CN109504630B

CN109504630B - 一种重组d-乳酸生产植物乳杆菌菌株及利用该菌株生产d-乳酸的方法

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Publication number: CN109504630B
Application number: CN201811542499.3A
Authority: CN
Inventors: 佟毅; 张媛; 王小艳; 王燕; 陈博; 李义; 焦琳; 郑晓卫; 刘志刚
Original assignee: Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Cofco Biochemical Anhui Co Ltd; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Current assignee: Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Cofco Biochemical Anhui Co Ltd; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2038-12-17
Also published as: CN109504630A

Abstract

本发明涉及一种D‑乳酸生产菌株以及利用该D‑乳酸生产菌株生产D‑乳酸的方法。利用本发明的D‑乳酸生产菌株Lp‑DA生产D‑乳酸时，产酸速度和产物光学纯度都得到显著提高，即，本发明的D‑乳酸生产菌株Lp‑DA具有显著提高的生产D‑乳酸的产酸性能。相应地，通过使用本发明的D‑乳酸生产菌株Lp‑DA来发酵生产D‑乳酸，可以大大改善D‑乳酸的生产。同时，该D‑乳酸生产菌株Lp‑DA还具有发酵成本低、可缩短生产周期、减少发酵生产中控温所需的能耗、节约冷却用水、减少杂菌污染以及环境友好的优势。

Description

一种重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株及利用该菌株生产D-乳酸的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域。具体而言，本发明涉及一种能够在较高温度下快速生产高光学纯度D-乳酸的重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株以及利用该D-乳酸生产菌株生产D-乳酸的方法。

背景技术

聚乳酸(Polylactic acid，PLA)是一种由乳酸单体缩聚而成的可生物降解的高分子聚合物，主要是以微生物的发酵产物L-乳酸作为单体通过聚合反应而获得。PLA因其原料为可再生的生物资源，被产业界一致认定为新世纪最有发展前途的新型“生物基材料”。此外，由PLA制成的产品光泽度、透明性、手感和耐热性好，还具有一定的耐菌性、阻燃性和抗紫外性，并具有较高的光泽度和加工性能；PLA还具有无毒、无刺激性和良好的生物相容性等特点。因此，PLA具有广阔的市场前景，用途十分广泛，目前主要用于服装、建筑、农业、林业、造纸和医疗卫生等多个领域中。

随着对PLA研究的不断深入，国内外的许多研究学者已发现纯聚L-乳酸(PLLA)的多种性能不稳定，而加入适当比例的D-乳酸进行聚合可以提高其性能，拓宽了聚乳酸的应用范围。例如，PLLA由于性脆、抗冲击性差以及热不稳定性等缺点而在某些应用中受到限制，对此，如果控制将一定比例的D-乳酸与L-乳酸进行共聚合，可以获得高分子量的共聚物，从而加强聚乳酸的机械性能，例如抗冲击性、张力强度和延展性等，同时还可提高PLLA的热稳定性，加快PLLA的降解速度。另一方面，光学纯度大于99％的D-乳酸在医药、农药、化工等方面具有广泛应用。以高光学纯D-乳酸为原料聚合而成的聚乳酸材料能够替代普通化工产品聚合而成的塑料、纤维制品，应用在医用骨内固定物、香烟过滤头、纺织用高级纤维等高端消费领域，同时也是3D打印技术的主要原材料。

迄今为止，D-乳酸主要可通过化学合成法和微生物发酵法获得。化学合成法存在环境污染、成本昂贵、技术复杂、光学纯度较低等棘手问题，难以满足实际应用要求。相比之下，微生物发酵法利用葡萄糖等可再生资源为原料生产D-乳酸，具有生产成本低、产物光学纯度和安全性高、生产条件温和、污染小等优点，因此，目前全世界的D-乳酸工业生产绝大部分都是通过微生物发酵法进行的。然而，大多数乳酸菌只能同时生产L-乳酸和D-乳酸，只有极少数的天然乳酸菌和一些模式工程菌可用于专门生产D-乳酸。目前已知的D-乳酸发酵生产中采用的生产菌株有德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)等。

