CN101302488A - 一种生产乳酸的方法及其专用植物乳杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产D－乳酸的方法及其专用植物乳杆菌。本发明所提供的植物乳杆菌是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SMB－2 CGMCC № 2566。在35－39℃的条件下静置培养植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SMB－2 CGMCC №2566 48小时即可得到D－乳酸。发酵液中总乳酸的浓度为18％，D－乳酸的光学纯度为84－86％，发酵产率为3.75g/L·h。且该植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SMB－2CGMCC № 2566易于沉降到发酵罐底部进行生长，有利于工业生产中菌－液的分离纯化，可以降低乳酸工业生产的成本，具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产乳酸的方法及其专用植物乳杆菌。
背景技术
随着石油资源的不断减少以及不可再生资源价格的节节攀升，开发利用对环境更友好的生物基产品已成为转变经济增长方式、保障生态链良性循环和实现经济社会可持续发展的战略需求。乳酸是一种重要的、多用途的生物基平台化合物，能够广泛应用于食品、医药、化工、纺织、环保和农业等诸多领域，其中最重要、最广泛的工业应用是用于生产可降解聚合物-聚乳酸(PLA)。聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性以及优良的机械性能和物理性能，因而被产业界认为是新世纪最有发展前途的新型可再生材料，是石油基产品的重要替代品之一。
聚乳酸是一类脂肪族聚酯，主要包括聚L-乳酸(PLLA)、聚D-乳酸(PDLA)和聚DL-乳酸(PDLLA)三种，其中使用规模最广泛的是PLLA，PLLA目前已广泛应用于医学、纺织、农业和食品等领域。聚乳酸作为大规模应用的工业材料，需要有合适的热稳定性，以防止其降解。然而由于同型聚乳酸热变形温度低，导致聚L-乳酸作为工业塑料的应用受到限制。2003年，Yamane等发现聚L-乳酸和聚D-乳酸的立体共聚物比单纯的聚L-乳酸有更高的熔点，聚L-乳酸的熔点(Tm)大约为180℃，而聚L-乳酸和聚D-乳酸的立体共聚物的熔点能够达到230℃，这一实验结果使工业界对D-乳酸的生产产生了巨大的兴趣。
相对于对L-乳酸生产菌株的研究的高度关注，D-乳酸发酵生产的研究仍然处于起步阶段。根据国内外文献和专利的报道，目前只有德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、嗜酸芽孢杆菌(Sporolactobacillus inulinus)和棒状乳杆菌(L.coryniformis)等有限的几种天然乳酸菌用于生产D-乳酸，这极大地限制了D-乳酸在工业领域的应用，阻碍了聚乳酸市场的开拓。因此有必要筛选更优良、应用潜力更高的产D-乳酸的菌株，才能从根本上解决问题，满足市场的要求。
植物乳杆菌是典型的同型发酵乳酸菌，具有较强的乳酸生产能力和耐盐性，是潜在的工业应用菌株，然而已发现的植物乳杆菌主要用于生产DL-乳酸，因而不能满足市场对D-乳酸的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一株生产乳酸的植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2。
本发明所提供的植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2是从发酵食品-云南泡菜中筛选得到的，鉴定为植物乳杆菌(L.plantarum)。植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2已于2008年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC№2566。
植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566为革兰氏阳性菌，菌落较小、圆形、淡乳白色、边缘整齐光滑，电镜观察发现，SMB-2营养细胞的菌体大小为(0.5～0.6)μm×(0.9～3.0)μm，菌株单生、成对生或短链状排列，兼性厌氧，无芽孢。
以上述植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566为活性成分制备的生物菌剂也属于本发明的保护范围。
上述生物菌剂在具体应用时，可根据需要在其中添加其他的辅料。
本发明的第二个目的是提供一种利用植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566生产乳酸的方法。
本发明所提供的生产乳酸的方法，是发酵植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566得到乳酸。
所述植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566的发酵培养基的组成为：葡萄糖120～150g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、K2HPO43g/L、KH2PO43g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L、Tween-801ml/L和用于控制发酵液pH值的中和剂。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。
上述发酵培养基中的中和剂为Ca(OH)2或氨水，优选为Ca(OH)2，所述Ca(OH)2的浓度为296g/L。
所述植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566的发酵条件为35～39℃静置培养48小时。所述发酵培养方式为分批补料发酵培养，每12小时补加60mL1000g/L的葡萄糖一次。
本发明利用植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566发酵生产乳酸，结果表明，发酵48小时时，发酵液中总乳酸的浓度为18％，D-乳酸的光学纯度为84-86％，发酵产率为3.75g/L·h。且该植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SMB-2CGMCC№2566易于沉降到发酵罐底部进行生长，有利于工业生产中菌-液的分离纯化，可以降低乳酸工业生产的成本，具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1为植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2的具体筛选流程
