CN104762239A - 一种克雷伯氏肺炎杆菌及其应用和一种生产1,3-丙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵领域，公开了一种克雷伯氏肺炎杆菌，该克雷伯氏肺炎杆菌的保藏号为CCTCC NO：M 2015108。本发明还公开了所述克雷伯氏肺炎杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用。本发明还公开了一种生产1,3-丙二醇的方法，该方法包括：将本发明所述的克雷伯氏肺炎杆菌进行发酵培养以产生1,3-丙二醇。利用本发明的保藏号为CCTCC NO：M 2015108的克雷伯氏肺炎杆菌，以甘油为原料生产1,3-丙二醇时，能够明显降低副产物乳酸和乙醇的浓度，明显提高甘油向1,3-丙二醇的转化率和生产强度。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体地，涉及一种克雷伯氏肺炎杆菌及其应用和一种生产1,3-丙二醇的方法。
背景技术
1,3-丙二醇是一种重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂、合成聚酯的单体以及合成其他化学品的原料，特别是用作合成聚对苯二甲酸丙二酯的单体，其中，聚对苯二甲酸丙二酯是一种性能优良的聚酯材料，有着广阔的应用前景。目前1,3-丙二醇的生产成本相对较高，限制了聚对苯二甲酸丙二酯的推广应用，且1,3-丙二醇的工业化生产主要采用化学合成法。近年来已研发了通过生物法合成1,3-丙二醇的技术，其中，生物法合成1,3-丙二醇利用甘油等可再生资源，具有绿色环保等优势，为1,3-丙二醇的工业化生产提供了一种新的选择。
美国杜邦公司开发了一种利用大肠杆菌工程菌株以葡萄糖为原料发酵生产1,3-丙二醇的方法。将来源于酵母的甘油合成途径与来源于克雷伯氏肺炎杆菌的1,3-丙二醇合成途径转入大肠杆菌，该工程菌株利用葡萄糖为原料，可以直接合成1,3-丙二醇，并利用生产的1,3-丙二醇合成聚对苯二甲酸丙二酯，该技术获得2003年美国总统绿色化学奖。
自然界中很多野生微生物利用甘油为原料可以发酵合成1,3-丙二醇，包括丁酸梭菌、柠檬酸菌、克雷伯氏肺炎杆菌、克雷伯氏产酸杆菌等。由于克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇具有产物浓度高，生产强度大等优点，是广泛关注的一种1,3-丙二醇生产菌株。但是克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油发酵合成1,3-丙二醇的过程中，还同时合成琥珀酸、乳酸、乙酸、2,3-丁二醇、乙醇等副产物，影响甘油向1,3-丙二醇的转化率和生产强度，同时也为1,3-丙二醇的分离提取带来负担。利用现有技术中已有的克雷伯氏肺炎杆菌发酵合成1,3-丙二醇时，甘油向1,3-丙二醇的转化率一般仅为0.30-0.42g/g，生产强度一般仅为1.0-1.8g/(L·h)，甘油向1,3-丙二醇的转化率和生产强度都有待提高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种克雷伯氏肺炎杆菌及其应用和一种生产1,3-丙二醇的方法，采用本发明的克雷伯氏肺炎杆菌发酵合成1,3-丙二醇时，能够明显降低副产物乳酸和乙醇的浓度，明显提高甘油向1,3-丙二醇的转化率和生产强度。
为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的筛选实验，结果筛选到一株在发酵合成1,3-丙二醇时，能够明显降低副产物乳酸和乙醇的浓度，明显提高甘油向1,3-丙二醇的转化率和生产强度的克雷伯氏肺炎杆菌，因此，第一方面，本发明提供了一种克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，所述克雷伯氏肺炎杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M 2015108。
第二方面，本发明提供了上述克雷伯氏肺炎杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用。
第三方面，本发明提供了一种生产1,3-丙二醇的方法，所述方法包括：将上述克雷伯氏肺炎杆菌进行发酵培养以产生1,3-丙二醇。