然而，在通过微生物发酵法大规模工业生产D-乳酸时，可选择的菌株仍然十分有限，需要进一步选育高产菌株，不断发掘新菌种，以期实现产量增加、纯度提高、成本降低、效益提高等目标。对于乳酸发酵菌株的筛选和改造，主要聚焦于如下三个方面：高产菌株的获得；耐环境胁迫菌株的选育；以及转基因工程菌株的构建。

其中，增强乳酸发酵菌株对环境胁迫的抵抗能力是提高乳酸发酵能力的重要手段之一。已有研究表明，通过提高乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的耐高糖浓度和耐高乳酸钙浓度的能力，可以提高其乳酸产量和产物光学纯度；通过提高鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的耐酸和耐糖能力，可以提高其乳酸产量和生物量。就此而言，在乳酸发酵工业中，耐高温菌株可以带来极大的优势，例如，利用耐高温菌株可以达到缩短生产周期、减少发酵生产中控温所需的能耗、节约冷却用水以及减少杂菌污染的可能性等有益效果。另一方面，采用基因工程手段对高产菌株进行改造以进一步提高其产酸效率或产物光学纯度等性能，从而获得符合期望的有用菌株也是本领域始终在追求的目标。

就此而言，对于能够以高产率和高光学纯度生产D-乳酸的耐高温重组D-乳酸生产菌株而言，目前还存在极大的改善空间。

发明内容

本发明的主要目的在于克服上述现有技术中的不足，提供一种能够在较高温度下快速生产高光学纯度D-乳酸的重组D-乳酸生产菌株以及利用该D-乳酸生产菌株生产D-乳酸的方法。具体而言，目前已知植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是典型的同型发酵乳酸菌，具有较强的乳酸生产能力和耐盐性，是潜在的工业应用菌株，然而，已发现的植物乳杆菌主要用于生产DL-乳酸，不能满足市场对D-乳酸的要求，对于利用植物乳杆菌在较高温度下快速生产高光学纯度的D-乳酸，本领域还罕有报道。对此，本发明从酒曲(大曲)样品中筛选得到了一种抗逆性高(在48℃下仍具备较高发酵能力)的植物乳杆菌菌株，并进一步利用基因工程技术对其进行改造，提升了其产酸效率和产物D-乳酸光学纯度(高达99％以上)，从而完成了本发明。

因此，根据第一个方面，本发明提供了D-乳酸生产菌株Lp-DA，所述D-乳酸生产菌株Lp-DA的分类名称为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2018年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16835。

根据第二个方面，本发明提供了利用所述D-乳酸生产菌株Lp-DA生产D-乳酸的方法，所述方法包括：在35℃～40℃(优选37℃)的发酵温度下在培养基中培养所述D-乳酸生产菌株Lp-DA，从而使所述D-乳酸生产菌株Lp-DA生长；在37℃～50℃(优选42℃～48℃、更优选42℃～45℃、特别优选45℃)的发酵温度下在培养基中培养所述D-乳酸生产菌株Lp-DA，从而在所述培养基中产生和积累D-乳酸；以及从所述培养基中收集D-乳酸。

有益效果

相比野生型植物乳杆菌，利用本发明的重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株Lp-DA生产D-乳酸时，产酸速度和产物光学纯度都得到显著提高，即，本发明的重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株Lp-DA具有显著提高的生产D-乳酸的产酸性能。相应地，通过使用本发明的重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株Lp-DA来发酵生产D-乳酸，可以大大改善D-乳酸的生产。同时，该重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株Lp-DA还具有发酵成本低、可缩短生产周期、减少发酵生产中控温所需的能耗、节约冷却用水、减少杂菌污染以及环境友好的优势。

本发明的其它特征和优势将通过以下具体实施方式进行详细说明。

附图说明

图1为示出了利用本发明的重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株Lp-DA生产D-乳酸时发酵产物D-乳酸的光学纯度(99％以上)的色谱图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

除非另有说明，下文所使用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法，例如可利用下列著作中描述的标准程序来实施：Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，USA(2001)；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，ElsevierScience Publishing，Inc.，New York，USA(1995)；以及Current Protocols in CellBiology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等著，John Wiley and Sons，Inc.)。

