CN102839140B - 一株从玉米浸泡水中分离筛选出的l-乳酸产生菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株从玉米浸泡水中分离筛选出的L-乳酸产生菌，属于玉米加工领域。该菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 6382，保藏日期2012年7月19日。本发明通过分离筛选出的能够高效利用玉米浸泡水、并且大量积累L-乳酸的产生菌，提高了玉米浸泡水的利用价值，从而实现显著的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一株L-乳酸产生菌。
背景技术
在玉米淀粉湿法生产中，玉米浸泡过程不仅是物理扩散过程，同时也是生物化学变化过程。这得益于玉米粒本身所带有的乳酸菌。所以玉米浸泡水中肯定有乳酸菌的存在。
L-乳酸被广泛应用于食品和医药等领域，尤其是近年来利用L-乳酸为原料生产生物可降解塑料，即聚乳酸的迅速发展，对于解决日益严重的白色污染问题具有重要意义。
因此筛选L-乳酸产生菌，将其单独应用于玉米浸泡过程中，大量积累L-乳酸，对玉米浸泡水加以利用、变废为宝，将是十分必要的。
发明内容
本发明提供一株从玉米浸泡水中分离筛选出的L-乳酸产生菌，目的在于将其单独应用于玉米浸泡过程中，大量积累L-乳酸，对玉米浸泡水加以利用、变废为宝。
本发明采取的技术方案是：一株从玉米浸泡水中分离筛选出的L-乳酸产生菌，BaciLLus coaguLans，该菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 6382，保藏日期2012年7月19日，保藏单位地扯：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所述的L-乳酸产生菌能够高效利用玉米浸泡水、并且大量积累L-乳酸。
本发明利用工厂玉米浸泡水经稀释后涂布于分离培养基，待长出菌落后，挑选溶钙圈大的菌株，进行分纯后发酵培养，50 ℃恒温培养24h。测定产酸情况，以L-乳酸产量和光学纯度为指标，筛选大量积累L-乳酸的优质菌株，获得本专利所述菌株，进行菌种鉴定实验，4 ℃保藏。
本发明通过分离筛选出的能够高效利用玉米浸泡水、并且大量积累L-乳酸的产生菌，提高了玉米浸泡水的利用价值，从而实现显著的经济效益。
具体实施方式
一株从玉米浸泡水中分离筛选出的L-乳酸产生菌，该菌株的16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 6382，保藏日期2012年7月19日，保藏单位地扯：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实验例1本发明所述菌株的分离筛选及鉴别方法。
一、采用培养基
1．MRS培养基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20g，吐温-80 1 mL，K2HPO4 2 g，NaAc·3H2O 5 g，柠檬酸二铵2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g，补蒸馏水至1000 mL，调pH至6.4±0.2；若配制成固体培养基，则需添加1.5%-2%的琼脂；
2．L-肉汤培养基：胰酶解酪蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl5 g，葡萄糖100 g，补蒸馏水至1000 mL；
3．YE培养基：酵母粉15 g，葡萄糖100 g，补蒸馏水至1000 mL，酵母粉和葡萄糖分别灭菌冷却后混合；若配制成固体培养基，则需添加1.5%的琼脂；
注：以上培养基均121 ℃灭菌15 min。
二、菌种的分离
1、玉米浸泡液中乳酸菌的分离筛选，初筛：
在无菌条件下，用5 mL一次性无菌针管吸取1 mL玉米浸泡液，10倍梯度稀释至10-9；取0.1 mL涂布于MRS培养基，50 ℃培养24 h后选择有溶钙圈明显的典型菌落进一步划线分离，直到出现单菌落，挑取单菌落在L-肉汤培养基培养16 h后储存于15%～20%甘油中，于-60℃低温冰箱中冻存。
将划线分离菌株于装有1 mL MRS液体培养基的EP管中活化，然后在10 mL YE液体培养基试管中静置培养24 h，测定发酵液的pH值。
产酸菌会使培养基中的pH 值下降并导致含显色剂的培养液由紫变黄，这样可以通过目测法直观淘汰不产酸或产酸能力弱的菌株。取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株划线分离，共得到16株。将它们在EP管中活化培养后，接入装有YE液体培养基的试管中，50 ℃培养24h，测定pH值见表1。
表1初筛产酸菌的pH值
| 菌株 | L1 | L2 | L3 | L4 | L5 | L6 | L7 | L8 |
| pH | 3.89 | 4.12 | 4.08 | 3.91 | 4.22 | 4.17 | 3.99 | 4.20 |
| 菌株 | L9 | L10 | L11 | L12 | L13 | L14 | L15 | L16 |
| pH | 4.13 | 4.34 | 4.17 | 5.01 | 4.33 | 4.35 | 4.29 | 4.31 |