利用本发明的保藏号为CCTCC NO：M 2015108的克雷伯氏肺炎杆菌，以甘油为原料生产1,3-丙二醇时，甘油向1,3-丙二醇的转化率可高达0.54g/g，生产强度可高达2.59g/(L·h)，能够明显降低副产物乳酸和乙醇的浓度，明显提高甘油向1,3-丙二醇的转化率和生产强度，且能够大大降低分离提取1,3-丙二醇的负担。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)于2015年3月13日被保藏在中国典型培养物保藏中心(缩写为CCTCC，地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学,中国典型培养物保藏中心，邮政编码：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015108。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一种克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)，该克雷伯氏肺炎杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2015108。
其中，本发明的克雷伯氏肺炎杆菌的分离过程可以包括：采集江苏省张家港市水稻种植田地表以下20厘米处的土壤样品50-60g，用200-250ml蒸馏水悬浮混匀，将混合样品自然沉降1-2小时，然后取上清液100-150ml，在4000-6000rpm下离心20-30分钟，倒去上清液，用5-10ml无菌水重悬沉淀。将沉淀悬液涂布于固体培养基，在30-37℃培养24小时。
对于固体培养基的组成没有特别的限定，可以为本领域常用的各种固体培养基，优选情况下，以1L固体培养基计，所述固体培养基组成为：甘油40g，K2HPO4·3H2O 3.20g，KH2PO4 1.20g，NH4Cl 2.85g，Na2SO4 0.28g，MgSO4·7H2O 0.10g，柠檬酸0.42g，酵母膏2.00g和琼脂粉20g。
培养24小时后，挑选20-30个无绒毛、透亮、直径为1-2mm的菌落。挑取各菌落并分别接入至500ml锥形瓶中进行培养，每个锥形瓶中均装有100-150ml发酵培养基，且均加有0.5-1g无菌碳酸钙。培养时，恒温振荡器转速为150-250rpm，温度为30-37℃，发酵培养12小时后，通过气相色谱仪和液相色谱仪对每个锥形瓶中的发酵液中的产物和副产物进行分析。
其中，以1L发酵培养基计，发酵培养基的组成为：甘油40g，K2HPO4·3H2O 3.20g，KH2PO4 1.20g，NH4Cl 2.85g，Na2SO4 0.28g，MgSO4·7H2O 0.10g，柠檬酸0.42g，酵母膏2.00g和微量元素0.3mL，其中，以1L微量元素计，微量元素的组成为：ZnCl2 7.56g，FeCl3·6H2O 15.65g，MnCl2·4H2O 6.28g，CuCl2·2H2O 1.32g，CoCl2·6H2O 6.42g，H3BO3 0.48g和Na2MoO4·2H2O 3.22g。
其中，气相色谱仪(型号为GC-2014C，购自日本岛津公司)，色谱柱采用毛细管柱AT.SE-54(30m×0.53mm×1.0μm)，FID检测器，N2载气，柱温为120℃，检测器温度为250℃。
液相色谱仪(型号为LC-20A，购自日本岛津公司)，色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-Aq(4.6mm×150mm×5μm)，流动相为0.005mol/L H2SO4，流速为1.0ml/min，柱温箱为65℃。
其中，一个锥形瓶中的发酵液的检测结果为：甘油为11.1g/L，1,3-丙二醇为16.3g/L，2,3-丁二醇为0.4g/L，乙醇为0.1g/L，乳酸为0.4g/L，乙酸为0.5g/L，琥珀酸为0.1g/L。原料甘油向1,3-丙二醇的转化率为0.56g/g。甘油向1,3-丙二醇的转化率的计算公式为：
将该菌落提取菌株总DNA，进行16sRNA基因序列分析，其16sRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，结果表明该菌为克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)，命名为克雷伯氏肺炎杆菌HM-B2。将该克雷伯氏肺炎杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2015108。
第二方面，本发明提供了上述克雷伯氏肺炎杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用。
第三方面，本发明提供了一种生产1,3-丙二醇的方法，所述方法包括：将上述克雷伯氏肺炎杆菌进行发酵培养以产生1,3-丙二醇。
