CN112430557B - 高产pha的卡巴耶罗氏菌株、筛选方法及其产生pha的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了高产PHA的卡巴耶罗氏菌株、筛选方法及其产生PHA的方法，所述菌株保藏名称为Caballeroniasp.Y5702，保藏单位广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No.61153，保藏日期为2020年8月14日。保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。PHA积累量已经达到菌体干重88%‑95%，较高的占比为发酵后的提取工作节约了大量的资源，是一株可运用于工业发酵生产PHA的优秀菌株。

Description

高产PHA的卡巴耶罗氏菌株、筛选方法及其产生PHA的方法
技术领域
本发明涉及一种高产PHA菌株，具体地说是涉及一种高产PHA的卡巴耶罗氏菌株(Caballeronia sp.Y5702)、筛选方法及其产生PHA的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是生物体中常见物质，参与各种生命活动的同时也作为微生物的碳源储存物质累积在细胞中。作为新型材料其良好的热加工性、优秀的生物相容性与可降解性，使其在尖端医学、食品领域等有着巨大的应用前景。
近些年，我国工业发酵PHA存在菌株产量不理想、PHA积累量占比过低、重组菌株不稳定等诸多问题。现有技术中通常采用下述方式筛选PHA菌株：将10mg尼罗蓝染色剂溶于0.5ml丙酮中，去离子水稀释至20ml，制备得到0.5mg/ml的尼罗蓝染色溶液母液；继续稀释得到0.2mg/L的尼罗蓝染色剂工作液，挑取发酵完成后的菌液，涂布于载玻片上火焰固定，冷却后滴加尼罗蓝染色剂工作液，置入烘箱50℃烘干；待烘干后利用8％冰醋酸溶液脱色1min，水洗后添加盖玻片置于荧光显微镜下观察荧光。该方法操作相对繁琐，且存在较大误差，不适用于大规模筛选。
同时，现有的培养基不能发挥菌株的PHA积累潜能。刘俊梅、王庆等人的团队于2016年发表于微生物学通报的文章《紫外线和硫酸二乙酯复合诱变选育PHB高产菌株》中通过诱变筛选得到的菌株PHB产量达到15.94g/L，占细胞干重69.54％。尹进等人2016年发表于《生物工程学报》的文章《聚羟基脂肪酸酯的研究进展》中提及目前野生型菌株的PHA产量仅有5.72g/L，通过串联启动子构建工程菌株，才能使得其PHA累积量达到90％。
因此，提供高产PHA菌株及利用其高效制备PHA是目前需要解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种高产PHA的卡巴耶罗氏菌株(Caballeroniasp.Y5702)，以解决现有发酵生产PHA的菌株产量不理想、PHA积累量占比过低、重组菌株不稳定等问题。
本发明的目的之二是提供前述高产PHA的卡巴耶罗氏菌株(Caballeroniasp.Y5702)产生PHA的方法。
本发明的目的之三是提供高产PHA的卡巴耶罗氏菌株的筛选方法。
本发明的目的之一是这样实现的：
高产PHA的卡巴耶罗氏菌株，所述菌株名称为Caballeronia sp.Y5702，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No.61153，保藏日期为2020年8月14日。
本发明的目的之二是这样实现的：
利用卡巴耶罗氏菌株生产PHA的方法中，发酵培养步骤为：以制备用发酵培养基在温度为25～30℃下培养45～55h；所述制备用发酵培养基中包括：葡萄糖30～50g/L，柠檬酸钠1～5g/L，硫酸铵2～6g/L，蛋白胨12～18g/L，KH2PO4·12H2O 0.5～0.7g/L，CaCl2 0.05～0.15g/Lg，K2HPO4 0.2～0.4g/L，微量元素：HBO3 0.01～0.03g/L，Na2MoO4 0.01～0.03g/L；pH为6.8～7.2。
