CN109536409B - 一种抗逆性高且可利用多种碳源的乳酸片球菌菌株及利用该菌株生产乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乳酸生产菌株以及利用该乳酸生产菌株生产乳酸的方法。利用本发明的乳酸生产菌株乳酸片球菌Pa‑COT生产乳酸时，产酸速度得到显著提高，即，本发明的乳酸生产菌株Pa‑COT具有显著提高的生产乳酸的产酸性能。相应地，通过使用本发明的乳酸生产菌株Pa‑COT来发酵生产乳酸，可以大大改善乳酸的生产。同时，该乳酸生产菌株Pa‑COT还具有发酵成本低、环境友好的优势。此外，本发明的乳酸生产菌株Pa‑COT还具有如下优势：可以在45℃～50℃的发酵温度下进行正常发酵来生产乳酸；对木质纤维素体系有非常好的适应性，可以耐受较高浓度的预处理过程中产生的抑制物；能够利用木质纤维素作为原料进行同型乳酸发酵。

Description

一种抗逆性高且可利用多种碳源的乳酸片球菌菌株及利用该 菌株生产乳酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域。具体而言，本发明涉及一种抗逆性高且可利用多种碳源发酵生产乳酸的乳酸片球菌菌株以及利用该乳酸片球菌菌株生产乳酸的方法。
背景技术
聚乳酸(Polylactic acid，PLA)是一种由乳酸单体缩聚而成的可生物降解的高分子聚合物。PLA因其原料为可再生的生物资源，被产业界一致认定为新世纪最有发展前途的新型“生物基材料”。此外，由PLA制成的产品光泽度、透明性、手感和耐热性好，还具有一定的耐菌性、阻燃性和抗紫外性，并具有较高的光泽度和加工性能；PLA还具有无毒、无刺激性和良好的生物相容性等特点。因此，PLA具有广阔的市场前景，用途十分广泛，目前主要用于服装、建筑、农业、林业、造纸和医疗卫生等多个领域中。迄今为止，乳酸主要可通过化学合成法和微生物发酵法获得。化学合成法存在环境污染、成本昂贵、技术复杂、光学纯度较低等棘手问题，难以满足实际应用要求。相比之下，微生物发酵法利用葡萄糖等可再生资源为原料生产乳酸，具有生产成本低、产物光学纯度和安全性高、生产条件温和、污染小等优点，因此，目前全世界的乳酸工业生产绝大部分都是通过微生物发酵法进行的。
然而，在通过微生物发酵法大规模工业生产乳酸时，可选择的菌株仍然十分有限，需要进一步选育高产菌株，不断发掘新菌种，以期实现产量增加、纯度提高、成本降低、效益提高等目标。对于乳酸发酵菌株的筛选和改造，主要聚焦于如下三个方面：高产菌株的获得；耐环境胁迫菌株的选育；以及转基因工程菌株的构建。
其中，增强乳酸发酵菌株对环境胁迫的抵抗能力是提高乳酸发酵能力的重要手段之一。已有研究表明，通过提高乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的耐高糖浓度和耐高乳酸钙浓度的能力，可以提高其乳酸产量和产物光学纯度；通过提高鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的耐酸和耐糖能力，可以提高其乳酸产量和生物量。就此而言，在乳酸发酵工业中，耐高温菌株可以带来极大的优势，例如，利用耐高温菌株可以达到缩短生产周期、减少发酵生产中控温所需的能耗、节约冷却用水以及减少杂菌污染的可能性等有益效果。
另一方面，大多数乳酸生产菌株在发酵过程中仅能利用单一碳源(例如葡萄糖)来生产乳酸。就此而言，相比葡萄糖等传统乳酸生产原料而言，作为目前生物质能源研究主要材料的木质纤维素十分廉价且容易获得。在大多数木质纤维素水解物中，木糖和阿拉伯糖是含量仅次于葡萄糖的单糖，因而，若能够充分利用木质纤维素水解物中的木糖和阿拉伯糖来发酵生产乳酸，将会大大提高木质纤维素的利用率及乳酸生产效率。
然而，对于能够以高产率利用多种碳源生产乳酸的耐高温乳酸生产菌株而言，目前还存在极大的改善空间。
发明内容
本发明的主要目的在于克服上述现有技术中的不足，提供一种抗逆性高且可利用多种碳源发酵生产乳酸的乳酸片球菌菌株以及利用该乳酸片球菌菌株生产乳酸的方法。具体而言，已知乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)是益生菌中的重要成员之一，可以调节胃肠道菌群，维持肠道微生态平衡，在动物体内对病原微生物有拮抗作用，可增强动物机体的免疫功能；乳酸片球菌的最适温度通常为35℃～40℃，一般超过42℃时，其发酵能力就会大幅下降。对于利用乳酸片球菌来以高产率利用多种碳源在较高温度下生产乳酸，本领域还罕有报道。对此，本发明从酒曲(大曲)样品中筛选得到了一种抗逆性高(在50℃下仍具备较高发酵能力)且可利用多种碳源(包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等)发酵生产乳酸的乳酸片球菌菌株，从而完成了本发明。