除非另有说明，下文所使用的材料、试剂等均可从商业途径得到。

本文使用的术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”通常都意味着统计学显著量的增加。然而，为避免疑义，术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”表示相比参比水平(例如野生型植物乳杆菌菌株中的水平)增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或相比参比水平增加在10％到100％之间的任意量；或相比参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。

本发明人发现，将从大曲样品中分离出来的菌株中筛选出的耐高温并且快速生产乳酸的植物乳杆菌菌株作为出发菌株，利用基因工程技术(例如但不限于同源重组)使这些植物乳杆菌菌株中的L-乳酸脱氢酶(L-(+)-lactate dehydrogenase，ldhL)和乳酸解旋酶(Lactate racemase)活性减弱或失活；并在这些植物乳杆菌菌株中引入或增强D-乳酸脱氢酶(D-(+)-lactate dehydrogenase，ldhD)活性，可提升其产酸效率和产物D-乳酸光学纯度。在本发明一些优选实施方式中，将从大曲样品中分离出来的菌株中筛选出的耐高温并且快速生产乳酸的植物乳杆菌菌株中的L-乳酸脱氢酶(ldh1和ldh2)基因和乳酸解旋酶基因larA敲除，并替换为植物乳杆菌的ldhD基因和德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)的乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A，ldhA)基因，可进一步提升上述植物乳杆菌菌株的产酸效率和产物D-乳酸光学纯度(高达99％以上)。

在本发明的涉及同源重组的实施方式中，优选通过同源重组来敲除植物乳杆菌菌株、特别是上述耐高温乳酸生产植物乳杆菌菌株基因组中的特定开放阅读框序列或启动子序列。同源敲除中使用的同源序列片段可以通过如下方式获得：根据本领域公知的数据库(例如GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/))上公开的植物乳杆菌菌株中的靶基因(例如ldh1和ldh2基因以及乳酸解旋酶基因)序列进行人工合成；或者利用PCR的方法从植物乳杆菌菌株的基因组上扩增靶基因，从而获得靶基因的初始同源序列片段，但本发明不限于此。在此，靶基因的部分或全部初始同源序列是指含有上述靶基因的序列。此外，同源敲入中使用的同源序列片段(涉及例如植物乳杆菌的ldhD基因和德氏乳杆菌的ldhA基因)也可通过类似的方式获得，但本发明不限于此。

本领域已知构建重组载体的各种方法，以用来将目的基因片段连接至表达载体来制备重组载体，例如但不限于，经典的“酶切-连接”方法、Invitrogen公司开发的Gateway克隆系统、Clontech公司开发的Creator克隆系统、Stephen Elledge实验室开发的Univector克隆系统以及基于IIs型限制性内切酶的Golden Gate克隆法(诸如，采用ThermoFisher提供的GeneArt Type IIs Assembly Kits试剂盒)。

例如，可采用重组酶方法构建得到本发明的重组载体：基于植物乳杆菌出发菌株的基因组，采用PCR方法扩增得到靶向插入部位的上下游同源臂序列；将待插入基因序列、上下游同源臂序列及抗性基因表达盒等串联连接，得到重组载体，但本发明不限于此。

随后，可采用本领域的常规方法将该重组载体导入植物乳杆菌出发菌株中，例如但不限于显微注射、基因枪、转化(例如电转化)、感染或转染。上述显微注射、基因枪、转化、感染或转染均为本领域常规操作。例如，转化是指通过采用分子生物学和基因工程中的一些已知方法处理细胞，使经处理后的细胞处于感受态，并由此与外源DNA接触，从而使外源DNA进入处于感受态的细胞中。常用的转化方法包括原生质体转化法、化学转化法和电穿孔转化法。感染是指用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，将该载体与目的DNA序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，从而以感染的方式使重组DNA进入宿主细胞中。转染是指通过CaCl₂、电穿孔等方法将细胞处理成感受态细胞，然后使该感受态细胞接受重组的噬菌体DNA。

在将重组载体导入植物乳杆菌出发菌株中之后，可通过筛选标记(例如抗性基因)筛选出阳性克隆，并通过基因组PCR进行验证、或者通过对基因组DNA测序进行验证，从而得到重组植物乳杆菌菌株。

