养基中培养4-6 h,开始加入甘油,甘油的浓度为10-20 g/L,再继续发酵6-8 h后开始第一次补料,以后每12 h补料一次,发酵36-60 h,补料培养基为:甘油为10-20 g/L,酒糟酶解液4-10 g/L,(NH4)2SO41.25g/L。完成补料后体系中甘油浓度为40-70g/L,酒糟酶解液浓度15-45 g/L。
以下结合多个具体实施例对生产1,3-丙二醇的方法及性能进行详细说明。
部分原料的购买信息如下:
纤维素酶购自诺维信(中国)投资有限公司(北京);
淀粉酶购自山东隆科特酶制剂有限公司。
本发明实施例中所采用的生物量测定方法为:
以比浊法对生物量进行测定,取适量培养物稀释一定倍数,使用分光光度计在600nm处测定其吸光度(0.2-0.8),根据吸光度读数与稀释倍数计算培养液的OD600值。
本发明实施例中所采用甘油、1,3-丙二醇、酒糟酶解液中葡萄糖和木糖的测定方法为:
甘油、1,3-丙二醇、酒糟酶解液中的葡萄糖与木糖的测定均使用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)进行检测。液相色谱为安捷伦Agilent1260 Infinity II,检测器为示差检测器,色谱柱为Aminex HPX-87H(Bio-Rad),进样体积20 μL,柱温40 ℃,流动相为5 mM H2SO4溶液,流速为0.6 mL/min;
标准曲线的绘制:将色谱纯的样品(甘油、1,3-丙二醇、葡萄糖、木糖)分别配制成0.01 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L浓度的溶液,在每次检测时与样品一起进行色谱分析,绘制浓度-峰面积标准曲线;
样品处理:取1 mL酶解液或发酵液,10000 rpm 离心3 min,取上清液用超纯水稀释相应的倍数,然后使用0.22 μm的尼龙水系滤芯将上清液过滤至进样瓶,用液相色谱测定上述物质的含量。
实施例中使用的培养基配方如下:
肺炎克雷伯菌种子培养基:甘油20 g/L,酵母浸粉7 g/L,K2HPO4•3H2O 7 g/L,KH2PO42g/L,(NH4)2SO41.25g/L,MgSO4•7H2O 0.1 g/L,微量元素1.0 mL/L(CaCl2•2H2O 3.2mg/L,ZnCl23.8 mg/L,FeCl3•6H2O 30mg/L,MnCl2•4H2O 11.4 mg/L,CuCl2•2H2O 0.96 mg/L,CoCl2•6H2O 2.64 mg/L,H3BO40.35mg/L,NaMoO4•2H2O 24.5 μg/L)。
发酵培养基:甘油为10-20 g/L,酒糟酶解液4-10 g/L,酵母浸粉7 g/L,K2HPO4•3H2O 7 g/L,KH2PO42g/L,(NH4)2SO41.25g/L,MgSO4•7H2O 0.1 g/L,微量元素1.0 mL/L,微量元素溶液和种子培养基中的微量元素溶液成分相同。
补料培养基:甘油为10-20 g/L,酒糟酶解液4-10 g/L,(NH4)2SO41.25 g/L。
实施例中同批次不同摇瓶的发酵结果差距在±1%以内。
实施例1 此实施例用于说明微波-漆酶对酒糟预处理后制备酶解液的方法
称取干燥粉碎后的酒糟10 g 置于250 mL三角瓶中,然后加入60 mL 乙酸缓冲液(pH 4.5-5.5),混合搅拌均匀后置于微波消解仪中,在微波功率为350 W条件下处理 6min。取出微波处理后的物料,放至室温,然后按照固体浓度为8%加入65 mL 乙酸缓冲液(pH4.5-5.5),按照2 mg/g干酒糟的添加量加入漆酶溶液,置于50℃摇床中反应4 h。取出预处理后的物料,加入纤维素酶和淀粉酶,添加量分别为20 mg/g干酒糟和10 mg/g干酒糟,置于55℃、180rpm的摇床中反应24 h,酶解结束后,取1mL酶解液检测葡萄糖和木糖的浓度,分别为22.56 g/L和2.63 g/L。
对比例1
与实施例1相比,区别仅在于取消微波-漆酶对酒糟预处理,具体方法为:称取干燥粉碎后的酒糟10 g 置于250 mL三角瓶中,然后加入125 mL 乙酸缓冲液(pH 4.5-5.5),混合搅拌均匀后加入纤维素酶和淀粉酶,添加量分别为20 mg/g干酒糟和10 mg/g干酒糟,置于55℃、180rpm的摇床中反应24 h,酶解结束后,取1mL酶解液检测葡萄糖和木糖的浓度,分别为14.21 g/L和1.41 g/L。
对比例2
与实施例1相比,区别仅在于将先微波处理再漆酶处理的顺序替换为先漆酶处理再微波处理的顺序,具体方法为:称取干燥粉碎后的酒糟10 g 置于250 mL三角瓶中,然后加入60 mL 乙酸缓冲液(pH 4.5-5.5),按照2 mg/g干酒糟的添加量加入漆酶溶液,混合搅拌均匀后置于50℃摇床中反应4 h。取出漆酶处理后的物料,然后按照固体浓度为8%加入65mL 乙酸缓冲液(pH 4.5-5.5),置于微波消解仪中,在微波功率为350 W条件下处理 6 min。放至室温,加入纤维素酶和淀粉酶,添加量分别为20 mg/g干酒糟和10 mg/g干酒糟,置于55℃、180rpm的摇床中反应24 h,酶解结束后,取1mL酶解液检测葡萄糖和木糖的浓度,分别为16.97 g/L和1.57 g/L。
通过实施例1与对比例1、2比较,可以看到微波辅助漆酶预处理后的酒糟在酶解后,葡萄糖和木糖产量分别提高了58.76%和86.52%。这说明微波辅助漆酶预处理能够显著提高酒糟酶解后可发酵糖的产量。