本发明的生产1,3-丙二醇的方法中，对于发酵培养的方式没有特别的限定，可以为本领域常用的各种发酵培养方式，优选情况下，发酵培养的方式包括：将上述克雷伯氏肺炎杆菌接种于以甘油为碳源的发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养的条件包括：温度为30-37℃，发酵液pH为6-7，发酵时间为12-32小时。进一步优选地，所述发酵培养在发酵罐中进行，发酵培养的条件还包括：搅拌速度为150-250rpm，通气量为0.5-2.0VVM。
本发明的生产1,3-丙二醇的方法中，在发酵培养时，对于调节发酵液pH的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，只要能够将发酵液pH调节为6-7即可。优选情况下，发酵液的pH通过加入碱溶液来调节，进一步优选地，所述碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水。
本发明的生产1,3-丙二醇的方法中，对于以甘油为碳源的发酵培养基的组成没有特别的限定，可以为本领域常用的各种以甘油为碳源的发酵培养基，优选情况下，以1L发酵培养基计，所述以甘油为碳源的发酵培养基的组成为：甘油40g，K2HPO4·3H2O 3.20g，KH2PO4 1.20g，NH4Cl 2.85g，Na2SO4 0.28g，MgSO4·7H2O 0.10g，柠檬酸0.42g，酵母膏2.00g和微量元素0.3mL，其中，以1L微量元素计，微量元素的组成为：ZnCl2 7.56g，FeCl3·6H2O 15.65g，MnCl2·4H2O 6.28g，CuCl2·2H2O 1.32g，CoCl2·6H2O 6.42g，H3BO3 0.48g和Na2MoO4·2H2O 3.22g。
本发明的生产1,3-丙二醇的方法中，为了进一步降低副产物乳酸和乙醇的浓度，并进一步提高甘油向1,3-丙二醇的转化率和生产强度，优选情况下，发酵的条件还包括：在发酵第4-32小时，相对于每1升的发酵液，补加120-150g的甘油。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的生产1,3-丙二醇的方法中，为了进一步降低副产物乳酸和乙醇的浓度，并进一步提高甘油向1,3-丙二醇的转化率和生产强度，本发明的克雷伯氏肺炎杆菌在被接种至以甘油为碳源的发酵培养基中之前，将克雷伯氏肺炎杆菌进行种子培养，然后再将菌种接入以甘油为碳源的发酵培养基中，即，接种于以甘油为碳源的发酵培养基的克雷伯氏肺炎杆菌为经过了种子培养的克雷伯氏肺炎杆菌。种子培养的培养程度可以通过OD(optical density)值测定对克雷伯氏肺炎杆菌的生长进行观察，当测定OD值达到4.5时停止培养，将此时的种子液(即含有克雷伯氏肺炎杆菌的培养液)称为成熟种子液，然后再将成熟种子液接入以甘油为碳源的发酵培养基中。本发明中，对于将克雷伯氏肺炎杆菌接种于以甘油为碳源的发酵培养基中进行发酵培养时克雷伯氏肺炎杆菌的接种量没有特别的限定，可以为本领域常规的各种接种量，优选情况下，以每升以甘油为碳源的发酵培养基为基准，克雷伯氏肺炎杆菌的接种量为4-10体积％。其中，克雷伯氏肺炎杆菌的接种量为4-10体积％，指的是接入以甘油为碳源的发酵培养基中的成熟种子液的体积占接入成熟种子液前发酵培养基体积的4-10％。
本发明的生产1,3-丙二醇的方法中，对于种子培养的条件没有特别的限定，可以为本领域对克雷伯氏肺炎杆菌进行种子培养的各种常规条件，优选情况下，种子培养的条件包括：温度为35-37℃，培养时间为10-12小时，培养装置的转速为200-250rpm。其中，对于种子培养采用的培养基的组成没有特别的限定，可以为本领域常用的各种用于种子培养的培养基，优选情况下，以1L培养基计，种子培养采用的培养基的组成为：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO42.0g和玉米浆干粉4.0g。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖10.0，(NH4)2SO42.0，玉米浆干粉4.0。
发酵培养基组成为(g/L)：甘油40，K2HPO4·3H2O 3.20，KH2PO4 1.20，NH4Cl 2.85，Na2SO4 0.28，MgSO4·7H2O 0.10，柠檬酸0.42，酵母膏2.00，微量元素0.3mL。其中，微量元素为(g/L)：ZnCl2 7.56，FeCl3·6H2O 15.65，MnCl2·4H2O 6.28，CuCl2·2H2O 1.32，CoCl2·6H2O 6.42，H3BO3 0.48，Na2MoO4·2H2O 3.22。