在本发明的发酵生产D-乳酸的方法中，对本发明的重组D-乳酸生产菌株Lp-DA进行发酵培养可以获得D-乳酸。其中，除了在较高温度下(例如37℃～50℃，优选42℃～48℃、更优选42℃～45℃、特别优选45℃)进行发酵之外，发酵培养的方法可以为本领域常规用于D-乳酸生产的发酵方法。除了在较高温度下(例如37℃～50℃，优选42℃～48℃、更优选42℃～45℃、特别优选45℃)进行发酵之外，可利用植物乳杆菌的标准培养方法制备本发明重组D-乳酸生产菌株Lp-DA的种子液和发酵液。例如，发酵培养的方法可包括以下步骤：将新鲜制备的D-乳酸生产菌株或低温冻存的D-乳酸生产菌株(例如在甘油冻存管中冻存于例如-80℃冰箱中的D-乳酸生产菌株)接种于植物乳杆菌液体培养基中进行活化并过夜培养制得种子液；将上述种子液接种至D-乳酸产酸发酵培养基中(例如装有D-乳酸产酸发酵培养基的摇瓶或发酵罐中)扩大培养制得发酵液。

例如，所述种子液可通过如下过程制备：从平板上挑取植物乳杆菌单菌落接种于种子液培养基中，以转速100-200rpm(优选150-180rpm)在35-40℃(优选37℃)下培养12～24h，即得种子液。在本发明一个优选实施方式中，所述种子液培养基为MRS液体培养基。

例如，所述发酵液可通过如下过程制备：以5％-10％体积的接种量将种子液接种至置于例如摇瓶或发酵罐中的产酸发酵培养基中，以转速100-200rpm(优选150-180rpm)在35-40℃(优选37℃)下发酵3-6h(优选4-5h)，然后再以转速100-200rpm(优选150-180rpm)在37-50℃(优选42-48℃、更优选42℃～45℃、特别优选45℃)下连续发酵48-72h，即得发酵液。其中，所述产酸发酵培养基包含葡萄糖、有机氮源(例如酵母提取物)、乙酸钠、磷酸盐、微量元素和中和剂。在本发明一个优选实施方式中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：葡萄糖100-200g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L、MnSO₄ 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及合适的中和剂。在本发明一个更为优选的实施方式中，所述中和剂为CaCO₃，并且中和剂CaCO₃的浓度为糖浓度的一半，但本发明并不限于此。在本发明一个特别优选的实施方式中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：葡萄糖150-180g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L、MnSO₄ 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及CaCO₃ 75-90g/L。

在完成发酵培养后，可以通过已知方法收集产酸发酵培养基中积累的D-乳酸。例如，可以通过包括在除去细胞后浓缩产酸发酵培养基以使产物结晶、离子交换层析和诸如此类的方法来分离D-乳酸。

同时，在完成发酵培养后，还可以通过已知方法对产酸发酵培养基中积累的D-乳酸或所分离的D-乳酸进行检测。例如，可以通过高效液相色谱法和诸如此类的方法来对D-乳酸的产量和光学纯度进行检测。

实施例

接下来，通过以下实施例对本发明进行更详细的说明，但这些实施例仅用于说明本发明而不用来限制本发明的范围。下述实施例中，除非特别说明，所用试剂、培养基均为市售商品，所用方法均为常规方法。

1.培养基

MRS液体培养基：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸二铵2.0g、无水乙酸钠5.0g、硫酸锰0.25g、硫酸镁0.58g、吐温80 1.0mL、蒸馏水1000mL，pH 6.5，121℃灭菌15～20min；MRS固体培养基：在上述MRS液体培养基中添加琼脂18g，调节pH后高压灭菌；

MRS+CaCO₃平板：MRS固体培养基+10g/L CaCO₃；

产酸发酵培养基：葡萄糖160-180g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄ 0.2g/L、吐温80 1ml/L、CaCO₃ 90g/L。