因此，根据第一个方面，本发明提供了乳酸生产菌株Pa-COT，所述乳酸生产菌株Pa-COT的分类名称为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，于2018年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16833。
根据第二个方面，本发明提供了利用所述乳酸生产菌株Pa-COT生产乳酸的方法，所述方法包括：在35℃～40℃(优选37℃)的发酵温度下在培养基中培养所述乳酸生产菌株Pa-COT，从而使所述乳酸生产菌株Pa-COT生长；在37℃～50℃(优选42℃～48℃、更优选45℃～48℃、特别优选48℃)的发酵温度下在培养基中培养所述乳酸生产菌株Pa-COT，从而在所述培养基中产生和积累乳酸；以及从所述培养基中收集乳酸。
优选地，所述培养基中包含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或它们的混合物作为碳源。
有益效果
利用本发明的乳酸生产菌株Pa-COT生产乳酸时，产酸速度得到显著提高，即，本发明的乳酸生产菌株Pa-COT具有显著提高的生产乳酸的产酸性能。相应地，通过使用本发明的乳酸生产菌株Pa-COT来发酵生产乳酸，可以大大改善乳酸的生产。同时，该乳酸生产菌株Pa-COT还具有发酵成本低、环境友好的优势。此外，本发明的乳酸生产菌株Pa-COT还具有如下优势：可以在45℃～50℃的发酵温度下进行正常发酵来生产乳酸；对木质纤维素体系有非常好的适应性，可以耐受较高浓度的预处理过程中产生的抑制物；能够利用木质纤维素作为原料进行同型乳酸发酵。
本发明的其它特征和优势将通过以下具体实施方式进行详细说明。
附图说明
图1为示出了利用本发明的乳酸生产菌株Pa-COT以葡萄糖为碳源生产乳酸时发酵产物乳酸的产量的图。
图2为示出了利用本发明的乳酸生产菌株Pa-COT以木糖为碳源生产乳酸时发酵产物乳酸的产量的图。
图3为示出了利用本发明的乳酸生产菌株Pa-COT以阿拉伯糖为碳源生产乳酸时发酵产物乳酸的产量的图。
图4为示出了利用本发明的乳酸生产菌株Pa-COT以纤维素酶解液为碳源生产乳酸时发酵产物乳酸的产量的图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本文使用的术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”通常都意味着统计学显著量的增加。然而，为避免疑义，术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”表示相比参比水平(例如不同于本发明的乳酸片球菌菌株的乳酸片球菌菌株中的水平)增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或相比参比水平增加在10％到100％之间的任意量；或相比参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。
为了筛选出能够在较高温度下快速生产乳酸的乳酸生产菌株，可以对菌株进行高温筛选。为了进一步提高筛选效率，可以将上述过程重复多次，直至获得符合期望的目标菌株。
在本发明一些优选实施方式中，可以在45℃～48℃的温度下进行平板培养以选择生长较快的单克隆(第一轮高温筛选)；然后，可以在45℃～50℃的温度下进行平板培养以选择生长较快的单克隆并进行液体培养以选择乳酸产量较高的菌株(第二轮高温筛选)。
在本发明的发酵生产乳酸的方法中，对本发明的乳酸生产菌株Pa-COT进行发酵培养可以获得乳酸。其中，除了在较高温度下(例如37℃～50℃，优选42℃～48℃、更优选45℃～48℃、特别优选48℃)进行发酵之外，发酵培养的方法可以为本领域常规用于乳酸生产的发酵方法。除了在较高温度下(例如37℃～50℃，优选42℃～48℃、更优选45℃～48℃、特别优选48℃)进行发酵之外，可利用乳酸片球菌的标准培养方法制备本发明乳酸生产菌株Pa-COT的种子液和发酵液。例如，发酵培养的方法可包括以下步骤：将新鲜制备的乳酸生产菌株或低温冻存的乳酸生产菌株(例如在甘油冻存管中冻存于例如-80℃冰箱中的乳酸生产菌株)接种于乳酸片球菌液体培养基中进行活化并过夜培养制得种子液；将上述种子液接种至乳酸产酸发酵培养基中(例如装有乳酸产酸发酵培养基的摇瓶或发酵罐中)扩大培养制得发酵液。
例如，所述种子液可通过如下过程制备：从平板上挑取乳酸片球菌单菌落接种于种子液培养基中，以转速100-180rpm在35-40℃(优选37℃)下培养12～24h，即得种子液。在本发明一个优选实施方式中，所述种子液培养基为MRS液体培养基。
例如，所述发酵液可通过如下过程制备：以5％-10％体积的接种量将种子液接种至置于例如摇瓶或发酵罐中的产酸发酵培养基中，以转速100-180rpm(优选120-150rpm)在35-40℃(优选37℃)下发酵3-5h，然后再以转速100-180rpm(优选120-150rpm)在37-50℃(优选42℃～48℃、更优选45℃～48℃、特别优选48℃)下连续发酵65-96h，即得发酵液。其中，所述产酸发酵培养基包含碳源、氮源、微量元素和中和剂。