所述的卡巴耶罗氏菌株生产PHA的方法中，所述制备用发酵培养基的成分为：葡萄糖40g/L，柠檬酸钠3g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4·12H2O 0.61g/L，CaCl2 0.1g/L，K2HPO40.3g/L，蛋白胨15g/L，微量元素：HBO3 0.02g/L，Na2MoO4 0.02g/L；pH7.0。
本发明的目的之三是这样实现的：
所述的生产PHA的卡巴耶罗氏菌株的筛选方法，包括以下步骤：
a)将保存待筛选菌株的甘油管置于25～30℃的温水中水浴解冻，待融化后以三区划线的方法接入YMA固体培养基平板中，置于25～30℃培养箱中培养2～3d；
(b)挑选活化后的菌株将其单菌落点接于尼罗蓝YMA平板上，根据荧光亮度排名得到PHA产量较好的菌株作为初筛菌株；
(c)将初筛菌株接种于YMA培养基平板上，置于25～30℃培养箱中培养2～3d后，将其单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于25～30℃、180～220rpm摇床中培养18～24h，制备为种子液；
(d)以10％～20％的接种量接入筛选用发酵培养基中，在温度25～30℃、180～220rpm摇床中培养45～55h，得到对应菌株的发酵液；
(e)将发酵液利用高速离心机6000～12000rpm离心8～12min，收集菌体弃上清，采用蒸馏水、乙醇各清洗三遍尽除菌体的胞外多糖；采用SDS-NaClO法提取菌体中的PHA，验证步骤(b)所的初筛菌株的PHA产量，根据PHA产量选得菌株Caballeronia sp.Y5702；
所述步骤(a)、(c)中的YMA固体培养基，每升培养基中含有甘露醇10g，酵母粉5g，KH2PO40.25g，K2HPO4 0.25g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O 0.2g，琼脂18g，其余为去离子水，pH7.0；
所述步骤(b)中的尼罗蓝YMA固体培养基的制备：称取10mg尼罗蓝染色剂溶于1ml二甲基亚砜溶液中，过滤除菌添加至融化的YMA固体培养基中，制备得5％尼罗蓝YMA固体培养基；
步骤(c)中的牛肉膏蛋白胨培养基中，每升培养基中含有牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15～20g，其余为去离子水，pH 7.0±0.4；
步骤(d)中的筛选发酵培养基，每升培养基中含有葡萄糖10g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4·12H2O0.61g，CaCl2 0.1g，酵母粉1g，K2HPO4 0.3g，微量元素：HBO3 0.02g，Na2MoO40.02g，其余为去离子水；pH7.0。
本发明筛选本实验室已经分离、纯化、保藏的250余株野生待筛选菌株，得到高产PHA的菌株Y5702，筛选方法科学合理，操作简便。通过调整培养基及培养方法，使得菌株Y5702发酵生产PHA的量提高近500％，菌株中累积的PHA占到菌体干重的88％-94％，该野生型菌株Y5702的PHA产量达到了国内文献报道的优秀水平，解决了发酵生产过程中PHA占比过低造成资源浪费的问题，通过高密度发酵手段有望突破文献报道产量，遂该菌及该发酵培养基具有工业化前景。
附图说明
图1是Y5702号菌株全基因组与科尔多瓦卡巴耶罗氏菌(Caballeroniacordobensis)模式菌LMG27620的比对图。
图2是Y5702号菌的产物的气相色谱检测结果。
图3是Y5702号菌的产物的600M核磁检测结果。
生物保藏材料说明
该高产PHA的卡巴耶罗氏菌属菌株Y5702，菌株保藏名称为Caballeroniasp.Y5702，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No.61153，保藏日期为2020年8月14日。保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，下述实施例仅作为说明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用试剂均为分析纯或化学纯，且均可市购或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。下述实施例均实现了本发明的目的。