2、玉米浸泡液中乳酸菌的分离筛选，复筛：
选取发酵液 pH 值较低的菌株即L1、L2、L3、L4、L9，按接种量为2%～5%接入装有YE 液体培养基的三角瓶中，200 rpm，50 ℃培养24h。发酵液5000 rpm离心10 min，取上清液用于纸层析定性。将2%柠檬酸、2%乳酸和发酵培养液点样进行纸层析，计算Rf值，如表2所示以确定菌种培养液中是否产生有乳酸。
表2有机酸及发酵液的Rf值
| 层析样品 | 柠檬酸 | 乳酸 | L1 | L2 | L3 | L4 | L9 |
| Rf值 | 0.452 | 0.702 | 0.699 | 0.703 | 0.698 | 0.701 | 0.702 |
3次平行试验表明，从Rf值结果可以判断该5株菌所产酸均为乳酸，也就是说这5株菌为乳酸产生菌。
三、高效液相色谱仪测定、分离发酵液中L-乳酸和D-乳酸
采用高效液相法和手性分离柱对这5株菌发酵上清液中的L-乳酸和D-乳酸进行分离和测定。发酵上清液用8000 rpm离心20 min，再用0.45μm 滤膜过滤。滤液用配备二极管阵列检测器的高效液相系统检测，检测波长为254 nm。检测色谱柱为手性柱Chirex 3126 (D)-peniciLLami（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为2 mmoL/L CuSO4溶液（溶剂5 %的异丙醇溶液）。该方法操作简便，精密度和准确度高。其中一菌株L9，L-乳酸产量最高，达到67.7 g/L，且光学纯度达到99.3%，选择该菌株做进一步研究。
四、菌种鉴定
菌株在平板上的单菌落呈圆形，稍透明，边缘整齐，菌落呈乳白色，菌落直径约为2.0～2.5 mm。在光学显微镜下观察可知，菌体为杆状，少数稍弯曲，单个排列，长约3.0～5.0 μm。细菌革兰氏染色呈阳性。在一定条件下可产生芽孢，为端生。无鞭毛，能运动，为兼性厌氧菌。
将试管中斜面培养保藏的菌株活化3代后接种到生化试验培养基中，培养后测定其生化特性。结果见表3。菌株对不同碳水化合物的利用情况见表4。由表3可知，该菌株过氧化氢酶为阳性，VP阳性，明胶液化阴性，可分解利用淀粉。由表4可知，该菌株能利用大多数寡糖，包括纤维二糖和菊粉，但不能分解利用木糖和鼠李糖。同时做了产气实验，结果均不产气。此外，糖类发酵实验中添加了指示剂溴甲酚紫，若菌株能利用某种糖，培养基颜色可由紫变黄，根据变色时间的长短可判断分解某种糖的快慢程度。实验发现，该菌能迅速利用葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖和糊精；而需要较长时间才能分解乳糖、蔗糖、纤维二糖、菊粉和淀粉。
表3菌株的生理生化实验结果
| 实验名称 | 结论 |
| 过氧化氢酶 | + |
| VP试验 | + |
| 甲基红试验 | + |
| 明胶液化 | - |
| 乙酸氧化 | - |
| 硫化氢的生成试验 | - |
| 淀粉 | - |
“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表4菌株对不同碳水化合物的利用情况
| 碳源 | 利用情况 | 碳源 | 利用情况 | 碳源 | 利用情况 |
| 葡萄糖 | + | 果糖 | + | 半乳糖 | + |
| 麦芽糖 | + | 糊精 | + | 乳糖 | + |
| 蔗糖 | + | 菊粉 | + | 纤维二糖 | + |
| 鼠李糖 | - | 木糖 | - |
“+”表示利用，“-”表示不利用。
所测菌株的16S rDNA核苷酸序列SEQ ID No.1所述，长度为1476bp。
将所测序列从GenBank数据库中相关菌种进行比较，结果表明：该菌株与凝结芽孢杆菌BaciLLus coaguLans具有极高的同源性，同源性大于99%。结合以上生理生化结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》分析比较，其生理生化指标均相同，可确定该菌株为凝结芽孢杆菌BaciLLuscoaguLans，实验室编号为NERC-CP-001，已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6382，保藏日期为2012年7月19日，保藏单位地扯：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
将菌株在L-肉汤培养基培养16h后储存于15%～20%甘油中在－80℃低温冰箱中冻存。
实验例2通过具体对比例证明本发明所述菌株能大量积累L-乳酸
采用的菌株：
赖氏乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌ATCC51232，本发明所述凝结芽孢杆菌。
一、主要培养基
斜面培养基：蛋白胨5 g，酵母浸粉2 g，牛肉膏2 g，NaCl 3 g，K2HPO4 2 g，葡萄糖10 g，琼脂12 g，补蒸馏水至1000 mL，pH6.5；
一级种子培养基：蛋白胨5 g，酵母浸粉3 g，牛肉膏2 g， KH2PO4 2 g，葡萄糖80 g，补蒸馏水至1000 mL，pH自然，200 mL三角瓶分装30 mL；