在本发明一些实施方式中，所述产酸发酵培养基包含碳源(例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或它们的混合物)、氮源(例如酵母提取物)、乙酸钠、磷酸盐、微量元素和中和剂。在本发明一些优选实施方式中，所述中和剂为CaCO3，并且中和剂CaCO3的浓度为糖浓度的一半，但本发明并不限于此。在本发明一个优选实施方式中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：葡萄糖80-160g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5-1g/L、MnSO4 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及合适的中和剂(例如CaCO3 40-80g/L)。在本发明一个优选实施方式中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：木糖10-100g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5-1g/L、MnSO4 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及合适的中和剂(例如CaCO3 5-50g/L)。在本发明一个优选实施方式中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：阿拉伯糖5-40g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5-1g/L、MnSO4 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及合适的中和剂(例如CaCO32.5-20g/L)。在本发明一个优选实施方式中，所述产酸发酵培养基中的碳源为葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合物。
由于本发明的乳酸生产菌株对木质纤维素体系有非常好的适应性，可以耐受预处理过程中产生的抑制物，能够利用木质纤维素作为原料进行同型乳酸发酵，在本发明另一些实施方式中，所述产酸发酵培养基为进一步添加有微量元素、氮源和中和剂的纤维素酶解液(例如秸秆酶解液，其主要碳源包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)。在本发明一些优选实施方式中，所述产酸发酵培养基为秸秆酶解液，其中进一步添加有微量元素KH2PO4、MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O、作为氮源的2-10％(v/v)浓玉米浆(含水量约60％)以及作为中和剂的约5％的CaCO3，pH为5.5-6.5。在本发明一些更优选的实施方式中，所述产酸发酵培养基为秸秆酶解液，其中进一步添加有5％(v/v)浓玉米浆(含水量约60％)、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·H2O 0.25g/L、CaCO3 50g/L，pH为6。
在完成发酵培养后，可以通过已知方法收集产酸发酵培养基中积累的乳酸。例如，可以通过包括在除去细胞后浓缩产酸发酵培养基以使产物结晶、离子交换层析和诸如此类的方法来分离乳酸。
同时，在完成发酵培养后，还可以通过已知方法对产酸发酵培养基中积累的乳酸或所分离的乳酸进行检测。例如，可以通过高效液相色谱法和诸如此类的方法来对乳酸的产量进行检测。
实施例
接下来，通过以下实施例对本发明进行更详细的说明，但这些实施例仅用于说明本发明而不用来限制本发明的范围。下述实施例中，除非特别说明，所用试剂、培养基均为市售商品，所用方法均为常规方法。
1.培养基
MRS+CaCO3平板：MRS固体培养基+10g/L CaCO3；
筛选培养基：MRS液体培养基+10g/L CaCO3；
葡萄糖产酸发酵培养基：葡萄糖80-160g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4 0.2g/L、吐温80 1ml/L、CaCO3 40-80g/L；
木糖产酸发酵培养基：木糖10-100g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5-1g/L、MnSO4 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L、CaCO3 5-50g/L；
阿拉伯糖产酸发酵培养基：阿拉伯糖5-40g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5-1g/L、MnSO4 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L、CaCO3 2.5-20g/L。
