CN109749965B - 一株产石杉碱甲的枯草芽孢杆菌qnx-7hl菌株及用途 - Google Patents
一株产石杉碱甲的枯草芽孢杆菌qnx-7hl菌株及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种产石杉碱甲的枯草芽孢杆菌QNX‑7HL菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年2月26日，保藏编号为：CCTCC M2019114；该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。上述枯草芽孢杆菌QNX‑7HL菌株能够用于发酵制备石杉碱甲。微生物发酵条件为：酵母粉5g/L，蛋白胨8g/L，氯化钠3g/L，pH 7.0；培养条件为：37℃，150r/min，发酵培养7天，该条件下该菌株的石杉碱甲产量为0.44mg/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌株，该菌株可产石杉碱甲，属于微生物技术领域。
背景技术
目前植物内生菌的研究逐渐受到重视，不同植物的各种内生菌相继被发现。内生菌种类的多样性也赋予了其代谢产物的多样性，这也预示着利用微生物代谢发掘生物、化学、医药等新资源具有巨大的潜力。大量的研究表明，植物内生菌可产生与宿主植物相同或相似的活性物质及前体，这一发现直接推动了植物内生菌尤其是药用植物内生菌研究的广泛展开。随着人们对药用植物内生菌的逐步研究，利用能够代谢产生相应活性成分的内生菌来生产新型、高效、低成本的活性药物，解决珍稀中药植物资源紧缺的现状，必将成为将来药用植物内生菌研究的重点。
蛇足石杉中的药用活性成分石杉碱甲(Huperzine A，HupA)和石杉碱乙(HuperzineB，HupB)是一种低毒、高效抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的药物，其中石杉碱甲对治疗“阿尔茨海默症(老年痴呆症)”(Alzaheimer disease，AD)有很好的疗效。然而，由于蛇足石杉植物资源匮乏且生长缓慢、石杉碱甲含量很低等原因，仅依靠从蛇足石杉提取石杉碱甲无法满足市场需求。而且，人工化学合成的石杉碱甲的活性远低于天然石杉碱甲，且得到高光学活性的石杉碱甲成本较高。利用内生菌发酵生产石杉碱甲是解决其药源紧缺问题的重要途径之一。目前本领域中有一些产石杉碱甲的蛇足石杉内生菌的相关报道，但是这些菌株的种类以及产量还是无法满足市场对于石杉碱甲的需求。
发明内容
本发明解决了背景技术中的问题，提供了一株产石杉碱甲的枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株，该菌株可产石杉碱甲。
本发明人筛选到一株新型菌株，该菌株被命名为QNX-7HL，属一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年2月26日，保藏编号为：CCTCC M2019114；该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
上述枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株能够用于发酵制备石杉碱甲。微生物发酵条件为：酵母粉5g/L，蛋白胨8g/L，氯化钠3g/L，pH 7.0；培养条件为：37℃，150r/min，发酵培养7天。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所提供的枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株能够代谢产生石杉碱甲。本发明提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，且发酵成本较低，又不受时域、季节等条件限制，因此能够通过微生物发酵的途径解决石杉碱甲成本较高、市场需求缺口大的现状。同时本发明中还提供了优化后的微生物发酵条件以及培养基的配方，该条件下该菌株的石杉碱甲产量为0.44mg/L。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株的石杉碱甲的第一次HPLC检测图；
图2为枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株的石杉碱甲的第二次HPLC检测图；
图3为枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株的石杉碱甲的MS检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
菌株的分离、培养
本实施例中将蛇足石杉材料用清水冲洗干净后，再用清水超声10min，分离其叶、茎并切割成约4cm小段，依次在0.1％升汞浸泡4min、70％乙醇中浸泡2分钟，5％次氯酸钠浸泡5分钟，之后用无菌水多次冲洗，无菌条件下加入适量生理盐水并将植物材料研磨成匀浆，取200μl匀浆涂布在每个不含抗生素的LA平板上，30℃静置培养1-2d。培养过程中，根据细菌生长情况挑取各新长出的菌落至新的LA培养基，并经过多次平板划线法分离传代获得各单克隆，编号并保种。
将平板上纯化完成的细菌挑取至装有600μL LB液体培养基的1.5mL EP管中，封口膜封口，然后于37℃恒温摇床中190r/min摇床培养1d后，加入等体积的50％的甘油，混匀后于-80℃超低温冰箱中保存，每个菌株至少保存3份。
将保存的菌种取10μL接种到5mL LB液体培养基中，于37℃恒温摇床150r/min活化培养24h，取3mL活化的菌种(液)至三角瓶中的LB液体培养基中进行发酵，装液量60mL/100mL，37℃、150r/min摇床培养7d。经过以上发酵培养后，收集发酵液。
菌株的筛选
本实施例中将上述收集得到的菌株，通过高效液相色谱法(HPLC)初筛和复筛检测各个内生细菌的发酵提取物后，利用质谱法(Mass Spectrometry，MS)进一步确认。分离得到了一株能够产石杉碱甲的菌株，将其命名为：QNX-7HL菌株。
HPLC初筛条件：色谱仪为Agilent1200色谱系统，ODS-C18反相柱(4.6mm×150mm，5μm，Agilent)，流动相为甲醇：水＝40:60；标准品浓度为100μg/mL，流速为0.5mL/min，紫外波长设定为310nm，柱温为20℃。枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株发酵液中的石杉碱甲的HPLC初筛检测结果如图1所示。
HPLC复筛条件：色谱仪为Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨液质联用仪，流动相为甲醇：水＝30:70，其它条件同HPLC初筛条件。枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株发酵液中的石杉碱甲的HPLC复筛检测结果如图2所示。
质谱分析由中南民族大学药学院测试分析中心采用Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨液质联用仪完成。枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株发酵液中的石杉碱甲的MS检测结果如图3所示。
测序及序列比对、分析
将该菌株送某生物技术有限公司测序，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。测序结果在GenBank核酸数据库中进行Blast相似性分析，经Blast序列比对及进化树分析，确定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
菌株的保藏：
将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年2月26日，保藏编号为：CCTCC M2019114。
发酵条件的优化
微生物的发酵培养基组分必须能够满足菌株快速生长繁殖的需要，同时最适的发酵培养条件又能够保证其次生代谢物的大量积累。本发明初步优化了QNX-7HL菌株的发酵培养基成分以及培养条件，优化后的培养基配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨8g/L，氯化钠3g/L，pH 7.0；培养条件为：37℃，150r/min，发酵培养7天。
序列表
<110> 中南民族大学
<120> 一株产石杉碱甲的枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株及用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1458
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
tgggaggggc ggctgctata catgcagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120
ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcaaaca taaaaggtgg 180
cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420
agaacaagta ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600
gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720
aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca 1260
aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa cctttaggag ccagccgccg 1440
aaggtgacag agtagtgg 1458
Claims (3)
1.一株产石杉碱甲的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QNX-7HL菌株，该菌株保藏编号为：CCTCC NO:M2019114，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌QNX-7HL菌株的用途，其特征在于：用于发酵制备石杉碱甲。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：发酵条件为：培养基配方：酵母粉5g/L，蛋白胨8g/L，氯化钠3g/L，pH 7.0；培养条件为：37℃，150r/min，发酵培养7天。
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