CN104245920A - 分离自茶树叶的新型植物乳杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新型植物乳杆菌菌株以及含有该新型植物乳杆菌菌株或其培养基的组合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离自茶树（Camellia sinensis）叶的新型植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
背景技术
用来饮用的茶是将茶科属茶树的嫩芽或叶子中存有的加氧酶失活并从中去除水分而获得的。它不仅含有维生素，而且还包含咖啡因、单宁、类黄酮、植物精油等，而且已被广泛地应用于各种领域，如食品领域。
发明内容
技术问题
本发明涉及提供一种新型植物乳杆菌菌株。进一步，本发明涉及提供包含该新型植物乳杆菌菌株或其培养液的组合物。
技术方案
在一方面，本发明提供植物乳杆菌APsulloc331261菌株。
在一方面，本发明提供植物乳杆菌APsulloc331263菌株。
在一方面，本发明提供植物乳杆菌APsulloc331266菌株。
在一方面，本发明提供植物乳杆菌APsulloc331269菌株。
在另一方面，本发明提供包含选自植物乳杆菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263菌株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一种、或其培养液的组合物。
有益效果
本发明的新型植物乳杆菌菌株具有优秀的耐酸性，因此，它被当作食品摄取时还能在胃中生存下来，进一步，它还可具有较高的肠道抵达率。本发明的植物乳杆菌菌株具有优秀的胆汁酸耐性，从而它能很好地固定于肠道内。进一步，本发明的植物乳杆菌菌株具有优秀的抗菌活性，从而它具有优秀的抑制有害细菌的作用。在生成的乳酸中，本发明的植物乳杆菌菌株相比现有的植物乳杆菌菌株具有更低的D-乳酸比率。因此，甚至对乳酸敏感的成人或婴幼儿也可以自由摄取所述菌株。本发明的植物乳杆菌菌株能够生成比现有植物乳杆菌更少量的乳酸，从而用该植物乳杆菌菌株发酵食品时，该食品会具有温和的口感。因此，本发明的新型植物乳杆菌菌株可广泛地应用于各种领域，例如食品领域。
具体实施方式
乳酸菌是通过降解糖，如葡萄糖，而产生乳酸的细菌。由乳酸菌通过乳酸发酵而生成的乳酸可抑制病原体和有害细菌的生长，而此特性被用来制作如乳制品、泡菜、酿造食品等的食品。进一步，乳酸菌栖息于哺乳动物的肠道内，并抑制由各种杂菌所引起的异常发酵，从而这些是用作肠道疾病药品的重要细菌。
植物乳杆菌是属乳酸菌的一种菌株，已知主要在泡菜已发酵充足并有酸味时进行生长。所生成的乳酸的光学异构体为D型和L型。植物乳杆菌可广泛用于各种需要发酵的食品中。因此，如能开发出具有优秀的耐酸性、胆汁酸耐性和抗菌活性的植物乳杆菌，可有益地投入使用。
下面，将详细说明本发明。
本发明一方面提供植物乳杆菌APsulloc331261（保藏编号：KCCM11179P）菌株。本发明一方面提供植物乳杆菌APsulloc331263（保藏编号：KCCM11180P）菌株。本发明一方面提供植物乳杆菌APsulloc331266（保藏编号：KCCM11181P）菌株。本发明一方面提供植物乳杆菌APsulloc331269（保藏编号：KCCM11182P）菌株。
本发明的植物乳杆菌APsulloc331261、APsulloc331263、APsulloc331266和APsulloc331269中的至少一种植物乳杆菌是一种分离自茶树（Camellia sinensis）叶的菌株，并属于植物乳杆菌。具体地，本发明的植物乳杆菌可用以下方法进行分离，该方法包括：在基于茶树叶重量5~15
wt%的盐中腌制茶树叶的步骤；将所述腌制过的茶树叶与糖溶液如0.1~3%低聚果糖进行混合后在25～35℃下培养1～5天的步骤；以及，取所述被培养至pH值小于5的溶液后在25～35℃厌氧条件下培养1～5天的步骤。
根据本发明一方面的植物乳杆菌APsulloc331261、APsulloc331263、APsulloc331266和APsulloc331269中的至少一种具有优秀的耐酸性。当摄入作为益生菌的乳酸菌如植物乳杆菌时，为能发挥乳酸菌所特有的效果，优选具有更高肠道抵达率的乳酸菌。为了提高肠道抵达率，在因胃酸分泌而pH值低的胃中的生存率应当要高。已知，胃处于空腹时的pH值为约1.2～2，然而进食后pH值可为约2～3。本发明的植物乳杆菌菌株可在pH值高于2至4，具体高于2至3.5或高于2.5至4，更具体高于2.5至3.5，进一步具体高于2.5至3时具有优秀的耐酸性。另一方面，当摄入食物时，已知食物的平均停留时间可以为约1～3小时。本发明的植物乳杆菌菌株可以在0.5～5小时内，具体在1～4小时内，并在pH值高于2至4，具体高于2至3.5或高于2.5至4，更具体高于2.5至3.5，进一步具体高于2.5至3时具有优秀的耐酸性。本发明的植物乳杆菌菌株在胃中停留时甚至在低pH的胃中还能够生存，因此当作食物被摄取时其可具有高的肠道抵达率。