OD值测定：将取样的培养液进行10倍稀释，采用722可见光分光光度计，在波长600纳米下测定吸光值。
甘油向1,3-丙二醇的转化率的计算公式为：
1,3-丙二醇的生产强度的计算公式为：
实施例1
本实施例用于说明利用本发明的克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇的方法。
将保藏号为CCTCC NO：M 2015108的克雷伯氏肺炎杆菌接入装有150ml种子培养基的500ml锥形瓶中进行种子培养，恒温振荡器的转速为200rpm，温度为37℃，培养过程中每隔120分钟取样并测定OD值，当OD值达到4.5时停止培养，此时培养时间为12小时。
将培养12小时的含有克雷伯氏肺炎杆菌的培养液接种到5L发酵罐中，其中，发酵罐中发酵培养基的装液量为2L，克雷伯氏肺炎杆菌的接种量为10体积％，发酵培养时，搅拌桨的转速为250rpm，发酵培养温度为30℃，发酵培养过程中用KOH溶液控制发酵液的pH为7，通气量为2.0VVM。在发酵培养第4-32小时时，补加甘油518g(相对于每1升的发酵液，补加150g甘油)，发酵32小时结束，发酵结束时发酵液体积3.45L。
通过气相色谱仪和液相色谱仪对发酵液中的产物和副产物进行分析。其中，气相色谱仪(型号为GC-2014C，购自日本岛津公司)，色谱柱采用毛细管柱AT.SE-54(30m×0.53mm×1.0μm)，FID检测器，N2载气，柱温为120℃，检测器温度为250℃。液相色谱仪(型号为LC-20A，购自日本岛津公司)，色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-Aq(4.6mm×150mm×5μm)，流动相为0.005mol/L H2SO4，流速为1.0ml/min，柱温箱为65℃。检测结果为：甘油为27.2g/L，1,3-丙二醇为79.3g/L，2,3-丁二醇为15.3g/L，乙醇为0.7g/L，乳酸为0.7g/L，乙酸为9.8g/L，琥珀酸为5.5g/L。原料甘油向1,3-丙二醇的转化率为0.54g/g，生产强度为2.48g/(L·h)。
实施例2
本实施例用于说明利用本发明的克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇的方法。
将保藏号为CCTCC NO：M 2015108的克雷伯氏肺炎杆菌接入装有300ml种子培养基的1000ml锥形瓶中进行种子培养，恒温振荡器的转速为250rpm，温度为35℃，培养过程中每隔120分钟取样并测定OD值，当OD值达到4.5时停止培养，此时培养时间为10小时。
将培养10小时的含有克雷伯氏肺炎杆菌的培养液接种到100L发酵罐中，其中，发酵罐中发酵培养基的装液量为60L，克雷伯氏肺炎杆菌的接种量为4体积％，发酵培养时，搅拌桨的转速为150rpm，发酵培养温度为37℃，发酵培养过程中用NaOH溶液控制发酵液的pH为6，通气量为1.0VVM。在发酵培养第4-30小时时，补加甘油13.04kg(相对于每1升的发酵液，补加138g甘油)，发酵30小时结束，发酵结束时发酵液体积94.5L。
通过实施例1中所述的气相色谱仪和液相色谱仪对发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：甘油为18.2g/L，1,3-丙二醇为77.6g/L，2,3-丁二醇为14.6g/L，乙醇为0.8g/L，乳酸为0.6g/L，乙酸为8.9g/L，琥珀酸为5.2g/L。原料甘油向1,3-丙二醇转化率为0.53g/g，生产强度为2.59g/(L·h)。
实施例3
本实施例用于说明利用本发明的克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇的方法。
将保藏号为CCTCC NO：M 2015108的克雷伯氏肺炎杆菌接入装有300ml种子培养基的1000ml锥形瓶中进行种子培养，恒温振荡器的转速为200rpm，温度为37℃，培养过程中每隔120分钟取样并测定OD值，当OD值达到4.5时停止培养，此时培养时间为12小时。
将培养12小时的含有克雷伯氏肺炎杆菌的培养液接种到100L发酵罐中，其中，发酵罐中发酵培养基的装液量为60L，克雷伯氏肺炎杆菌的接种量为6体积％，发酵培养时，搅拌桨的转速为200rpm，发酵培养温度为35℃，发酵培养过程中用氨水控制发酵液的pH为6.5，通气量为0.5VVM。在发酵培养第4-30小时时，补加甘油11.12kg(相对于每1升的发酵液，补加120g甘油)，发酵30小时结束，发酵结束时发酵液体积92.5L。
