CN107629980B - 一株产石杉碱甲和石杉碱乙的路德维希肠杆菌sxz-n5菌株及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株产石杉碱甲和石杉碱乙的路德维希肠杆菌SXZ‑N5菌株，该菌株可产石杉碱甲和石杉碱乙。该菌株被命名为SXZ‑N5，属一种路德维希肠杆菌，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2017年9月14日，保藏编号为：CCTCC NO：M2017511；该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。上述路德维希肠杆菌SXZ‑N5菌株能够用于发酵制备石杉碱甲和石杉碱乙。微生物发酵条件为：培养基配方：酵母粉4.0g，蛋白胨8.0g/L，氯化钠7.0g/L，葡萄糖9.0g/L，pH 6.0；培养条件：28℃，200r/min，发酵培养10天。

Description

一株产石杉碱甲和石杉碱乙的路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株及 用途

技术领域

本发明涉及一种路德维希肠杆菌菌株，该菌株可产石杉碱甲和石杉碱乙，属于微生物技术领域。

背景技术

目前植物内生菌的研究逐渐受到重视，不同植物的各种内生菌相继被发现。内生菌种类的多样性也赋予了其代谢产物的多样性，这也预示着利用微生物代谢发掘生物、化学、医药等新资源具有巨大的潜力。大量的研究表明，植物内生菌可产生与宿主植物相同或相似的活性物质及前体，这一发现直接推动了植物内生菌尤其是药用植物内生菌研究的广泛展开。随着人们对药用植物内生菌的逐步研究，利用能够代谢产生相应活性成分的内生菌来生产新型、高效、低成本的活性药物，解决珍稀中药植物资源紧缺的现状，必将成为将来药用植物内生菌研究的重点。

蛇足石杉中的药用活性成分石杉碱甲(Huperzine A，HupA)和石杉碱乙(Huperzine B，HupB)是一种低毒、高效抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的药物，其中石杉碱甲对治疗“阿尔茨海默症(老年痴呆症)”(Alzaheimer disease，AD)有很好的疗效。然而，由于蛇足石杉植物资源匮乏且生长缓慢、石杉碱甲含量很低等原因，仅依靠从蛇足石杉提取石杉碱甲无法满足市场需求然而化学合成的石杉碱甲的活性远低于天然石杉碱甲，且得到高光学活性的石杉碱甲成本较高。目前本领域中有一些利用蛇足石杉内生菌进行微生物发酵从而生产石杉碱甲的相关报道，但是这些菌株的种类以及产量还是无法满足市场对于石杉碱甲的需求。

发明内容

本发明解决了背景技术中的问题，提供了一株产石杉碱甲和石杉碱乙的路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株，该菌株可产石杉碱甲和石杉碱乙。

本发明人筛选到一株新型菌株，该菌株被命名为SXZ-N5，属一种路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2017年9月14日，保藏编号为：CCTCC NO：M2017511；该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

上述路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株能够用于发酵制备石杉碱甲和石杉碱乙。微生物发酵条件为：培养基配方：酵母粉4.0g，蛋白胨8.0g/L，氯化钠7.0g/L，葡萄糖9.0g/L，pH6.0；培养条件：28℃，200r/min，发酵培养10天。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所提供的路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株能够代谢产生石杉碱甲和石杉碱乙。本发明提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，且发酵成本较低，又不受时域、季节等条件限制，因此能够通过微生物发酵的途径解决石杉碱甲成本较高、市场需求缺口大的现状。同时本发明中还提供了优化后的微生物发酵条件以及培养基的配方，石杉碱甲和石杉碱乙的产量较高。

附图说明

图1为路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株第一次HPLC检测图；

图2为路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株第二次HPLC检测图；

图3为路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株的石杉碱甲的MS检测图；

图4为路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株的石杉碱乙的MS检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

菌株的分离、培养

本实施例中将蛇足石杉材料用清水冲洗干净后，再用清水超声10min，分离其叶、茎并切割成约4cm小段，依次在0.1％升汞浸泡4min、70％乙醇中浸泡2分钟，5％次氯酸钠浸泡5分钟，之后用无菌水多次冲洗，无菌条件下将其研磨成匀浆，在每个不含抗生素的PDA平板上取200μl匀浆涂布，30℃静置培养1-2d。培养过程中根据细菌生长情况随机挑取20处菌落，接至新的LA培养基，并经过多次平板划线法分离传代获得各单克隆，编号并保种。

将平板上纯化完成的细菌挑取至装有600μL LB液体培养基的1.5mL EP管中，封口膜封口，然后于37℃恒温摇床中190r/min摇床培养1d后，加入等体积的50％的甘油，混匀后于-80℃超低温冰箱中保存，每个菌株至少保存3份。

将保存的菌种取10μL接种到5mL LB液体培养基中，于37℃恒温摇床150r/min活化培养，24h后取3mL活化的菌种至三角瓶中的LB液体培养基中进行发酵，装液量60mL/100mL，37℃、150r/min摇床培养7d。经过以上发酵培养后，收集发酵液。