2.高效液相色谱法检测发酵液中的乳酸
色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity II；
检出器：RID；
分离柱：Aminex HPX-87H Column 300×7.8mm；
流动相：0.005M硫酸；
流量：0.5mL/min；
进样量：20μL。
乳酸保留时间为14min左右。
实施例1：菌株分离、耐高温菌株筛选和菌株鉴定
菌株分离：将1g大曲样品捣碎后用10mL无菌生理盐水溶解，充分混匀30min；取上述稀释液10倍梯度稀释后涂布于含1％(w/v)CaCO3(中和剂)的MRS固体培养基上，37℃培养24小时，挑取透明圈较大的单菌落接种筛选培养基，37℃培养24小时，用高效液相色谱检测总乳酸含量，挑选乳酸产量高的菌株，即发酵产物中乳酸含量高的乳酸菌。
耐高温菌株筛选：在上述分离出的乳酸菌中挑选产酸较高的一批产乳酸菌株，接种MRS培养基，37℃150rpm培养1小时，取5μl培养液点在MRS+CaCO3固体平板上，将平板放置于45℃培养箱中培养40小时；挑选平板中菌落生长较快并且溶钙圈较大的单菌落再次转接MRS培养基，37℃150rpm培养1小时，取5μl培养液点在MRS+CaCO3固体平板上，将平板放置于48℃培养箱中培养。挑选其中溶钙圈比较明显的备选菌株进行发酵摇瓶实验。将备选菌株接种MRS培养基，37℃150rpm过夜培养获得种子液，在30mL产酸发酵培养基中按照10％(v/v)的比例接种上述种子液，37℃150rpm摇床培养3-5小时让菌株生长，然后升温到48℃或50℃，继续以150rpm摇床培养72小时获得发酵液。发酵结束后通过高效液相色谱检测发酵产物中的乳酸，筛选出高温条件下产乳酸较快、乳酸产量较高的菌株。
菌株鉴定：挑选的菌株具有菌落较小(约1-2mm)、圆形隆起、表面光滑、边缘整齐光滑、呈乳白色、革兰氏染色呈阳性；镜检细胞形态为球形、成对或四联状排列等特征，基本符合乳酸片球菌的各项特征。进而，采用16S rDNA测序鉴定方法确认了该菌株与乳酸片球菌最接近，从而将其鉴定为乳酸片球菌，命名为乳酸片球菌Pa-COT。
具体而言，通过上述菌株分离方法从大曲样品中分离得到大量乳酸生产菌株，其中绝大部分是常用于乳酸生产的乳杆菌和链球菌。进而，在升温筛选过程中，多数菌株不能在45-48℃条件下生长或产乳酸，在高温条件下乳酸产量较高的一系列菌株中，包括3株乳酸片球菌，乳酸片球菌Pa-COT是筛选得到的所有菌株中乳酸产量最高的。
其结果是，在30mL摇瓶48℃条件下，乳酸片球菌菌株Pa-COT 72h可发酵生产乳酸110g/L，糖酸转化率为98％；其它分离到的乳酸片球菌菌株同样条件72h仅生产乳酸45-70g/L，糖酸转化率90-95％。甚至在30mL摇瓶50℃条件下，乳酸片球菌菌株Pa-COT仍然具有较高的发酵产乳酸能力，同样优于其它分离到的乳酸片球菌菌株。
将该进行高温筛选得到的乳酸片球菌菌株命名为乳酸片球菌Pa-COT(也称为乳酸生产菌株Pa-COT)。该乳酸生产菌株Pa-COT于2018年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16833。
实施例2：菌株发酵生产乳酸
将实施例1中得到的乳酸生产菌株Pa-COT接种MRS培养基，37℃150rpm过夜培养获得种子液。然后，在200mL含不同碳源(分别为100g/L葡萄糖、100g/L木糖或40g/L阿拉伯糖)的产酸发酵培养基中按照10％(v/v)的比例接种上述种子液，37℃150rpm摇床培养3-5小时让菌株生长，然后升温到45℃或48℃，继续以150rpm摇床培养至72小时，获得发酵液。发酵结束后通过高效液相色谱测定乳酸产量。
其结果是，在不同单糖作为碳源的情况下，乳酸片球菌菌株Pa-COT利用葡萄糖为碳源时72h可发酵生产乳酸100.9g/L，糖酸转化率为98.1％(参见图1)；利用木糖为碳源时72h可发酵生产乳酸33.8g/L，糖酸转化率为57.2％(参见图2)；利用阿拉伯糖为碳源时42h可发酵生产乳酸24.8g/L，糖酸转化率为63.3％(参见图3)。其中，利用五碳糖为碳源时的主要副产物为乙酸。考虑到乳酸生产菌株Pa-COT出色的乳酸生产速度和糖酸转化率，并且可以利用木糖和阿拉伯糖作为碳源生产乳酸，本发明提供了可满足工业需求的又一选择。
实施例3：菌株利用纤维素酶解液生产乳酸
本实施例3中使用秸秆酶解液培养基作为产酸发酵培养基，其包含如下成分：秸秆酶解液(主要成分为葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，作为碳源使用)、5％(v/v)浓玉米浆(含水60％左右)、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·H2O 0.25g/L、CaCO3 50g/L，pH为6左右。