在本发明的一方面，所述植物乳杆菌菌株具有优秀的胆汁酸耐性。经过胃的食物会被送至小肠内，此时，所分泌的胆汁酸会帮助食物消化。已知，高胆汁酸耐性的菌株会具有良好的肠道固定能力。在本发明的一方面，所述具有优秀的胆汁酸耐性的植物乳杆菌菌株具有卓越的肠道固定能力。
在本发明的一方面，所述植物乳杆菌菌株具有乳酸产生能力。通常，由乳酸菌产生的乳酸可以为L型和D型。其中，D-乳酸的体内代谢率不及L-乳酸。因此，高的血液D-乳酸浓度可引起乳酸中毒。从而，如有可能，对乳酸敏感的成人或婴幼儿最好不要摄取能够大量产生D-乳酸的乳酸菌。
在本发明的另一方面，所述植物乳杆菌菌株可生成含有D型的乳酸，该D型乳酸的含量为75%或以下，具体为70%或以下，更具体为65%或以下。
在本发明的进一步另一方面，所述植物乳杆菌菌株可以生成乳酸，该乳酸的含量为17.5g/L或以下，具体为17g/L或以下，更具体为16.5g/L或以下，进一步具体为15g/L或以下，进一步更具体为14.5g/L或以下，进一步更具体为14g/L或以下，进一步更具体为13.5g/L或以下。
如此以来，由于本发明的植物乳杆菌菌株能够产生比现有植物乳杆菌含有更少D型的乳酸，对乳酸敏感的成人或婴幼儿可以自由食用。进一步，由于它的乳酸产量低于现有的植物乳杆菌，当用其发酵食品时，可使食品具有更温和的口感。
本发明的一方面提供植物乳杆菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263菌株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一种的提取物或培养液。本发明的另一方面提供含有植物乳杆菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263菌株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一种、其提取物或其培养液的组合物。
本发明的一方面提供含有植物乳杆菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263菌株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一种、其提取物或其培养液的食品组合物。
所述食品组合物可以为保健食品组合物，还可以为发酵食品组合物，即需要发酵的食品，如茶、乳制产品、泡菜、酿制食品。
所述食品组合物的剂型不会受到特别限制，例如，可被制成片剂、丸剂、硬或软胶囊剂、颗粒剂、饮剂、焦糖、减肥棒、茶包等。除活性成分外，所述保健食品组合物可进一步包含常用的其他成分，本领域的技术人员根据所述组合物的剂型或目的可适当选取其他成分。其他成分的加入可能会带来协同效果。
所述活性成分剂量的确定是在本领域技术人员的能力范围内。例如，其每日剂量可以为约105～1013 CFU/天的植物乳杆菌，更具体为106～1010CFU/天，但不限于此，并且可根据受试者的年龄、身体状况、并发症等各种因素而有所变化。
本发明的一方面提供含有植物乳杆菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263菌株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一种、其提取物或其培养液的化妆品组合物。该化妆品组合物可被制成适于局部应用的任一剂型。可被制成以下剂型，如水包油乳剂、油包水乳剂、悬浮液、固体、凝胶、粉剂、浆糊、泡沫剂或气溶胶组合物。可通过使用本领域的传统方法来制备所述剂型的组合物。
所述化妆品组合物可进一步包含其他成分，其不会对主要效果产生不利影响，相反会给主要效果带来协同效果。本发明的化妆品组合物可包含选自维生素、聚合肽、多糖和鞘脂类中的物质。进一步，本发明的化妆品组合物可包含保湿剂、润肤剂、表面活性剂、UV吸收剂、防腐剂、消毒剂、抗氧化剂、pH调节剂、有机和无机染料、芳香剂，冷却剂或止汗剂。所述成分的含量可以在对本发明的目的及效果不会产生不利影响的范围内进行适当选取，该含量可以为基于所述组合物总重量的0.01～5wt%，具体为0.01～3wt%。
