CN108220192B - 一株泡囊短波单胞菌及其培养方法与应用 - Google Patents

一株泡囊短波单胞菌及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株泡囊短波单胞菌及其培养方法与应用。一株泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1，2017年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.14851。本发明首次公开了具有产PHA功能的泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1，该菌是在经过驯化后的环氧丙烷皂化废水剩余污泥中筛选得到，显著高于现有已知的产PHA的菌株。

Description

一株泡囊短波单胞菌及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一株泡囊短波单胞菌及其培养方法与应用，特别涉及一株泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1及其培养方法与在发酵生产PHA中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
塑料制品是人们日常生活和工农业生产的必需品。广泛使用的石油合成塑料给环境带来严峻的环境污染，消耗了大量不可再生资源。与石油塑料产品不同，生物可降解塑料不会产生有毒有害物质，从生产至降解过程，只释放出二氧化碳和水蒸汽，有的生物降解塑料还可由微生物利用污染物为原料合成，因此生物可降解塑料既避免了传统石油塑料所带来的环境污染问题，又实现了废物处理和资源化利用。
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)是一种生物聚酯，是许多微生物在不平衡生长条件下合成的细胞内能量和碳源储藏性物质。PHA在物理性能上类似于传统的热塑性塑料，除具有高分子化合物的基本性质，如质轻、可塑性、耐磨性、抗紫外线等，还具有生物可降解性和生物相容性。因此它是传统塑料的理想替代品，可减少塑料废弃物对环境的危害。
环氧丙烷(PO)是除聚丙烯和丙烯腈以外丙烯的第三大衍生物，主要用于生产聚醚和丙二醇。目前，中国大陆PO主要生产流程为氯醇法。然而，PO皂化废水pH值高，氯化钙含量高(22-26g/L)和高COD(1200mg/L)。一般来说，市政废水活性污泥不能耐受含氯量高的废水。从PO皂化废水剩余污泥的样品中分离出一株PHA生产菌株，这项工作将为PO皂化废水剩余污泥的利用提供有效的解决方案。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株泡囊短波单胞菌及其培养方法与应用。
本发明采用的技术方案如下：
一株泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1，2017年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.14851。
上述泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1的培养方法，步骤如下：
(1)将泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1接种于固体斜面培养基上，活化培养，制得活化菌体；
(2)将步骤(1)制得的活化菌体接种于种子培养基中，种子培养，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比10～20％的比例接种至发酵培养基中，发酵培养，制得发酵液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，活化培养条件为：28～32℃条件下培养46～50h。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，固体斜面培养基，组分如下，均为重量百分比：
牛肉膏0.3～0.5％、蛋白胨1.0～1.2％、NaCl 0.4～0.6％、琼脂1.5％～2.0％、水余量。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，种子培养条件为：28～32℃、120～200rpm条件下培养38～42h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，种子培养基，每升组分如下：
牛肉膏3～5g，蛋白胨10～12g，NaCl 4～6g，水定容至1L，pH7.0。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，发酵培养条件为：28～30℃、120～200rpm条件下培养44～52h。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，发酵培养基，每升组分如下：
蔗糖10～12g，NH4Cl 0.1～0.3g，MgSO4·7H2O 0.2～0.4g，KH2PO4 2.6～2.8g，CaCl2 0.05～0.07g，FeCl3 0.01～0.03g，ZnSO4 0.01～0.03g，水定容至1L，pH 7.0。
上述泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1在发酵生产微生物PHA中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，发酵过程中的培养基中碳源为蔗糖，氮源为NH4Cl，C/N比为100/1.04。
有益效果
1、本发明首次公开了具有产PHA功能的泡囊短波单胞菌(Brevundimonasvesicularis)UJN1，该菌是在经过驯化后的环氧丙烷皂化废水剩余污泥中筛选得到，其将碳源转化为PHA的效率显著高于现有已知的遗传关系最密切的菌株。
2、本发明所述的泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1，经发酵条件优化后，PHA的合成效率提高了3.0倍，培养基使用蔗糖作为碳源，NH4Cl作为氮源，C/N比为100/1.04，蔗糖为碳源生产PHA的碳源转化率为3.05％，其碳源转化率高于现有已知的泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)LMG P-23615的碳源转化率，并且使用蔗糖为原料可降低生产成本。
附图说明
图1、不同碳源条件下PHA单体3HB和3HV的含量柱状图；
图2、不同氮源条件下PHA单体3HB和3HV的含量柱状图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
本发明提供的菌株泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1，从生产环氧丙烷的山东滨化集团污水处理厂获得活性污泥样品，采用序批式反应器(SBR)和好氧动态补料(ADF)进行为期37天的驯化，取10mL经过驯化的新鲜污泥样品加入到100mL生理盐水的锥形瓶中，反复振荡菌体混合均匀；取菌液稀释至10-2～10-6涂布在初筛培养基上，并在30℃培养箱中培养48h；在362nm波长下挑出发荧光的菌落进行进一步纯化后，进行摇瓶发酵培养，通过测定PHA的含量，筛选PHA产量最高的菌株；
利用Biolog微生物鉴定法和16S rDNA分子测序方法鉴定菌株；用革兰氏染色、氧化酶实验、三糖铁实验对菌株生化性质进行初步判断，然后选择Biolog微生物鉴定条件；用分离菌株的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增16S rDNA，将得到的PCR产物测序，根据测序结果以及GeneBank数据库对比分析，确定菌株。
经检测，分离得到的产PHA菌株为一种泡囊短波单胞菌，其16S rDNA测序结果如SEQ ID NO.1所示，测序得到的碱基数为1318bp；
上述分离得到的菌株在固体培养基(0.3％牛肉膏、1％蛋白胨、0.5％NaCl、1.6％琼脂，余量水，均为质量百分比)中30℃培养48h后其菌落边缘光滑整齐，表面湿润，橙红色；命名为泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1。
上述泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1，2017年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.14851。
实施例2
上述泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1的培养方法，步骤如下：
(1)将泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1接种于固体斜面培养基上，在30℃活化培养48h，制得活化菌体；
所述固体斜面培养基，组分如下，均为重量百分比：
牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、NaCl 0.5％、琼脂1.6％、余量水；
(2)将步骤(1)制得的活化菌体接种于种子培养基中，在30℃、180rpm条件下培养38～42h，制得种子液；