将乳酸生产菌株Pa-COT接种MRS培养基，37℃150rpm过夜培养获得种子液。取种子液20ml在6000rpm条件下离心5min，弃上清，用1ml生理盐水悬浮接种至200ml秸秆酶解液培养基，37℃180rpm摇床培养4小时让菌株快速生长，然后升温到45℃，继续以180rpm摇床培养92小时，获得发酵液。发酵结束后通过高效液相色谱测定残糖及乳酸产量。
其结果是，发酵结束后，酶解液中葡萄糖基本耗尽，木糖和阿拉伯糖消耗50％左右，总乳酸产量为85.2g/L，总糖酸转化率为80％(图4)。
工业实用性
以上研究表明，本发明的乳酸生产菌株Pa-COT具有出色的乳酸生产能力，并且在45-48℃条件下乳酸生产速度进一步提高。此外，本发明的乳酸生产菌株Pa-COT还可以高效利用纤维素酶解液中的木糖和阿拉伯糖来发酵生产乳酸，其耐温能力与玉米秸秆处理过程最后一步的酶解温度(48-50℃)接近，因此具有同步酶解糖化发酵的潜力。因此，本发明提供了一种发酵成本低、环境友好、乳酸生产速度快的新型生产菌株，为乳酸的工业化微生物发酵生产提供了更优的潜在选择。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变型，这些变型均属于本发明的保护范围。

Claims (24)

1.一种乳酸生产菌株Pa-COT，所述乳酸生产菌株Pa-COT的分类名称为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，于2018年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16833。
2.利用如权利要求1所述的乳酸生产菌株Pa-COT生产乳酸的方法，所述方法包括：
在35℃～40℃的发酵温度下在培养基中培养所述乳酸生产菌株Pa-COT，从而使所述乳酸生产菌株Pa-COT生长；
在37℃～50℃的发酵温度下在培养基中培养所述乳酸生产菌株Pa-COT，从而在所述培养基中产生和积累乳酸；以及
从所述培养基中收集乳酸。
3.如权利要求2所述的方法，其中，在37℃的发酵温度下在培养基中培养所述乳酸生产菌株Pa-COT，从而使所述乳酸生产菌株Pa-COT生长。
4.如权利要求2所述的方法，其中，在42℃～48℃的发酵温度下在培养基中培养所述乳酸生产菌株Pa-COT，从而在所述培养基中产生和积累乳酸。
5.如权利要求2所述的方法，其中，在45℃～48℃的发酵温度下在培养基中培养所述乳酸生产菌株Pa-COT，从而在所述培养基中产生和积累乳酸。
6.如权利要求2所述的方法，其中，在48℃的发酵温度下在培养基中培养所述乳酸生产菌株Pa-COT，从而在所述培养基中产生和积累乳酸。
7.如权利要求2所述的方法，其中，所述培养基中包含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或它们的混合物作为碳源。
8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
将新鲜制备的乳酸生产菌株Pa-COT或低温冻存的乳酸生产菌株Pa-COT接种于乳酸片球菌液体培养基中进行活化；
过夜培养制得种子液；以及
将所述种子液接种至乳酸产酸发酵培养基中扩大培养制得发酵液。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述种子液通过如下过程制备：
从平板上挑取乳酸生产菌株Pa-COT单菌落接种于种子液培养基中，以转速100-180rpm在35-40℃下培养12～24h，即得种子液。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述种子液通过如下过程制备：
从平板上挑取乳酸生产菌株Pa-COT单菌落接种于种子液培养基中，以转速120-150rpm在37℃下培养12～24h，即得种子液。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中，所述种子液培养基为MRS液体培养基。
12.如权利要求8所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：
以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-180rpm在35-40℃下发酵3-5h，然后再以转速100-180rpm在37-50℃下连续发酵65-96h，即得发酵液。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：
以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-180rpm在35-40℃下发酵3-5h，然后再以转速100-180rpm在42℃～48℃下连续发酵65-96h，即得发酵液。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：