实施例2 此实施例用于说明酒糟酶解液与甘油共同发酵生产1,3-丙二醇的方法
设置4组实验,甘油浓度分别为10g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L,酶解液浓度分别为10 g/L、8 g/L、6 g/L、4 g/L;将实施例1中酶解结束后的酶解液在10000 rpm条件下离心10min,然后将上清液转移至漏斗中,除去沉淀,滤液为澄清的酒糟酶解液,然后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24 h。将酒糟酶解液与发酵培养基中其他成分(甘油除外)混合后,接种2%肺炎克雷伯菌种子液培养6 h,加入甘油继续培养6h后开始第一次补料,然后每12 h 补料一次,发酵60 h。4次补料之后体系中的甘油总浓度分别为 42.85 g/L、52.42g/L、60 g/L、68.57 g/L,酶解液的总浓度分别为42.85 g/L、34.28 g/L、25.7 g/L、18.56 g/L,发酵结束后,取1 mL 发酵液检测1,3-丙二醇的浓度,分别为14.73 g/L、24.67 g/L、16.32g/L、14.66g/L。
对比例3
与实施例2相比,区别仅在于将酒糟酶解液替换为等量的葡萄糖,具体方法为:
设置4组实验,甘油浓度分别为10 g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L,葡萄糖浓度分别为10 g/L、8 g/L、6 g/L、4 g/L;在发酵培养基(未加甘油)与对应浓度的葡萄糖溶液混合后,接种2%肺炎克雷伯菌种子液培养6 h,加入甘油继续培养6 h后开始第一次补料,然后每12 h 补料一次,发酵60 h。4次补料之后体系中的甘油总浓度分别为 42.85 g/L、52.42g/L、60 g/L、68.57 g/L,酶解液的总浓度分别为42.85g/L、34.28 g/L、25.7 g/L、18.56 g/L,发酵结束后,取1 mL 发酵液检测1,3-丙二醇的浓度,分别为14.15 g/L、16.58g/L、12.64g/L、12.37g/L。
对比例4
与实施例2相比,区别在于碳源只有甘油,具体方法为:发酵培养基中甘油浓度为20 g/L,补料培养基中,甘油浓度也为20 g/L;在发酵培养基(未加甘油)中,接种2%肺炎克雷伯菌种子液培养6 h,加入甘油继续培养6 h后开始第一次补料,然后每12 h 补料一次,发酵60 h。4次补料之后,体系中甘油总浓度为85.7 g/L。发酵结束后,取1mL 发酵液检测1,3-丙二醇的浓度,为16.85 g/L。
通过实施例2和对比例3、4比较,可以看到酒糟酶解液与甘油作为共同碳源发酵生产1,3-丙二醇时,当培养基中酒糟酶解液浓度为8 g/L,甘油浓度为12 g/L时,1,3-丙二醇的摇瓶发酵产量为24.67 g/L,比只有甘油作为碳源时的产量提高了46.41%,并且甘油的用量减少了40%。这说明酒糟酶解液与甘油作为共同碳源发酵生产1,3-丙二醇时,能够提高1,3-丙二醇的产量,降低甘油的用量。该方案使用更为廉价的白酒工业废弃物作为甘油的替代碳源,既提高了1,3-丙二醇的产量,又减少了甘油的用量,降低了生产成本,并且还减少了对环境的污染和资源的浪费。
本发明以酒糟酶解液与甘油为碳源发酵生产1,3-丙二醇在技术上是完全可行的,既减少了甘油的用量,又提高了1,3-丙二醇的产量,是一种降低1,3-丙二醇工业化生产成本的新途径。
综上所述,在不违背本发明创造的思想,对本发明的各种不同实施例进行任意组合,均应当视为本发明公开的内容;在本发明的技术构思范围内,对技术方案进行多种简单的变型及不同实施例进行的不违背本发明创造的思想的任意组合,均应在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.利用酒糟酶解液生产1,3-丙二醇的方法,其特征在于,包含以下步骤: 向经过预处理的酒糟中加入纤维素酶20 mg/g干酒糟和淀粉酶10 mg/g干酒糟,在55℃条件下酶解24h,离心过滤后取上清液,调节pH为6-7后作为酒糟酶解液;
将酒糟酶解液与发酵培养基混合,接种2%经过活化的肺炎克雷伯菌种子液发酵6h后,加入甘油继续发酵6h后,进行第一次补料,每12 h补料一次,发酵60 h,检测并分离1,3-丙二醇;
对酒糟的预处理方法为:
将干燥的酒糟粉碎后加入pH 4.5-5.5的乙酸缓冲液混合均匀为第一混合溶液;
对第一混合溶液使用微波处理6min,微波处理的功率350 W,冷却至室温后再加入缓冲液混合均匀为第二混合溶液;
向第二混合溶液中加入漆酶2 mg/g干酒糟,在50℃条件下反应4 h;
所述发酵培养基中酒糟酶解液浓度为8 g/L,甘油浓度为12 g/L。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,肺炎克雷伯菌的活化方法为:
将肺炎克雷伯菌接种到液体培养基中,37 ℃ 培养8-12 h获得肺炎克雷伯菌种子液。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述补料的成分为:甘油浓度10-20 g/L、酒糟酶解液浓度4-10 g/L、(NH4)2SO4 浓度1.25g/L;完成补料后体系中甘油浓度为40-70g/L,酒糟酶解液浓度15-45g/L。
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