通过实施例1中所述的气相色谱仪和液相色谱仪对发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：甘油为5.8g/L，1,3-丙二醇为75.4g/L，2,3-丁二醇为13.7g/L，乙醇为0.6g/L，乳酸为0.5g/L，乙酸为7.8g/L，琥珀酸为4.9g/L。原料甘油向1,3-丙二醇转化率为0.54g/g，生产强度为2.51g/(L·h)。
对比例
本对比例用于说明采用现有的克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇的方法。
按照实施例1的方法，不同的是，将保藏号为DSM 25855的克雷伯氏肺炎杆菌代替本发明的保藏号为CCTCC NO：M 2015108的克雷伯氏肺炎杆菌。在发酵培养第4-32小时时，补加甘油532g(相对于每1升的发酵液，补加150g甘油)，发酵32小时结束，发酵结束时发酵液体积3.55L。
通过实施例1中所述的气相色谱仪和液相色谱仪对发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：甘油为35.2g/L，1,3-丙二醇为56.2g/L，2,3-丁二醇为11.4g/L，乙醇为6.4g/L，乳酸为12.3g/L，乙酸为8.5g/L，琥珀酸为5.5g/L。原料甘油向1,3-丙二醇转化率为0.41g/g，生产强度为1.76g/(L·h)。
将实施例1与对比例1的检测结果比较可知，利用本发明的保藏号为CCTCC NO：M 2015108的克雷伯氏肺炎杆菌，以甘油为原料生产1,3-丙二醇时，能够明显降低副产物乳酸和乙醇的浓度，明显提高甘油向1,3-丙二醇的转化率和生产强度。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (9)
1.一种克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，其特征在于，所述克雷伯氏肺炎杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2015108。
2.权利要求1所述的克雷伯氏肺炎杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用。
3.一种生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的克雷伯氏肺炎杆菌进行发酵培养以产生1,3-丙二醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述发酵培养的方式包括：将权利要求1所述的克雷伯氏肺炎杆菌接种于以甘油为碳源的发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养的条件包括：温度为30-37℃，发酵液pH为6-7，发酵时间为12-32小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，以每升以甘油为碳源的发酵培养基为基准，克雷伯氏肺炎杆菌的接种量为4-10体积％。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述发酵液的pH通过加入碱溶液来调节，优选地，所述碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，以1L发酵培养基计，所述以甘油为碳源的发酵培养基的组成为：甘油40g，K2HPO4·3H2O 3.20g，KH2PO41.20g，NH4Cl 2.85g，Na2SO40.28g，MgSO4·7H2O 0.10g，柠檬酸0.42g，酵母膏2.00g，微量元素0.3mL；其中，以1L微量元素计，所述微量元素的组成为：ZnCl27.56g，FeCl3·6H2O 15.65g，MnCl2·4H2O 6.28g，CuCl2·2H2O1.32g，CoCl2·6H2O 6.42g，H3BO30.48g，Na2MoO4·2H2O 3.22g。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述发酵的条件还包括：在发酵第4-32小时，相对于每1升的发酵液，补加120-150g的甘油。
9.根据权利要求4-8中任意一项所述的方法，其中，接种于以甘油为碳源的发酵培养基的克雷伯氏肺炎杆菌为经过了种子培养的克雷伯氏肺炎杆菌；优选地，所述种子培养的条件包括：温度为35-37℃，培养时间为10-12小时，培养装置的转速为200-250rpm。
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