本发明的一方面提供含有选自植物乳杆菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263菌株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一种、其提取物或其培养液的药物组合物。该药物组合物可以被用来预防或治疗肠道疾病，如肠易激综合征、便秘和腹泻。
在本发明一方面，所述药物组合物可口服或肠胃外给药，例如直肠给药、局部给药、经皮给药、静脉内给药、肌内给药、腹腔内给药、皮下给药等。口服给药剂型的例子包括片剂、丸剂、软或硬胶囊剂、颗粒剂、粉剂、微颗粒剂、溶液、乳剂、微丸剂等，但不限于此。肠胃外给药剂型的例子包括溶液、悬浮液、洗剂、凝胶、注射溶液、滴剂、栓剂、贴剂或喷雾剂，但不限于此。所述剂型可根据传统方法容易制得，而且可对所述剂型适当地使用表面活性剂、赋形剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、用于控制渗透压的盐或缓冲液、着色剂、增味剂、稳定剂、防腐剂、腌制剂或其他常用添加剂。
在本发明一方面，所述药物组合物的活性成分会根据受试者的年龄、性别和体重、待治疗的病理状况、该病理状态的严重程度、给药途径及医生诊断而不同。考虑到这些因素，其剂量的判断可在本领域技术人员的能力范围内。例如，每日剂量可以为0.1~5000mg/kg/天，具体为50~500mg/kg/天，但不限于此。
在2011年3月28日将植物乳杆菌APsulloc331261、APsulloc331263、APsulloc331266和APsulloc331269存放到韩国微生物培养中心（KCCM，地址：韩国首尔市西大门区弘济一洞361-221儒林大厦，120-091），保藏编号分别为KCCM11179P、KCCM11180P、KCCM11181P和KCCM11182P。
(1)
植物乳杆菌APsulloc 331261
保藏机构名称：韩国微生物培养中心
保藏编号：KCCM11179P
保藏日期：2011年3月28日
(2) 植物乳杆菌APsulloc 331263
保藏机构名称：韩国微生物培养中心
保藏编号：KCCM11180P
保藏日期：2011年3月28日
(3) 植物乳杆菌APsulloc 331266
保藏机构名称：韩国微生物培养中心
保藏编号：KCCM11181P
保藏日期：2011年3月28日
(4) 植物乳杆菌APsulloc 331269
保藏机构名称：韩国微生物培养中心
保藏编号：KCCM11182P
保藏日期：2011年3月28日
下面，将结合实施例（以及实验）详细说明本发明的新型植物乳杆菌的分离方法、鉴定方法和特性。然而，以下实施例（以及实验）仅用于说明为目的，不会限制本发明的范围。
【实施例1】植物乳杆菌的分离
用蒸馏水清洗200g茶树叶两次，以清除杂质。去除所清洗的茶树叶上的水分。然后，将所述茶树叶与基于该茶树叶总重量8wt%的食盐混合，之后在室温下保存3小时。将用盐腌制的茶树叶与1000mL的1%低聚果糖溶液混合，之后在32℃的培养器中培养三天。三天后，检查所培养的溶液的pH值是否降到低于5，如果pH值低于5，收集所培养的溶液并在Difco Lactobacilli MRS Agar®培养基中进行培养。此时，该培养在32℃厌氧室内进行两天，然后收集白色菌落。
通过上述方法，从茶树叶中分别分离出植物乳杆菌APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269。
【实施例2】植物乳杆菌的鉴定
（1）菌株培养
用实施例1中所分离出的APsulloc
331261在MRS琼脂板上进行划线，之后在37℃下培养两天。将所得的单菌落接种在10mL MRS肉汤中，然后在37℃下培养一夜来制备植物乳杆菌菌株培养液。分别对所述的APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc
331269实施上述方法，而制备出植物乳杆菌菌株培养液。
（2）植物乳杆菌菌株的糖发酵类型的分析
将如（1）中所述而制备出的APsulloc
331261菌株培养液接种于10mL MRS肉汤中，浓度为0.5%，之后在37℃下培养一夜。在8,000rpm下离心分离所述培养液5分钟，去除上清液，而后只收集细菌。然后，在所述细菌中加入2mL的0.85%生理盐水缓冲液并进行悬浮。通过使用API
50CHL装置（Biomerieux）按照制造商的规定进行之后的步骤。具体步骤如下。
首先，慢慢地将所述菌株悬浮液加入于5mL API悬浮培养基中，来测定浊度约2麦氏比浊标准（Biomerieux）时所需的悬浮液量。将所测悬浮液量的2倍的悬浮液加入到10mL
API 50CHL培养基中，然后摇晃混合。将上述混合物加入到装有不同基底的小杯内，其中滴入一滴矿物油，然后在37℃下培养所述混合液2天，而分析出糖发酵类型。对APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc
331269菌株的各培养液重复上述方法，而分析糖发酵类型。
在以下表中展示了APsulloc 331261、APsulloc
331263、APsulloc 331266和APsulloc 331269与作为标准菌株的植物乳杆菌菌株（KCTC3108）相比之下的糖发酵类型的结果、以及用上述结果对APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269作出的鉴定结果。表1为APsulloc 331261，表2为APsulloc 331263，表3为APsulloc 331266，以及表4 APsulloc 331269。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
+ ：底物被分解，- ：底物未被分解，？：无法确定
【表5】
如上述可知，所述APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269都示出与植物乳杆菌的一致性（%指数）达到了99%或更高。由此确定，那些菌株属于植物乳杆菌。
进一步，与所述标准菌株（KCTC3108）相比，APsulloc
331261在α-甲基-甘露糖苷和棉子糖的使用上有区别，APsulloc 331263在α-甲基-甘露糖苷、棉子糖和D-松二糖的使用上有区别，APsulloc 331266在α-甲基-甘露糖苷和棉子糖的使用上有区别，而APsulloc 331269在L-阿拉伯糖和棉子糖的使用上有区别。由此确定，它们都是与所述标准菌株不同的菌株。
（3）植物乳杆菌菌株的酶活性类型的分析
将如（1）中所述而制备出的APsulloc
331261菌株培养液接种于10mL MRS肉汤中，浓度为0.5%，之后在37℃下培养一夜。在8,000rpm下离心分离所述培养液5分钟，去上清液，而后只收集细菌。然后，在所述细菌中加入2mL的0.85%生理盐水缓冲液并进行悬浮。通过使用API
ZYM装置（Biomerieux）按照制造商的规定进行之后的步骤。具体步骤如下。
首先，慢慢地将所述菌株悬浮液加入于5mL API悬浮液培养基中，测定浊度约2麦氏比浊标准（Biomerieux）时所需的悬浮液的量。将所测悬浮液量的2倍的悬浮液加入到10mL API 50CHL培养基中，然后摇晃混合。将65μl上述混合液加入到每个小杯内，然后在37℃下培养4小时。在每个小杯中各滴入一滴ZYM A试剂和ZYM B试剂，待5分钟后，根据颜色强度进行0～5之间的评分，然后将分数为3或以上的定为阳性。
对APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269菌株培养液重复上述方法，而分析出酶活性类型。
在下列表中展示了APsulloc 331261、APsulloc
331263、APsulloc 331266和APsulloc 331269与作为标准菌株的植物乳杆菌菌株（KCTC3108）相比之下的酶活性类型的结果。表6为APsulloc
331261，表7为APsulloc
331263，表8为APsulloc
331266以及表9为APsulloc
331269。
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
如上述可知，APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc
331269在酸性磷酸酶、萘酚AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的酶活性强度均与所述标准菌株（KCTC3108）具有差异。由此确定，APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269都是与所述标准菌株不同的菌株。
进一步，APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269对作为代表性致癌酶之一的β-葡萄糖苷酸酶的活性被判定为阴性，所述代表性致癌酶可通过将前致癌物转变成致癌物而引发癌症。此外，APsulloc
331263能够抑制α-葡萄糖苷酶活性。由此确定，APsulloc
331261、APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc
331269均能被接受而用于食品组合物中。
（4）植物乳杆菌菌株的抗生素耐药性的评估
在皮氏培养皿（直径：100mm）中加入20mL已灭菌的MRS琼脂，并在干净的台架上进行冷却而制备出培养基。将（1）中所制备的APsulloc 331261菌株培养液接种于10mL