图2为植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2的扫描电镜照片
图3为植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2种子液的沉降效果
图4为植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2发酵液的沉降效果
具体实施方式
下述实施例中所述方法，如无特别说明均为常规方法。
下述实施例中所述百分含量，如无特别说明均为质量百分含量。
实施例1、植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2的分离、纯化及鉴定植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2的具体筛选流程如图1所示。
1、菌种的分离和纯化
将发酵食品-云南泡菜浸泡于无菌的生理盐水中充分洗涤，然后取上述洗涤液加入到MRS液体培养基中，37℃厌氧富集培养48小时，获得pH＜4.0的富集液；取上述富集液，10倍梯度稀释后涂布于含4％CaCO3的MRS固体培养基上，37℃厌氧培养24小时，挑取透明圈较大的单菌落分别接种于MRS液体培养基中厌氧培养24小时，观察是否产气，筛选得到不产气的菌株，即同型发酵乳酸菌；将上述筛选得到得同型发酵乳酸菌分别接种于复筛培养基上，37℃厌氧培养48小时，通过高效液相色谱检测总乳酸的产量，获得高产的乳酸菌；将上述获得的乳酸菌通过乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测D-乳酸的光学构型，最终从发酵食品-云南泡菜中得到一株D-乳酸光学纯度为84～86％的菌株，即植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2，经多次传代后发酵测试，总乳酸产量、D-乳酸的纯度没有明显变化。
植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2筛选中所用的MRS液体培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO42g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。115℃条件下灭菌20分钟。
植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2筛选中所用的含4％CaCO3的MRS固体培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO42g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温80 1mL/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L，CaCO3 40g/L，琼脂15g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。。115℃条件下灭菌20分钟。
植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2筛选中所用的复筛培养基为：葡萄糖120g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO42g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L，CaCO340g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。115℃条件下灭菌20分钟。
D-乳酸光学纯度＝D-乳酸浓度/总乳酸浓度。
2、菌株的鉴定
将上述步骤1筛选得到的植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2进行形态特征、生理生化试验、API试剂盒和16S rDNA序列鉴定，具体结果如下：
该菌株菌落较小、圆形、淡乳白色、边缘整齐光滑，电镜观察发现，SMB-2营养细胞的菌体大小为(0.5～0.6)μm×(0.9～3.0)μm，菌株的电镜扫描照片如图2所示。菌株单生、成对生或短链状排列，革兰氏染色呈阳性，无芽孢。具体的生理生化特征如表1所示。
表1 SMB-2生理生化特性
表中结果“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
利用API试剂盒(购自法国梅里埃公司)对上述步骤1筛选得到的植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2进行鉴定，结果如表2所示。
表2 API快速鉴定试验结果
上表中对照指不含碳源的培养基
植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2的16S rDNA的核苷酸序列如序列表中序列1所示。菌株SMB-2的16S rDNA与植物乳杆菌(L.plantarum)Al2-1i(DQ0564191.1)的同源性最高，其同源性为98％，与其它乳酸菌的同源性较低。
基于以上特征，将本株D-乳酸生产菌SMB-2鉴定为植物乳杆菌(L.plantarum)，并于2008年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC№2566。
实施例2、利用植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566发酵生产乳酸
该实施例中所用培养基的组成如下：
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO42g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。115℃条件下灭菌20分钟。
发酵培养基：葡萄糖135g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、K2HPO4 3g/L、KH2PO4 3g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L、Tween-801ml/L，Ca(OH)2296g/L。恒定pH5.8，115℃条件下灭菌20分钟。发酵培养基中加入Ca(OH)2的目的是作为中和剂以控制发酵液的pH值。
将上述实施例1筛选得到的植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL，得到发酵种子液。