以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-180rpm在35-40℃下发酵3-5h，然后再以转速100-180rpm在45℃～48℃下连续发酵65-96h，即得发酵液。
15.如权利要求12所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：
以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-180rpm在35-40℃下发酵3-5h，然后再以转速100-180rpm在48℃下连续发酵65-96h，即得发酵液。
16.如权利要求12所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：
以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速120-150rpm在37℃下发酵3-5h，然后再以转速120-150rpm在48℃下连续发酵65-96h，即得发酵液。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基包含碳源、氮源、乙酸钠、磷酸盐、微量元素和中和剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述碳源为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或它们的混合物；所述氮源为酵母提取物。
19.如权利要求17所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：葡萄糖80-160g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5-1g/L、MnSO4 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及CaCO3 40-80g/L。
20.如权利要求17所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：木糖10-100g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5-1g/L、MnSO4 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及CaCO3 5-50g/L。
21.如权利要求17所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：阿拉伯糖5-40g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5-1g/L、MnSO4 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及CaCO3 2.5-20g/L。
22.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基为进一步添加有微量元素、氮源和中和剂的纤维素酶解液。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基为秸秆酶解液，其中进一步添加有KH2PO4、MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O、2-10％(v/v)玉米浆以及5％的CaCO3，pH为5.5-6.5。
24.如权利要求22所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基为秸秆酶解液，其中进一步添加有KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·H2O 0.25g/L、5％(v/v)玉米浆以及CaCO350g/L，pH为6。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363765B (zh) * 2020-05-28 2020-12-11 中粮营养健康研究院有限公司 发酵制备乳酸的方法
CN111484604B (zh) 2020-06-28 2020-09-15 中粮营养健康研究院有限公司 一种生产聚乳酸的方法
CN115011498A (zh) * 2021-03-05 2022-09-06 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 耐高温耐高糖的乳酸片球菌
CN114181859B (zh) * 2021-12-10 2023-09-01 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种嗜热脂肪地芽孢杆菌及其利用木质纤维素产乳酸的方法