二级种子培养基：蛋白胨5 g，酵母浸粉3 g，牛肉膏2 g，KH2PO42 g，葡萄糖120 g，补蒸馏水至1000 mL，pH自然，200 mL三角瓶分装100 mL；
发酵培养基：大米糖化液为125 g/L，蛋白胨8.5 g/L，酵母粉3.5g/L，K2HPO4 3 g/L，牛肉膏4 g/L，MgSO40.1 g/L。补蒸馏水至1000 mL，pH自然，250 mL三角瓶分装150 mL。
以上培养基均121 ℃灭菌20 min。
二、L-乳酸菌的发酵试验方法
将赖氏乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌ATCC51232，本发明所述凝结芽孢杆菌分别从保藏的斜面接种于新鲜的斜面培养基上，50 ℃培养24h，再次转接于新鲜培养基上，培养24 h。从长势好的斜面菌株取出一环接种于30 mL种子培养基中，50 ℃培养16 h，取出10 mL培养液转接到100 mL二级种子培养基中，于50 ℃培养16 h后，取出10 mL种子液被接种于100 mL发酵培养基中，一次性加入灭菌的碳酸钙10 g，橡胶塞封口，50 ℃发酵摇床160 rpm培养48 h，测定发酵液中L-乳酸的浓度。
三、试验结果
表5不同菌株L-乳酸产量
从上述结果中可见本发明所述凝结芽孢杆菌能大量产生L-乳酸。
序列表
<110> 吉林中粮生化科技有限公司
<120> 一株从玉米浸泡水中分离筛选出的L-乳酸产生菌
<130> jlzl2012-1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> BaciLLus coaguLans
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgtgc ggaccttttaaaagcttgct 60
tttaaaaggt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc aacctgcctgtaatactgag 120
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gaaaggcggc ttcgcctgcc acttacagat gggcccgcgg cgcattagctagttggcggg 240
gtaatggccc accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcggccacattgg 300
gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttccgcaatggaa 360
gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggcc ttcgggtcgtaaaactctgt 420
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tcaaccgcaa gcggtcattg gaaactggga ggcttgagtg cagaagaggagagtggaatt 660
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gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctgaaactcaaagg 900
aattgacgga ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagcaacgcgaaga 960
accttaccag gtcttgacat cctctgacct ccctggagac agggccttccccttcggggg 1020
acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgttgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tgaccttagt tgccagcatt gagttgggcacactaaggtg 1140
actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatgccccttatga 1200
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caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaact cggtgaggtaacctttacgg 1440
agccagccgc cgaaggtggg acagatgatt ggggtg1476
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林中粮生化科技有限公司
<120> 一株从玉米浸泡水中分离筛选出的L-乳酸产生菌
<130> jlzl2012-1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> BaciLLus coaguLans
<400> 1
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