2.高效液相色谱法检测发酵液中的乳酸

色谱仪：Agilent Technologies 1260Infinity II；

检出器：RID；

分离柱：Aminex HPX-87H Column 300×7.8mm；

流动相：0.005M硫酸；

流量：0.5mL/min；

进样量：20μL。

乳酸保留时间为14min左右。

3.高效液相色谱法检测乳酸的光学纯度

色谱仪：Agilent Technologies 1260Infinity；

检出器：波长254nm，灵敏度0.32AUFS；

分离柱：MCI GEL-CRS10W(3u)4.6ID×50mm；

流动相：0.002M硫酸铜；

流量：0.5mL/min；

进样量：20μL。

将发酵液上清稀释至乳酸浓度为约0.5-1g/L后再进行检测，D-乳酸保留时间为11min左右，L-乳酸保留时间为13min左右，根据其峰面积计算D-乳酸的光学纯度。

实施例1：菌株分离和鉴定

菌株分离筛选：将1g大曲样品捣碎后用10mL无菌生理盐水溶解，充分混匀30min；取上述稀释液10倍梯度稀释后涂布于含1％(w/v)CaCO₃(中和剂)的MRS固体培养基上，37℃培养24小时，挑取透明圈较大的菌落接种MRS培养基，37℃150rpm培养1小时，取5μl培养液点在MRS+CaCO₃固体平板上，将平板放置于45℃培养箱中培养40小时；挑选平板中菌落生长较快并且溶钙圈较大的单菌落再次转接MRS培养基，37℃150rpm培养1小时，取5μl培养液点在MRS+CaCO₃固体平板上，将平板放置于48℃培养箱中培养。挑选其中溶钙圈比较明显的备选菌株进行发酵摇瓶实验。将备选菌株接种MRS培养基，37℃150rpm过夜培养获得种子液，在30mL产酸发酵培养基中按照10％(v/v)的比例接种上述种子液，37℃150rpm摇床培养3-5小时让菌株生长，然后升温到45℃或48℃，继续以150rpm摇床培养72小时获得发酵液。发酵结束后通过高效液相色谱检测发酵产物中的乳酸，筛选出高温条件下产乳酸较快、乳酸产量较高的菌株。

菌株鉴定：挑选的菌株具有菌落在MRS固体培养基上呈白色圆形凸起不透明菌落；镜检细胞形态呈直或弯的杆状，单个或成对呈链状排列等特征，基本符合植物乳杆菌的各项特征。进而，采用16S rDNA测序鉴定方法确认了该菌株与植物乳杆菌最接近，从而将其鉴定为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌Lp43#。

具体而言，通过上述菌株分离方法从大曲样品中分离得到大量乳酸生产菌株，其中，第一轮37℃培养时溶钙圈较大的菌株中有近1/3为植物乳杆菌；第二轮45℃培养时仍产乳酸的植物乳杆菌比例明显减小；第三轮48℃培养时仅剩植物乳杆菌Lp43#仍产乳酸。

进而，在30mL摇瓶水平下，45℃发酵时植物乳杆菌菌株Lp43#72h可发酵生产乳酸153.48g/L，糖酸转化率为95％；而其它植物乳杆菌中乳酸产量最高的一株45℃发酵时72h仅可发酵生产乳酸80.08g/L。甚至在30mL摇瓶水平下48℃发酵时，植物乳杆菌菌株Lp43#仍然具有较高的发酵产乳酸能力，同样优于其它分离到的植物乳杆菌菌株。

实施例2：重组质粒构建

基因敲除质粒构建：分别扩增大肠杆菌复制子p15Aori(序列来自商业载体pACYC)、红霉素抗性基因(序列来自商业载体pMG36e)、待敲除基因CDS上游1000bp序列(序列扩增自Lp43#基因组)、氯霉素抗性基因(序列来自商业载体pNZ8148)和待敲除基因CDS下游1000bp序列(序列扩增自Lp43#基因组)，使用DNA Assembly重组试剂盒(购于Transgen公司)组装成为基因敲除质粒。该基因敲除质粒可在大肠杆菌中复制，不可在乳酸菌中复制，并且具有可用于大肠杆菌和植物乳杆菌中的红霉素和氯霉素抗性基因。为敲除植物乳杆菌ldh1基因(Gene ID：1061886)、ldh2基因(Gene ID：1063343)和larA基因(Gene ID:1061369)，分别构建了pKO-Lpldh1、pKO-Lpldh2和pKO-LplarA三个基因敲除质粒。