MRS肉汤中，浓度为0.5%，而后在37℃下培养6小时。在625nm下稀释所得溶液至吸光度成为约0.08～0.13。将灭菌棉签完全浸透于所述稀释溶液中，然后在所制备的MRS琼脂板整面上均匀地进行划线。将抗生素敏感性盘以适当间距滴到所述板上。在37℃下培养24小时后，测定透明圈的直径。
对APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269菌株培养液重复上述方法，而评估出抗生素耐性。
所述抗生素敏感性盘的浓度和评估标准为如下。
【表10】
APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc
331269与作为标准菌株的植物乳杆菌菌株（KCTC3108）相比之下的抗生素耐性的评估结果如下。表11为APsulloc
331261和APsulloc 331263，以及表12为APsulloc 331266和APsulloc 331269。
【表11】
【表12】
R：有耐性，I：中间，S：敏感
如上述可知，与所述标准菌株（KCTC3108）相比较，APsulloc 331261在头孢他啶、克林霉素和呋喃妥因的抗生素耐性类型上有差异，而APsulloc
331263在头孢他啶和呋喃妥因的抗生素耐性类型上有差异。与所述标准菌株（KCTC3108）相比，APsulloc 331266在头孢他啶、呋喃妥因和青霉素的抗生素耐性类型上有差异，而APsulloc
331269在头孢他啶、克林霉素、呋喃妥因和青霉素的抗生素耐性类型上有差异。因此确定，APsulloc
331261、APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc
331269都是与所述标准菌株不同的菌株。
全面分析了糖发酵类型、酶活性类型及抗生素耐性类型后，可确认APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269均属于植物乳杆菌，而且都是与植物乳杆菌标准菌株（KCTC3108）不同的菌株。
【测试实施例1】耐酸性评估
（1）基于pH值的耐酸性评估
将APsulloc 331261菌株培养液接种于10mL MRS肉汤中，浓度为0.5%，之后在37℃下培养一夜。用HCl将pH值分别控制在2.0、2.5、3.0、3.5。将50μl所述培养液接种于5mL灭菌MRS肉汤中，然后在37℃下培养1小时。待一小时后，用蛋白胨生理盐水缓冲液稀释所述培养液，而测定每mL中细菌的数量。测定完所述培养液中细菌数量后，将其数乘以0.01的值视作对照组并将对照组的细菌数量作为100%，来计算出存活率。
对APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc
331269重复上述方法来评估基于pH值的耐酸性。
APsulloc
331261、APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc
331269与作为标准菌株的植物乳杆菌菌株（KCTC3108）作比较的耐酸性的结果在以下表中展示。表13为APsulloc
331261和APsulloc 331263，而表14为APsulloc 331266和APsulloc 331269。
【表13】
【表14】
如上述可知，APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269均在约pH 2.5～3.5时比所述标准菌株展示更高的存活率。亦即，可以确认上述植物乳杆菌菌株具有优秀的耐酸性。考虑到摄入食物后的胃的pH值为约2～3时，可确认所述植物乳杆菌菌株被包含于食品中时其在胃中可具有更高的存活率。
（2）基于时间的耐酸性的评估
将APsulloc 331261菌株培养液接种于10mL MRS肉汤中，浓度为0.5%，之后在37℃下培养一夜。将50μl的用HCl使pH值控制在2.5的所述培养液接种于5mL灭菌MRS肉汤中，然后在37℃下培养3小时。待1小时和3小时后，分别用蛋白胨生理盐水缓冲液稀释所述培养液，而后测定每mL中细菌的数量。测定完所述培养液中细菌数量后，将其数乘以0.01的值视作对照组并将对照组的细菌数量作为100%，而计算出存活率。
对APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269重复上述方法，而评估出基于时间的耐酸性。
APsulloc
331261、APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc
331269与作为标准菌株的植物乳杆菌菌株（KCTC3108）作比较的耐酸性的结果在以下表中展示。表15为APsulloc
331261和APsulloc 331263，而表16为APsulloc 331266和APsulloc 331269。
【表15】
【表16】
由上述可确定，APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269在pH2.5时甚至在1小时和3小时后均比所述标准菌株具有更高的存活率。亦即，可确认上述植物乳杆菌菌株在长时间内均具有优秀的耐酸性。考虑到摄入食物时胃中平均停留时间为约1～3小时，可确认所述植物乳杆菌菌株被包含于食品组合物中时其在胃中停留时间内可具有更高的存活率。
从而，即使胃的pH值较低，APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269在胃中停留时间内也均可存活下来。因此，将所述菌株当作食物被摄取时，其能在胃中存活，进而具有更高的肠道抵达率。
【测试实施例2】 胆汁酸耐性评估
将APsulloc 331261培养液接种于10mL MRS肉汤中，浓度为0.5%，之后在37℃下培养一夜。其中加入牛胆汁至浓度分别为0.3%和0.5%，从而制备出MRS琼脂板。未加入牛胆汁的MRS琼脂可作为对照组。稀释所述菌株培养液并在MRS琼脂培养基上划线后，在37℃下培养2天。将对照组细菌数量作为100%时，计算每菌落的数量和APsulloc 331261的存活率的结果在下面表中展示。对APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc
331269重复上述方法，而评估出胆汁酸耐性，其结果在以下表中展示。表17为APsulloc 331261和APsulloc
331266，表18为APsulloc
331266和APsulloc 331269。
【表17】
【表18】
如上述可知，APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269均示出优秀的胆汁酸耐性。由此确定，APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269均具有优秀的肠道固定性及肠道抵达率。
【测试实施例3】乳酸产生能力评估
将APsulloc 331261培养液接种于10mL MRS肉汤中，浓度为0.5%，之后在37℃下培养一夜。在8,000rpm下将所述培养液离心分离15分钟，仅收集上清液。在80℃下将所收集的上清液处理15分钟，以终止酶反应。用蒸馏水将经热处理的上清液稀释100倍。用D-乳酸/ L-乳酸UV方法试剂盒按照制造商的规定进行之后的步骤。具体步骤如下。
在试管中依次加入1mL试剂盒溶液1（甘氨酰甘氨酸缓冲液/ L-谷氨酸）、0.2mL溶液2（NAD溶液）和0.02mL GPT悬浮液3。将0.1mL上述所制备的上清液加入到该试管内。在对照组中加入1mL去离子水，而在所述样本中加入0.9mL去离子水，之后混合均匀。待5分钟后，在340nm下测定吸光度（A1）。其中加入0.02mL D-LDH溶液4，混合均匀并使之反应30分钟。在340nm下测定吸光度（A2）。其中加入L-LDH溶液5，混合均匀并使之反应30分钟。在340nm下测定吸光度（A3）。根据计数法计算样本中D-乳酸和L-乳酸的浓度。与作为标准菌株的植物乳杆菌菌株（KCTC3108）作比较的结果在以下表中示出。
对APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269重复上述方法，而评估出乳酸产生能力，其结果在以下表中展示。表19为APsulloc
331261和APsulloc 331266，而表20为APsulloc 331266和APsulloc 331269。
【表19】
【表20】
如上述可知，APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc
331266和APsulloc 331269均能产生D-乳酸和L-乳酸。进一步，它们的乳酸总产量要比所述标准菌株较少，并且所生成的乳酸中D-乳酸所占的比例要低。因此，那些对乳酸敏感的成人或婴幼儿可自由摄取含有所述植物乳杆菌菌株的食品，而且当用所述植物乳杆菌菌株发酵食品时，该食品可具有更好的口感。
【测试实施例4】抗菌活性评估
（1）APsulloc
331261
将APsulloc 331261培养液接种于10mL MRS肉汤中，浓度为0.5%，之后在37℃下培养一夜。将15mL灭菌MRS琼脂等量分配在皮氏培养皿上而制备培养基，然后在其上分别滴上1 μl APsulloc 331261培养液，然后在37℃下培养24小时。