所述种子培养基，每升组分如下：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水定容至1L，pH7.0；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比15％的比例接种至发酵培养基中，在33℃、180rpm条件下培养48h，制得发酵液；
所述发酵培养基，每升组分如下：
蔗糖10g，NH4Cl 0.104g，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO4 2.65g，CaCl2 0.05g，FeCl30.01g，ZnSO4 0.01g，水定容至1L，pH 7.0。
实施例3
使用单因素和多因素交互实验优化UJN合成PHA的条件，培养基成分的选择会直接影响到微生物的生长状况和PHA的积累情况，对培养基中的碳源、氮源、碳氮比进行了优化。选取葡萄糖、蔗糖、淀粉、乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠作为碳源；选取酵母粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵作为氮源。确定积累PHA的最佳碳源和最佳氮源及其最佳浓度配比。根据发酵参数优化的响应面法进行实验设计与统计分析。使用Box-Benhnken Design进一步分析碳氮比、温度和初始pH对PHA产量的影响。其中温度的取值范围为25℃-35℃；pH的取值范围为6-8；碳氮比的取值范围为100/1-100/5。结果如图1和图2所示，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为氯化铵，获得结果为：最适碳源蔗糖与氮源氯化铵的比例为100/1.04(蔗糖10g/L、氯化铵0.104g/L)、培养基初始pH为6.7，最适培养温度为33.4℃，15mL种子液接入100mL发酵培养基中，于180r/min振荡摇床发酵培养48h，菌液6000rpm离心20min，收集菌体用于PHA分析。
称取50mg干燥的样品于酯化瓶中，加入2mL氯仿，1mL酯化液(850μL的甲醇和150μL的浓硫酸)，旋紧酯化瓶盖，在100℃沸水中进行3h的酯化反应，然后取出酯化瓶，充分冷却达室温后，再向酯化瓶中加入1mL去离子水并且剧烈震荡，静置分层后，取下层有机相进行气相色谱分析。使用氢焰离子检验器(FID)和30m×0.32mm rtx-5型石英毛细管柱用GC2010气相色谱(Shimadzu，Japan)进行分析，使用氮气作为载气。进样器温度为200℃，检测器温度为275℃；程序升温以80℃(1min)开始，以10℃/min升至120℃，以45℃/min升至160℃(5min)；进样量为1.0μL。使用购买SIGMA公司的标准品3HBME(3-羟基丁酸甲酯)及3HVME(3-羟基戊酸甲酯)校准。
经检测，PHA能够占到细胞干重的34.1％，较优化前PHA的合成效率提高了3.0倍。
对比例1
泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1与假单胞菌属菌株(Pseudomonas sp.)在同一次级分支上，进化关系较为紧密。假单胞菌(Pseudomonas sp.)QL212，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.9651。
采用实施例3所述的方法对假单胞菌(Pseudomonas sp.)QL212进行相同条件下的发酵培养，PHA产量占细胞干重的22.87％。
对比例2
根据《Journal of bioscience and bioengineering》(作者：Silva,Johanna A；Tobella,Lorena M；Becerra,Jose；Godoy,Felix；Martinez,Miguel A，卷:103,期:6,页:542-6；DOI:10.1263/jbb.103.542；出版年:2007-Jun)中记载的菌株泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)LMG P-23615，进行最适条件下PHA生产的相关数据进行计算，该菌株以葡萄糖为碳源，合成PHA的碳源转化率最高为1.67％。
结果分析
菌株泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1进行发酵培养，PHA能够占到细胞干重的34.1％，而假单胞菌(Pseudomonas sp.)QL212进行相同条件下的发酵培养，PHA产量占细胞干重的22.87％，二者差距显著，因此菌株泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1具有更加优良的应用前景。
菌株泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1合成PHA的碳源转化率最高为3.05％，较遗传关系最密切的菌株泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)LMG P-23615合成PHA的最高碳源转化率1.67％显著提高，且本申请所述菌株以蔗糖为碳源；而泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)LMG P-23615以葡萄糖为碳源，从而为本申请菌株应用时的成本降低打下了基础。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一株泡囊短波单胞菌及其培养方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1318
<212> DNA
<213> Brevundimonas vesicularis
<400> 1
cgtggtcgct gcctccttgc ggtcgcgcag cgccttcggg tagaaccaac tcccatggtg 60
tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 120
actagcgatt ccaacttcat gccctcgagt tgcagaggac aatccgaact gagacgactt 180
ttaaggatta accctctgta gtcgccattg tagcacgtgt gtagcccacc ctgtaagggc 240
catgaggact tgacgtcatc cccaccttcc tccggcttag caccggcagt cccattagag 300
ttcccaacta aatgatggca actaatggcg agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca 360
acatctcacg acacgagctg acgacagcca tgcagcacct gtgtcctagt ccccgaaggg 420
aaagccacgt ctccgtggcg gtccaggcat gtcaaaaggt ggtaaggttc tgcgcgttgc 480
ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttt 540
aatcttgcga ccgtactccc caggcggatt gcttaatgcg ttagctgcgt caccgaaatg 600
catgcatccc gacaactagc aatcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc 660
tgtttgctcc ccacgctttc gagcctcagc gtcagtaatg agccagtgtg tcgccttcgc 720
cactggtgtt cttccgaata tctacgaatt tcacctctac actcggagtt ccacacacct 780
ctctcatact caagacaccc agtatcaaag gcaattccga ggttgagccc cgggatttca 840
cccctgactt aaatgtccgc ctacgctccc tttacgccca gtaattccga gcaacgctag 900
cccccttcgt attaccgcgg ctgctggcac gaagttagcc ggggcttctt ctccgggtac 960
cgtcattatc gtccccggtg aaagaatttt acaatcctaa gaccttcatc attcacgcgg 1020
catggctgcg tcaggctttc gcccattgcg caagattccc cactgctgcc tcccgtagga 1080
gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc tgatcatcct ctcagaccag ctactgatcg 1140
tcgccttggt gagcctttac ctcaccaact agctaatcag acgcgggccg ctctaaaggc 1200
gataaatctt tcccccgaag ggcacattcg gtattagcac aagtttccct gagttattcc 1260
gaacctaaag gcacgttccc acgtgtactc acccgtccgc cactaactcc gaagagtt 1318