基因插入质粒构建：分别合成待插入基因ldhD(Gene ID：1061762)和ldhA(GeneID：4085369)基因的CDS序列，并在起始密码子之前和终止密码子之后分别加入XhoI和BamHI酶切位点，双酶切获得待插入基因的片段；将前面构建的pKO质粒同样用XhoI和BamHI双酶切获得去除了氯霉素抗性基因的片段(包含复制子p15Aori、红霉素抗性基因和上下游同源臂序列)，将经过同样双酶切并纯化后的载体和基因片段连接后获得基因插入质粒。该基因插入质粒可在大肠杆菌中复制，不可在乳酸菌中复制，并且具有可用于大肠杆菌和植物乳杆菌中的红霉素抗性基因。为插入植物乳杆菌ldhD基因和德氏乳杆菌ldhA基因，分别构建了pKI-Lpldh1:ldhA、pKI-Lpldh2:ldhA和pKI-LplarA:ldhD三个基因插入质粒。

用于扩增各同源臂的引物序列信息如下。

ldh1同源臂扩增：

ldh1-up-F：

ctcatgttagtcatgcccCGGTGATTAGTTGCCGACTAC(SEQ ID NO.1)

ldh1-up-R：

aactgcatggtaccgatcTCGAGTCATCCTCTCGTAGTGAAAATT(SEQ ID NO.2)

ldh1-down-F：

gtcggttttctaatgtggatccATTTCATACGATTAAATGTATGATGAACGC(SEQ ID NO.3)

ldh1-down-R：

gctcagcgggagctcatgCAGCGTTTTGGTCTAAACTTAC(SEQ ID NO.4)

ldh2同源臂扩增

ldh2-up-F：

ctcatgttagtcatgcccTTGTTTGTCGAATCATCCGTATCACC(SEQ ID NO.5)

ldh2-up-R：

catggtaccgatctcgaGTCAATATCCTTCTTTCATCAAAAATGTGTG(SEQ ID NO.6)

ldh2-down-F：

gttttctaatgtggatccAAATGATGAGTAAGTATGAGGAGGAATTG(SEQ ID NO.7)

ldh2-down-R：

gctcagcgggagctcatgTTCCAAGCACCAGTTTCGTGTAG(SEQ ID NO.8)

larA同源臂扩增：

larA-up-F：

ctcatgttagtcatgcccAGACGGGAGCCATCGCGGTGACCAA(SEQ ID NO.9)

larA-up-R：

gcatggtaccgatctcgaGACTTTTAGCCATCCTCTTTCTCTAAA(SEQ ID NO.10)

larA-down-F：

ggttttctaatgtggatccTATGGCAACCACAGCAGAAATATTAC(SEQ ID NO.11)

larA-down-R：

ctcagcgggagctcatgGATGGTGATGTTCCACAAAACCATG(SEQ ID NO.12)

实施例3：菌株同源重组

植物乳杆菌电转化方案：接种平板活化的实施例1中得到的植物乳杆菌Lp43#单菌落于4mL MRS培养基中37℃过夜培养，按照初始OD₆₀₀＝0.2转接至100mL含1％甘氨酸的MRS培养基中，37℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.6；菌液冰浴20min，4℃、8000×g离心15min收集菌体；用100mL 4℃预冷的1mM MgCl₂和30％PEG1000依次冲洗菌体各1次；用1mL 4℃预冷的30％PEG1000重悬菌体，每份分装100μL感受态。每份感受态细胞加入5μg实施例2中制备的相应重组质粒，冰浴10min，使用0.2cm电转杯，1.5kV、25F、200Ω电击，迅速加入0.8mL MRS-SM培养基(在MRS培养基中加入0.5M蔗糖和0.1M MgCl₂)，37℃复苏培养2h，离心1min，去掉部分上清后重悬涂布于含对应抗生素的MRS平板上，37℃培养2天获得单菌落。

ldh1基因敲除菌株制备：在实施例1中得到的植物乳杆菌Lp43#中转入pKO-Lpldh1基因敲除质粒，10μg/ml氯霉素抗性筛选获得阳性转化子，挑选1-2个阳性转化子用含10μg/ml氯霉素的MRS液体培养基传代培养用于筛选第二次交换的菌株，经菌落PCR及测序确认目标基因已敲除，即获得目标基因敲除的植物乳杆菌菌株ldh1。