实施例1
高产菌株的初步筛选及验证
1.1筛选方法
基于尼罗蓝染色剂的优秀性能，规避利用尼罗蓝染色直接染色菌体的复杂操作，配合本实验室进行过优化的YMA培养基。YMA培养基具有相对较高的碳氮比，较低的磷含量，适合根瘤菌生长的同时也能促使其累积大量PHA。
YMA固体培养基：甘露醇10g，酵母粉5g，KH2PO4 0.25g，K2HPO4 0.25g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O 0.2g，琼脂18g，其余为去离子水，pH 7.0。
尼罗蓝YMA固体培养基：称取10mg尼罗蓝染色剂溶于1ml二甲基亚砜溶液中，过滤除菌添加至融化的YMA固体培养基中，制备为5％尼罗蓝YMA固体培养基。
尼罗蓝染色剂能够特异性与菌株中PHA颗粒结合，紫外条件下发生荧光。根据荧光亮度，初步筛选出PHA产量相对较好的菌株。
1.2高产菌株的筛选
下述步骤(a)、(c)中的YMA固体培养基，每升培养基中含有甘露醇10g，酵母粉5g，KH2PO40.25g，K2HPO4 0.25g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O 0.2g，琼脂18g，其余为去离子水，pH7.0；
下述步骤(b)中的尼罗蓝YMA固体培养基的制备：称取10mg尼罗蓝染色剂溶于1ml二甲基亚砜溶液中，过滤除菌添加至融化的YMA固体培养基中，制备得5％尼罗蓝YMA固体培养基；
下述步骤(c)中的牛肉膏蛋白胨培养基中，每升培养基中含有牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15～20g，其余为去离子水，pH 7.0±0.4；
下述步骤(d)中的筛选发酵培养基，每升培养基中含有葡萄糖10g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4·12H2O0.61g，CaCl2 0.1g，酵母粉1g，K2HPO4 0.3g，微量元素：HBO3 0.02g，Na2MoO40.02g，其余为去离子水；pH7.0。
1.2.1对本实验室已经分离、纯化、保藏的250余株待筛选菌株(如表1所示)进行初步筛选。
(a)将保存待筛选菌株的甘油管置于25℃的温水中水浴解冻，待融化后以三区划线的方法接入YMA培养基平板中，置于25℃培养箱中培养3d。
(b)挑选活化后的菌株将其单菌落点接于尼罗蓝YMA固体培养基平板上，置于25℃培养箱中培养3d后，根据荧光亮度筛选PHA产量排名前10的菌株(如表2所示)。
1.2.2通过考察PHA产量指标逐一对所筛选出的十株菌株进行复核筛选
(c)将筛选出的表2所示的高产菌株重新接种于新的YMA培养基平板上，置于25℃培养箱中培养3d后，将其单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，并置于25℃、220rpm摇床中培养24h，制备为种子液。
(d)以15％的接种量接入筛选发酵培养基中，在温度25℃、220rpm摇床中培养55h，得到对应菌株的发酵液。
(e)将发酵液利用高速离心机12000rpm离心12min，收集菌体弃上清，采用蒸馏水、乙醇各清洗三遍尽除菌体的胞外多糖。采用SDS-NaClO法提取菌体中的PHA，经气相色谱检测和600M核磁检测，确认产物主要为高聚的3-羟基丁酸，各菌株PHA产量如表2所示(初步筛选的结果及各菌株的初始产量，分别通过PCR获得其16S rDNA比对后大致确定菌株归属结果入表2)。采用Tukey方法和95％置信区间对所筛选的各菌种分组，如表3所示。
表1菌株编号采样地点一览表
Figure BDA0002845001960000041
Figure BDA0002845001960000051