另一方面，用痢疾杆菌（Shigella flexneri）在胰酶大豆琼脂上进行划线，之后在37℃下培养一夜。然后，将菌落接种于BHI肉汤中并培养一夜。将BHI软琼脂（1%琼脂）进行灭菌并制冷至45～50℃，然后在其上接种1%痢疾杆菌培养液。
用10mL所述痢疾杆菌培养液覆盖APsulloc331261培养液并凝固。在37℃下培养24小时后，测定透明圈的大小。在下面表中展示了与作为标准菌株的植物乳杆菌菌株（KCTC3108）作比较的结果。
【表21】
如上述可知，可确认APsulloc 331261的对抗痢疾杆菌的抗菌效果比所述标准菌株更优秀。
（2）APsulloc 331266
将APsulloc 331266培养液接种于10mL MRS肉汤中，浓度为0.5%，之后在37℃下培养一夜。
另一方面，分别用单增李斯特菌（Listeria monocytogens）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）在胰酶大豆琼脂上进行划线，而后在37℃下培养一夜。然后，将菌落接种于BHI肉汤中并培养一夜。
将BHI软琼脂（1%琼脂）进行灭菌并制冷至45～50℃，然后在其上分别接种1%单增李斯特菌和蜡状芽孢杆菌培养液。将15mL所得溶液分别等量分配在皮氏培养皿上，冷却1小时，而制备培养基。用5mL灭菌MRS软琼脂（1%琼脂）覆盖上述所制备的培养基上并进行凝固。在37℃下培养24小时后，测定透明圈的大小。在下面表中展示了与作为标准菌株的植物乳杆菌菌株（KCTC3108）作比较的结果。
【表22】
如上述可知，可确认APsulloc 331266的对抗单增李斯特菌和蜡状芽孢杆菌的抗菌效果比所述标准菌株更优秀。
（3）APsulloc 331269
将APsulloc 331269培养液接种于10mL MRS肉汤中，浓度为0.5%，之后在37℃下培养一夜。在8000rpm下离心分离所述培养液5分钟，仅取上清液。通过用0.22μl注射器式过滤器进行灭菌而制备出10mL所述上清液。
另一方面，分别用鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在胰酶大豆琼脂上进行划线，然后在37℃下培养一夜。而后，将菌落接种于BHI肉汤中并培养一夜。
将BHI软琼脂进行灭菌，然后将20mL该BHI软琼脂置于皮式培养皿上，并进行制冷而制备培养基。用灭菌生理盐水溶液分别稀释鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌50倍，然后用灭菌棉签在上述所制备的培养基上均匀地进行划线。在其上放置灭菌纸盘，然后在该纸片上滴上100μl上述所制备的APsulloc 331269培养液的上清液。在室温下将所述培养基存放3小时以进行吸收，然后在37℃下培养24小时。测定透明圈的大小，在下面表中展示了与作为标准菌株的植物乳杆菌菌株（KCTC3108）作比较的结果。
【表23】
如上述可知，可确认APsulloc 331269的对抗鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果比所述标准菌株更优秀。
【微生物保藏证明】
Claims (12)
1.植物乳杆菌APsulloc 331261（保藏编号：KCCM11179P）菌株。
2. 植物乳杆菌APsulloc 331263（保藏编号：KCCM11180P）菌株。
3. 植物乳杆菌APsulloc 331266（保藏编号：KCCM11181P）菌株。
4. 植物乳杆菌APsulloc 331269（保藏编号：KCCM11182P）菌株。
5. 根据权利要求1～4中任一项所述的菌株，其特征在于，所述菌株是从茶树叶中分离出来的。
6. 根据权利要求1～4中任一项所述的菌株，其特征在于，所述菌株具有耐酸性。
7. 根据权利要求6所述的菌株，其特征在于，所述菌株在pH2～4时具有05～5小时的耐酸性。
8. 根据权利要求1～4中任一项所述的菌株，其特征在于，所述菌株具有胆汁酸耐性。
9. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株具有乳酸产生能力。
10. 根据权利要求9所述的菌株，其特征在于，所述菌株具有乳酸产生能力，能生产占所产生的乳酸的70%或以下量的D型乳酸。
11. 一种组合物，含有根据权利要求1～4中任一项所述的菌株或其培养液。
12. 根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物是被发酵的食品组合物。
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