Lpldh1:ldhA基因敲入菌株制备：在植物乳杆菌菌株ldh1中转入pKI-Lpldh1:ldhA基因插入质粒，20μg/ml红霉素抗性筛选获得阳性转化子，挑选1-2个阳性转化子用无抗MRS液体培养基传代培养用于筛选第二次交换的菌株，经菌落PCR及测序确认目标基因已插入到基因组中对应位置，即获得目标基因敲入的植物乳杆菌菌株ldh1:ldhA。

依照上述方法，依次用pKO-Lpldh1、pKI-Lpldh1:ldhA、pKO-Lpldh2、pKI-Lpldh2:ldhA、pKO-LplarA、pKI-LplarA:ldhD重组质粒对实施例1中得到的植物乳杆菌Lp43#进行基因替换(敲除&敲入)，最终获得的菌株仅合成D-乳酸，并且基因组中无抗性基因。

将该进行同源重组得到的植物乳杆菌菌株(敲除了植物乳杆菌ldh1基因、ldh2基因和larA基因；并敲入了植物乳杆菌ldhD基因和德氏乳杆菌ldhA基因)命名为植物乳杆菌Lp-DA(也称为重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株Lp-DA或重组D-乳酸生产菌株Lp-DA)。该重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株Lp-DA于2018年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16835。

实施例4：菌株发酵生产D-乳酸

将实施例3中得到的重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株Lp-DA接种MRS培养基，37℃150rpm过夜培养获得种子液。然后，在100mL产酸发酵培养基中按照10％(v/v)的比例接种上述种子液，37℃180rpm摇床培养4小时让菌株生长，然后升温到45℃，继续以180rpm摇床培养68小时获得发酵液(总发酵时间72小时)。发酵结束后通过高效液相色谱测定乳酸总产量和D-乳酸光学纯度。

其结果是，在100mL摇瓶水平下45℃发酵时，植物乳杆菌菌株Lp43#72h可发酵生产乳酸159.04g/L，糖酸转化率为95％，D-乳酸光学纯度仅为50％；而重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株Lp-DA 72h可发酵生产乳酸172.26g/L，糖酸转化率为96％，D-乳酸光学纯度为99％以上。

考虑到D-乳酸工业生产通常要求产物光学纯度达到99％以上，该重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株Lp-DA提供了可满足工业需求的又一选择。

工业实用性

以上研究表明，本发明的D-乳酸生产菌株Lp-DA在D-乳酸生产速度和产物光学纯度方面显著优于未经筛选的其它植物乳杆菌(其它植物乳杆菌在高温下根本无法生产乳酸)以及未经基因工程改造的植物乳杆菌Lp43#(相比Lp43#，D-乳酸生产菌株Lp-DA生产乳酸的速度提高8.3％；D-乳酸光学纯度大幅提高到99％以上)。因此，本发明提供了一种发酵成本低、环境友好、D-乳酸生产速度快并且产物光学纯度高的新型生产菌株，为D-乳酸的工业化微生物发酵生产提供了更优的潜在选择。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变型，这些变型均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林中粮生化有限公司

<120> 一种重组D-乳酸生产植物乳杆菌菌株及利用该菌株生产D-乳酸的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcatgttag tcatgccccg gtgattagtt gccgactac 39

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aactgcatgg taccgatctc gagtcatcct ctcgtagtga aaatt 45

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcggttttc taatgtggat ccatttcata cgattaaatg tatgatgaac gc 52

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcagcggg agctcatgca gcgttttggt ctaaacttac 40

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcatgttag tcatgccctt gtttgtcgaa tcatccgtat cacc 44

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catggtaccg atctcgagtc aatatccttc tttcatcaaa aatgtgtg 48

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttttctaat gtggatccaa atgatgagta agtatgagga ggaattg 47

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctcagcggg agctcatgtt ccaagcacca gtttcgtgta g 41

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctcatgttag tcatgcccag acgggagcca tcgcggtgac caa 43