菌株的筛选

本实施例中将上述收集得到的菌株通过高效液相色谱法(HPLC)初筛和复筛检测各个内生细菌的发酵提取物后，利用质谱法(Mass Spectrometry，MS)进一步确认。分离得到了一株能够产石杉碱甲和石杉碱乙的菌株，将其命名为：SXZ-N5菌株。

HPLC初筛：色谱仪为ultimate-3000色谱系统，ODS-C18反相柱(4.6mm×150mm，5μm，Agilent)，流动相为甲醇：水＝65:35；标准品浓度为100μg/mL，流速为0.5mL/min，紫外波长设定为310nm，柱温为20℃，检测结果如图1所示。

HPLC复筛：改变流动相为甲醇：水＝55:45，其它条件不变。检测结果如图2所示。

质谱分析在中南民族大学化材学院测试分析中心采用液相色谱-质谱联用分析仪/Agilent LC-Q-TOF-MS 6520系统完成。其中，路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株发酵的石杉碱甲的MS检测图如图3所示，路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株发酵的石杉碱乙的MS检测图如图4所示。

测序及序列比对、分析

将该菌株送某生物技术有限公司测序，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。测序结果在GenBank核酸数据库中进行Blast相似性分析，经Blast序列比对及进化树分析，确定其为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)的细菌。

菌株的保藏：

将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2017年9月14日，保藏编号为：CCTCC NO：M2017511。

发酵条件的优化

微生物的发酵培养基组分必须能够满足菌株快速生长繁殖的需要，同时最适的发酵培养条件又能够保证其次生代谢物的大量积累。本发明初步优化了SXZ-N10菌株的发酵培养基成分以及培养条件，优化后的培养基配方为：酵母粉4.0g，蛋白胨8.0g/L，氯化钠7.0g/L，葡萄糖9.0g/L，pH 6.0；培养条件为：培养温度28℃，摇床转速200r/min，发酵时间10天。

序列表

<110> 中南民族大学

<120> 一株产石杉碱甲和石杉碱乙的路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株及用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1504

<212> DNA

<213> 路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)

<400> 1

tacggttacc ttgttacgac ttcaccccag tcatgaatca caaagtggta agcgccctcc 60

cgaaggttaa gctacctact tcttttgcaa cccactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt 120

acaaggcccg ggaacgtatt caccgtagca ttctgatcta cgattactag cgattccgac 180

ttcacggagt cgagttgcag actccgatcc ggactacgac gcactttatg aggtccgctt 240

gctctcgcga ggtcgcttct ctttgtatgc gccattgtag cacgtgtgta gccctactcg 300

taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc agtttatcac tggcagtctc 360

ctttgagttc ccggccgaac cgctggcaac aaaggataag ggttgcgctc gttgcgggac 420

ttaacccaac atttcacaac acgagctgac gacagccatg cagcacctgt ctcagagttc 480

ccgaaggcac caaagcatct ctgctaagtt ctctggatgt caagagtagg taaggttctt 540

cgcgttgcat cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcatt 600

tgagttttaa ccttgcggcc gtactcccca ggcggtcgac ttaacgcgtt agctccggaa 660

gccactcctc aagggaacaa cctccaagtc gacatcgttt acggcgtgga ctaccagggt 720

atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg cacctgagcg tcagtctttg tccagggggc 780

cgccttcgcc atcggtattc ctccagatct ctacgcattt caccgctaca cctggaattc 840

tacccccctc tacaagactc tagcctgcca gtttcgaatg cagttcccag gttaagcccg 900

gggatttcac atccgacttg acagaccgcc tgcgtgcgct ttacgcccag taattccgat 960

taacgcttgc accctccgta ttaccgcggc tgctggcacg gagttagccg gtgcttcttc 1020

tgcgggtaac gtcaatcggt gaagttatta actccaccgc cttcctcccc gctgaaagta 1080

ctttacaacc cgaaggcctt cttcatacac gcggcatggc tgcatcaggc ttgcgcccat 1140

tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg accgtgtctc agttccagtg 1200

tggctggtca tcctctcaga ccagctaggg atcgtcgcct aggtgagcca ttaccccacc 1260

tactagctaa tcccatctgg gcacatccga tggtgtgagg cccgaaggtc ccccactttg 1320

gtcttgcgac gttatgcggt attagctacc gtttccagta gttatccccc tccatcgggc 1380

agtttcccag acattactca cccgtccgcc actcgtcacc cgagagcaag ctctctgtgc 1440

taccgttcga cttgcatgtg ttaggcctgc cgccagcgtt caatctgagc catgatcaaa 1500

ctct 1504

Claims (3)

1.一株产石杉碱甲和石杉碱乙的路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)SXZ-N5菌株，该菌株的保藏编号为：CCTCC NO：M2017511，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述路德维希肠杆菌SXZ-N5菌株的用途，其特征在于：用于发酵制备石杉碱甲和石杉碱乙。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：微生物发酵条件为：培养基配方：酵母粉4.0g，蛋白胨8.0g/L，氯化钠7.0g/L，葡萄糖9.0g/L，pH 6.0；培养条件：28℃，200r/min，发酵培养10天。