CN114958667B (zh) * 2022-05-27 2023-09-29 朱密 一种高产l-乳酸的乳球菌及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586348A (zh) * 2011-01-14 2012-07-18 华东理工大学 一种木质纤维素糖化与发酵生产乳酸的方法
CN103103224A (zh) * 2011-11-10 2013-05-15 华东理工大学 一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法
BE1023808B1 (fr) * 2016-12-16 2017-07-27 Dumoulin Aliment complet pour animal pour réduire la problématique d'odeur et/ou de goût liée à la présence de scatol et/ou d'androsténone et/ou d'indol, en particulier pour réduire la problématique d'odeur de verrat
CN107034163A (zh) * 2017-05-23 2017-08-11 北京市农林科学院 一种新型乳酸片球菌及其应用
CN111363765A (zh) * 2020-05-28 2020-07-03 中粮营养健康研究院有限公司 发酵制备乳酸的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5988455B2 (ja) * 2013-01-11 2016-09-07 株式会社タカギ 新規乳酸菌
CN105925499A (zh) * 2016-04-29 2016-09-07 四川农业大学 一株乳酸片球菌jqq2及其应用
CN108504601B (zh) * 2018-04-10 2021-04-20 北京好实沃生物技术有限公司 一株乳酸片球菌hew-ap27及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586348A (zh) * 2011-01-14 2012-07-18 华东理工大学 一种木质纤维素糖化与发酵生产乳酸的方法
CN103103224A (zh) * 2011-11-10 2013-05-15 华东理工大学 一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法
BE1023808B1 (fr) * 2016-12-16 2017-07-27 Dumoulin Aliment complet pour animal pour réduire la problématique d'odeur et/ou de goût liée à la présence de scatol et/ou d'androsténone et/ou d'indol, en particulier pour réduire la problématique d'odeur de verrat
CN107034163A (zh) * 2017-05-23 2017-08-11 北京市农林科学院 一种新型乳酸片球菌及其应用
CN111363765A (zh) * 2020-05-28 2020-07-03 中粮营养健康研究院有限公司 发酵制备乳酸的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Screening of lactic acid bacteria for their potential as microbial cell factories for bioconversion of lignocellulosic feedstocks;Anna Monika Boguta等;《Microbial Cell Factories》;20140705;第13卷;第1-16页 *
Simultaneous saccharification and high titer lactic acid fermentation of corn stover using a newly isolated lactic acid bacterium Pediococcus acidilactici DQ2;Kai Zhao等;《Bioresource Technology》;20120927;第135卷;第481-489页 *
一株高耐受性乳酸菌的分离及其在木质纤维素发酵生产高浓度L-乳酸中的应用;楚德强等;《华东理工大学学报》;20111015;第521-523页 *
乳酸片球菌的分离鉴定与益生功能的初步研究;王建设等;《中国农学通报》;20120825;第28卷(第24期);第201-206页 *

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