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcatggtacc gatctcgaga cttttagcca tcctctttct ctaaa 45

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggttttctaa tgtggatcct atggcaacca cagcagaaat attac 45

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctcagcggga gctcatggat ggtgatgttc cacaaaacca tg 42

Claims

1.一种D-乳酸生产菌株Lp-DA，所述D-乳酸生产菌株Lp-DA的分类名称为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2018年11月28日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.16835。

2.利用如权利要求1所述的D-乳酸生产菌株Lp-DA生产D-乳酸的方法，所述方法包括：

在35℃～40℃的发酵温度下在培养基中培养所述D-乳酸生产菌株Lp-DA，从而使所述D-乳酸生产菌株Lp-DA生长；

在37℃～50℃的发酵温度下在培养基中培养所述D-乳酸生产菌株Lp-DA，从而在所述培养基中产生和积累D-乳酸；以及

从所述培养基中收集D-乳酸。

3.如权利要求2所述的方法，其中，

在37℃的发酵温度下在培养基中培养所述D-乳酸生产菌株Lp-DA，从而使所述D-乳酸生产菌株Lp-DA生长。

4.如权利要求2所述的方法，其中，

在42℃～48℃的发酵温度下在培养基中培养所述D-乳酸生产菌株Lp-DA，从而在所述培养基中产生和积累D-乳酸。

5.如权利要求2所述的方法，其中，

在42℃～45℃的发酵温度下在培养基中培养所述D-乳酸生产菌株Lp-DA，从而在所述培养基中产生和积累D-乳酸。

6.如权利要求2所述的方法，其中，

在45℃的发酵温度下在培养基中培养所述D-乳酸生产菌株Lp-DA，从而在所述培养基中产生和积累D-乳酸。

7.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

将新鲜制备的D-乳酸生产菌株Lp-DA或低温冻存的D-乳酸生产菌株Lp-DA接种于植物乳杆菌液体培养基中进行活化；

过夜培养制得种子液；以及

将所述种子液接种至D-乳酸产酸发酵培养基中扩大培养制得发酵液。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述种子液通过如下过程制备：

从平板上挑取D-乳酸生产菌株Lp-DA单菌落接种于种子液培养基中，以转速100-200rpm在35-40℃下培养12～24h，即得种子液。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述种子液通过如下过程制备：

从平板上挑取D-乳酸生产菌株Lp-DA单菌落接种于种子液培养基中，以转速150-180rpm在37℃下培养12～24h，即得种子液。

10.如权利要求8所述的方法，其中，所述种子液培养基为MRS液体培养基。

11.如权利要求9所述的方法，其中，所述种子液培养基为MRS液体培养基。

12.如权利要求7所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：

以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-200rpm在35-40℃下发酵3-6h，然后再以转速100-200rpm在37-50℃下连续发酵48-72h，即得发酵液。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：

以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-200rpm在35-40℃下发酵3-6h，然后再以转速100-200rpm在42℃～48℃下连续发酵48-72h，即得发酵液。

14.如权利要求12所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：

以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-200rpm在35-40℃下发酵3-6h，然后再以转速100-200rpm在42℃～45℃下连续发酵48-72h，即得发酵液。

15.如权利要求12所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：

以5％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速100-200rpm在35-40℃下发酵3-6h，然后再以转速100-200rpm在45℃下连续发酵48-72h，即得发酵液。

16.如权利要求12所述的方法，其中，所述发酵液通过如下过程制备：

以8％-10％体积的接种量将所述种子液接种至产酸发酵培养基中，以转速150-180rpm在37℃下发酵4-5h，然后再以转速150-180rpm在45℃下连续发酵48-72h，即得发酵液。

17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基包含葡萄糖、有机氮源、乙酸钠、磷酸盐、微量元素和中和剂。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述有机氮源为酵母提取物。

19.如权利要求17所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：葡萄糖100-200g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L、MnSO₄ 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及CaCO₃ 50-100g/L。

20.如权利要求17所述的方法，其中，所述产酸发酵培养基包含如下成分：葡萄糖150-180g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L、MnSO₄ 0.1-0.2g/L、吐温80 1ml/L以及CaCO₃ 75-90g/L。