Figure BDA0002845001960000061
Figure BDA0002845001960000071
表2初步筛选结果及初始产量
Figure BDA0002845001960000072
Figure BDA0002845001960000081
表3Tukey方法和95％置信区间分组结果
Figure BDA0002845001960000082
以上结果表明，在筛选发酵培养基的条件下，Y5702号菌株的产量与其余九株菌存在极显著差异，初始产量达到3.758g/L，是最低水平的(Z25-1-1-2的PHA值为0.498g/L)754.62％。达到文献报道的优秀水平。Z19-1-1-3、Z11-1-1-3、Z19-1-2-3等菌株在YMA固体培养基上长势较好，但本实施例是液体摇瓶发酵实验，由于菌浓过低导致PHA产量下降，但依旧存在较显著差异；加之胞外多糖过多产生，不仅造成培养基中碳源浪费，也为后期菌株改造以及大量发酵提取造成了一定的困难。综上，Y5702为筛选出的PHA高产菌株。
对该Y5702菌株进行全基因组测序，并与科尔多瓦卡巴耶罗氏(Caballeroniacordobensis)模式菌LMG27620进行比对，所得结果如图1所示。Y5702菌株全基因组长度约为7MB左右，与科尔多瓦卡巴耶罗氏菌属(Caballeroniacordobensis)模式菌LMG27620基因组相似度较高，遂确定该菌株为卡巴耶罗氏属(Caballeronia)。该菌种具备脂肪酸合成(fab)与代谢(fad)以及PHA合成(pha)相关基因，其中，合成PHA的关键酶(phaC)为I型，能够高效合成聚三羟基戊酸、丁酸以及丙酸。本发明所提供的高产PHA的卡巴耶罗氏菌株，其特征如下：Y5702菌落呈现乳白色、潮湿的圆形外观，养分充足时菌落隆起较高，养分匮乏或培养基不适宜其生长时呈现不均一的白色斑点、菌落基本不隆起。
该高产PHA的科尔多瓦卡巴耶罗氏菌属菌株Y5702，于2010年8月采自云南芒市的土壤样品，菌株保藏名称为Caballeronia sp.Y5702。
实施例2
利用卡巴耶罗氏菌株Caballeronia sp.Y5702生产PHA。
本实施例中YMA固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基与实施例1相同。
实施例2-1
将高产菌株Caballeronia sp.Y5702接种于YMA固体培养基平板上，置于25℃培养箱中培养3d后，将其单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，并置于25℃、220rpm摇床中培养24h，制备为种子液。
再以15％的接种量接入制备发酵培养基中，在温度30℃、220rpm摇床中培养45h，得到对应菌株的发酵液。
将发酵液利用高速离心机12000rpm离心12min，收集菌体弃上清，采用蒸馏水、乙醇各清洗三遍尽除菌体的胞外多糖。采用SDS-NaClO法提取菌体中的PHA。
每升培养基中含有碳源物质(分别选自葡萄糖、淀粉以及蔗糖)10～50g，(NH4)2SO43g，KH2PO4·12H2O 0.61g，CaCl2 0.1g，酵母粉1g，K2HPO4 0.3g，微量元素：HBO3 0.02g，Na2MoO4 0.02g，其余为去离子水；pH7.0。
具体实验条件和结果如表4所示，菌株Y5702在40g/L的葡萄糖条件下，能够达到6.63g/L的PHA产量，这远超使用另外两种碳源时的PHA产量，为初始产量的176.42％，遂菌株Y5702的最适碳源为40g/L的葡萄糖。虽然在50g/L的淀粉浓度时，菌株累积PHA能力恢复至30g/L葡萄糖的能力水平，但显然已经不够经济。
表4：不同碳源下Y5702发酵所得PHA产量对比
Figure BDA0002845001960000091
Figure BDA0002845001960000101
实施例2-2