Claims (10)

1.一株泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1，2017年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.14851。
2.权利要求1所述泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1的培养方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1接种于固体斜面培养基上，活化培养，制得活化菌体；
(2)将步骤(1)制得的活化菌体接种于种子培养基中，种子培养，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比10～20％的比例接种至发酵培养基中，发酵培养，制得发酵液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，活化培养条件为：28～32℃条件下培养46～50h。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，固体斜面培养基，组分如下，均为重量百分比：
牛肉膏0.3～0.5％、蛋白胨1.0～1.2％、NaCl 0.4～0.6％、琼脂1.5％～2.0％、水余量。
5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，种子培养条件为：28～32℃、120～200rpm条件下培养38～42h。
6.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，种子培养基，每升组分如下：
牛肉膏3～5g，蛋白胨10～12g，NaCl 4～6g，水定容至1L，pH7.0。
7.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，发酵培养条件为：28～30℃、120～200rpm条件下培养44～52h。
8.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，发酵培养基，每升组分如下：
蔗糖10～12g，NH4Cl 0.1～0.3g，MgSO4·7H2O 0.2～0.4g，KH2PO4 2.6～2.8g，CaCl20.05～0.07g，FeCl3 0.01～0.03g，ZnSO4 0.01～0.03g，水定容至1L，pH 7.0。
9.权利要求1所述泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)UJN1在发酵生产微生物PHA中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，发酵过程中的培养基的碳源为蔗糖，氮源为NH4Cl，C/N比为100/1.04。
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Biosynthesis of Poly-β-Hydroxyalkanoate by Brevundimonas vesicularis LMG P-23615 and Sphingopyxis macrogoltabida LMG 17324 Using Acid-Hydrolyzed Sawdust as Carbon Source;Johanna A. Silva 等;《JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING》;20070630;第103卷(第6期);第542-546页 *
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