在装有3L上述发酵培养基的7L发酵罐中按照10％的体积比接入上述发酵种子液，发酵过程中，每12小时补加60mL 1000g/L的葡萄糖一次，37℃静置培养48小时，恒定pH5.8，结束发酵。发酵过程结束后，通过高效液相色谱检测发酵液中总乳酸的产量。具体的检测条件如下：采用Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8ID×300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度40℃。D-乳酸的含量通过D-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。
实验设3次重复，3次重复的平均值如表3所示。
表3 植物乳杆菌SMB-2在不同发酵时间下的总乳酸产量
按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、D-乳酸的光学纯度和发酵产率。总乳酸的浓度＝(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)×标准样品质量浓度
D-乳酸的光学纯度＝D-乳酸浓度/总乳酸浓度
发酵产率＝总乳酸浓度/发酵总时间
结果表明，植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566具有良好的发酵性能，在48小时内总乳酸的产量为180g/L，发酵液中总乳酸的浓度为18％，D-乳酸的光学纯度为84-86％，发酵产率为3.75g/L·h。
实施例3、利用植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566发酵生产乳酸
该实施例中所用培养基的组成如下：
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO42g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。115℃条件下灭菌20分钟。
发酵培养基：葡萄糖150g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、K2HPO4 3g/L、KH2PO4 3g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L、Tween-801ml/L，Ca(OH)2296g/L。培养基的初始pH值为6.2。115℃条件下灭菌20分钟。发酵培养基中加入Ca(OH)2的目的是作为中和剂以控制发酵液的pH值。
将上述实施例1筛选得到的植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL，得到发酵种子液。
在装有3L上述发酵培养基的7L发酵罐中按照10％的体积比接入上述发酵种子液，发酵过程中，每12小时补加60mL 1000g/L的葡萄糖一次，39℃静置培养48小时，恒定pH6.2，结束发酵。发酵过程结束后，通过高效液相色谱检测发酵液中总乳酸的产量。具体的检测条件如下：采用Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8ID×300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度40℃。D-乳酸的含量通过D-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。
实验设3次重复，3次重复的平均值如表4所示。
表4 植物乳杆菌SMB-2在不同发酵时间下的总乳酸产量
按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、D-乳酸的光学纯度和发酵产率。
总乳酸的浓度＝(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)×标准样品质量浓度
D-乳酸的光学纯度＝D-乳酸浓度/总乳酸浓度
发酵产率＝总乳酸浓度/发酵总时间
结果表明，植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566具有良好的发酵性能，在48小时内总乳酸的产量为172g/L，D-乳酸的光学纯度为85-86％，发酵产率为3.58g/L·h。
实施例4、利用植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566发酵生产D-乳酸
该实施例中所用培养基的组成如下：
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。。115℃条件下灭菌20分钟。
发酵培养基：葡萄糖120g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、K2HPO43g/L、KH2PO43g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L、Tween-80 1ml/L，Ca(OH)2 296g/L。恒定pH5.5，115℃条件下灭菌20分钟。发酵培养基中加入Ca(OH)2的目的是作为中和剂以控制发酵液的pH值。
将上述实施例1筛选得到的植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566接种到MRS液体培养基中，35℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL，得到发酵种子液。
在装有3L上述发酵培养基的7L发酵罐中按照10％的体积比接入上述发酵种子液，发酵过程中，每12小时补加60mL 1000g/L的葡萄糖一次，35℃静置培养48小时，恒定pH5.5，结束发酵。发酵过程结束后，通过高效液相色谱检测发酵液中总乳酸的产量。具体的检测条件如下：采用Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8ID×300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度40℃。D乳酸的含量通过D-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。
实验设3次重复，3次重复的平均值如表5所示。
表5 植物乳杆菌SMB-2在不同发酵时间下的总乳酸产量
按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、D-乳酸的光学纯度和发酵产率。
总乳酸的浓度＝(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)×标准样品质量浓度D-乳酸的光学纯度＝D-乳酸浓度/总乳酸浓度
发酵产率＝总乳酸浓度/发酵总时间
结果表明，植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566具有良好的发酵性能，在48小时内总乳酸的产量为174g/L，D-乳酸的光学纯度为84-86％，发酵产率为3.62g/L·h。