按实施例2-1的方法制备PHA，其中，每升制备发酵培养基的成分为：葡萄糖40g，柠檬酸钠0～5g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4·12H2O 0.61g，CaCl2 0.1g，酵母粉1g，K2HPO4 0.3g，微量元素：HBO30.02g，Na2MoO4 0.02g，其余为去离子水；pH7.0。具体试验条件和结果如表5所示，随着柠檬酸盐加入发酵培养基，菌株Y5702的PHA产能出现大幅度增长，浓度在1g/L–3g/L的范围内，PHA产量随着柠檬酸盐浓度的增加而增加；并在3g/L时PHA产量最高，达到12.17±0.0849g/L，为初始产量的368.23％；随着柠檬酸盐浓度的进一步增加，菌株PHA产能呈现下降趋势，确定3g/L的柠檬酸盐是最适用量。
表5：柠檬酸钠添加量对高产菌株Y5702发酵影响显著性分析
Figure BDA0002845001960000102
实施例2-3
将高产菌株Caballeronia sp.Y5702接种于YMA固体培养基平板上，置于30℃培养箱中培养2D后，将其单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，并置于25℃、220rpm摇床中培养24h，制备为种子液。
再以10％的接种量接入制备发酵培养基中，在温度25℃、220rpm摇床中培养55h，得到对应菌株的发酵液。
将发酵液利用高速离心机12000rpm离心12min，收集菌体弃上清，采用蒸馏水、乙醇各清洗三遍尽除菌体的胞外多糖，置于烘箱中40℃～60℃烘干。采用SDS-NaClO法提取菌体中的PHA。
每升培养基中含有葡萄糖40g，柠檬酸钠3g，(NH4)2SO4 2～10g，KH2PO4·12H2O0.61g，CaCl20.1g，酵母粉1g，K2HPO4 0.3g，微量元素：HBO3 0.02g，Na2MoO4 0.02g，其余为去离子水；pH7.0。
具体试验条件和结果如表6所示。
表6：硫酸铵添加量对高产菌株Y5702发酵影响显著性分析
Figure BDA0002845001960000111
实施例2-4
按实施例2-3的方法制备PHA，并且分别称量清洗烘干后的菌体干重与SDS-NaClO法提取的PHA质量，计算PHA占干重比率，其中，每升制备发酵培养基的成分为：葡萄糖40g，柠檬酸钠3g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4·12H2O 0.61g，CaCl2 0.1g，蛋白胨(3～15g/l)，K2HPO40.3g，微量元素：HBO3 0.02g，Na2MoO4 0.02g，其余为去离子水；pH7.0。
具体试验条件和结果如表7所示。酵母提取物(酵母粉)虽然为菌株提供大量的氨基酸以及生长因子，是菌株理想的培养成分，但是用于发酵生产成本过于高昂，而蛋白胨则可节约大部分成本。
表7：蛋白胨添加量对高产菌株Y5702发酵影响的显著性分析
Figure BDA0002845001960000112
由表7可以看出，在蛋白胨添加量为15g/L时，高产菌株Y5702的产量最高，达到了17.955±0.205g/L为初始产量的477.53％，并测得此次发酵PHA占细胞干重更是达到90％左右。遂确定通过蛋白胨替代发酵培养基中酵母提取物组分方法可行，且15g/L的蛋白胨浓度为最适浓度。
Y5702号菌的PHA摇瓶发酵产量达到17.295g/L-17.955g/L，相较初始产量3.76g/L提高了489.24％。实施例所得数据均为摇瓶发酵结果，通过分子生物学手段改良原始菌株，采用发酵罐连续补料发酵、高密度发酵等手段则有望达到新高度。
菌体在碳源丰富的条件下TCA循环活跃，新增的柠檬酸盐同时也能极大的加速TCA循环，产生大量的乙酰CoA。乙酰CoA在酮脂酰CoA硫解酶(phaA)的作用下生成乙酰乙酰CoA，随后在乙酰乙酰CoA还原酶(phaB)的作用下形成3-羟基丁酰CoA。最后由PHA聚合酶(phaC)聚合形成聚3-羟基丁酸酯，或其他聚3-羟基烷酸酯聚合物。
Y5702菌株产物成分与结构分析