实施例5、植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566的沉降实验
将筛选得到的植物乳杆菌SMB-2进行沉降效果的比较，结果如图3和图4所示。图3为植物乳杆菌SMB-2的种子液的沉降效果，图4为植物乳杆菌SMB-2在发酵液中的沉降效果。
结果发现，在生长过程中，植物乳杆菌SMB-2易于沉降到发酵罐底部进行生长，这一特性有利于工业生产中菌-液的分离纯化，可以降低乳酸工业生产的成本，具有重要的工业应用价值。
序列表
<160>1
<210>1
<211>1440
<212>DNA
<213>植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400>1
gtcccacctt aggcggctgg ttcctaaaag gttaccccac cgactttggg tgttacaaac 60
tctcatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 120
atccgcgatt actagcgatt ccgacttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact 180
gagaatggct ttaagagatt agcttactct cgcgagttcg caactcgttg taccatccat 240
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtctcaccag agtgcccaac ttaatgctgg caactgataa 360
taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 420
catgcaccac ctgtatccat gtccccgaag ggaacgtcta atctcttaga tttgcatagt 480
atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 540
tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga 600
atgcttaatg cgttagctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagcattcat 660
cgtttacggt atggactacc agggtatcta atcctgtttg ctacccatac tttcgagcct 720
cagcgtcagt tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg 780
catttcaccg ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc 840
cgatgcactt cttcggttga gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc 900
tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg 960
gcacgtagtt agccgtggct ttctggttaa ataccgtcaa tacctgaaca gttactctca 1020
gatatgttct tctttaacaa cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggc 1080
gttgctccat cagactttcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag 1140
tttgggccgt gtctcagtcc caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc tacgtatcat 1200
tgccatggtg agccgttacc tcaccatcta gctaatacgc cgcgggacca tccaaaagtg 1260
atagccgaag ccatctttca aactcggacc atgcggtcca agttgttatg cggtattagc 1320
atctgtttcc aggtgttatc ccccgcttct gggcaggttt cccacgtgtt actcaccagt 1380
tcgccactca ctcaaatgta attcatgatg caagcaccaa tcattaccag agttcgttcg 1440
Claims (10)
1、植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2，其保藏号为CGMCC№2566。
2、一种生产D-乳酸的方法，是发酵植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC№2566得到D-乳酸。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC № 2566发酵培养基的组成为：葡萄糖120～150g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、K2HPO43g/L、KH2PO43g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L、Tween-801ml/L和用于控制发酵液pH值的中和剂。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中的中和剂为Ca(OH)2或氨水，优选为Ca(OH)2。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述Ca(OH)2的浓度为296g/L。
6、根据权利要求3-5所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的pH为5.5-6.2。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵条件为35-39℃静置培养48小时。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述发酵的培养方式为分批补料发酵培养。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述分批补料发酵为每12小时补加60mL 1000g/L的葡萄糖。
10、以权利要求1所述的植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2CGMCC № 2566为活性成分制备的生物菌剂。
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