将实施例2-4中蛋白胨浓度为15g/L时所提取的Y5702号菌的粗产物，进行三级纯化后取部分溶于氯仿，利用酸化的甲醇溶液100℃沸水浴2h。断裂PHA形成单体的同时，完成酯化反应生成对应甲酯，加入超纯水(Ultrapure Water)夺取氯仿中的甲醇，离心：12000rpm、10min，取下层氯仿层用于气相色谱检测，检测结果如图2所示。
对比PHB(聚3-羟基丁酸)标品的气相色谱，Y5702号菌的粗产物于4min左右出峰与PHB标品一致，纯度达到标品的90％以上。取部分纯化后的产物溶解于氘代氯仿，送测600M核磁检测产物结构，所得核磁结果如图3所示。
结合气相色谱与600M H NMR结果显示，产物主要为高聚的3-羟基丁酸(PHB)。
实施例3
按以下方法培养Y5702号菌制备PHA：
将高产菌株Caballeronia sp.Y5702接种于YMA固体培养基平板上，置于25℃培养箱中培养3d后，将其单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，并置于25℃、220rpm摇床中培养24h，制备为种子液。
再以15％的接种量接入制备发酵培养基中，在温度30℃、220rpm摇床中培养45h，得到对应菌株的发酵液。
将发酵液利用高速离心机12000rpm离心12min，收集菌体弃上清，采用蒸馏水、乙醇各清洗三遍尽除菌体的胞外多糖。采用SDS-NaClO法提取菌体中的PHA。
其中，YMA固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基与实施例1相同。
制备发酵培养基(成分为：葡萄糖40g/L，柠檬酸钠3g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4·12H2O 0.61g/L，CaCl2 0.1g/L，K2HPO4 0.3g/L，蛋白胨15g/L，微量元素：HBO3 0.02g/L，Na2MoO4 0.02g/L；pH7.0)培养其他高产PHA菌株，所得结果如下表8所示。
表8培养基验证结果
Figure BDA0002845001960000121
Figure BDA0002845001960000131
通过上表数据可得，优化后的制备发酵培养基除菌株Y5702外的PHA高产菌株外均不能适应，仅有Y5702能够适应该培养基中高含量的葡萄糖以及蛋白胨，其PHA产量能够达到17.955±0.205g/L，为国内外文献报道的野生型PHA高产菌株中的优秀水平。且其PHA积累量已经达到菌体干重88％-95％，较高的占比为发酵后的提取工作节约了大量的资源，是一株可运用于工业发酵生产PHA的优秀菌株。

Claims (3)

1.一种高产PHA的卡巴耶罗氏菌株，其特征在于，所述菌株名称为卡巴耶罗氏菌(Caballeroniasp.)Y5702，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No.61153，保藏日期为2020年8月14日。
2.一种利用权利要求1所述的卡巴耶罗氏菌株生产PHA的方法，其特征在于，发酵培养步骤为：以制备用发酵培养基在温度为25～30℃下培养45～55h；所述制备用发酵培养基中包括：葡萄糖30～50g/L，柠檬酸钠1～5g/L，硫酸铵2～6g/L，蛋白胨12～18g/L，KH2PO4·12H2O 0.5～0.7g/L，CaCl20.05～0.15g/L，K2HPO4 0.2～0.4g/L，微量元素：HBO3 0.01～0.03g/L，Na2MoO4 0.01～0.03g/L；pH为6.8～7.2。
3.根据权利要求2所述的卡巴耶罗氏菌株生产PHA的方法，其特征在于，所述制备用发酵培养基的成分为：葡萄糖40g/L，柠檬酸钠3g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4·12H2O 0.61g/L，CaCl2 0.1g/L，K2HPO40.3 g/L，蛋白胨15g/L，微量元素：HBO3 0.02g/L，Na2MoO4 0.02g/L；pH7.0。
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