CN103352013B

CN103352013B - 木质纤维素降解复合菌系及其应用

Info

Publication number: CN103352013B
Application number: CN201310248943.1A
Authority: CN
Inventors: 贾红华; 韦萍; 钟超; 王凤学; 王春明
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2013-06-21
Filing date: 2013-06-21
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2033-06-21
Also published as: CN103352013A

Abstract

本发明公开了一种木质纤维素降解复合菌系，由粪产碱杆菌（Alcaligenesfaecalis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）以及芽孢杆菌（Bacillussp.）组成。菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为：CCTCCM2013168、CCTCCM2013169、CCTCCM2013170和CCTCCM2013171。通过该复合菌系的协同作用能全面降解秸秆中的纤维素、半纤维素及其他有机物质，经过3天液态发酵秸秆中木质纤维素总降解率达到近70％；且发酵周期短，仅3~6天。

Description

木质纤维素降解复合菌系及其应用

技术领域

本发明涉及利用微生物对木质纤维素的降解及其应用，具体为一种木质纤维素降解复合菌系及其应用，属于应用微生物技术领域。

背景技术

木质纤维素是地球上储量最大的可再生资源，同时微生物对其降解、转化也是自然界碳循环的重要环节，如果能充分利用这些资源，对解决当今世界所面临的能源紧张、环境污染等问题有着深远的意义。天然木质纤维素由于结构复杂，因此很难被纯培养微生物和酶类等分解，使得长期以来一直没有得到很好的利用。近年来，随着木质纤维素生物降解研究的不断深入，生物降解过程中各种微生物间的协同关系也逐渐受到人们的重视。研究表明，木质纤维素降解复合菌系的稳定性需要靠不同种类的微生物，包括具有纤维素降解能力的菌株和不具有纤维素降解能力的菌株间的相互作用来维持，从而充分利用微生物间的协同关系。因此，直接从自然界筛选出木质纤维素降解复合菌系成为现今新的研究热点。然而，目前所报道的复合菌系大多是在高温条件下表现出木质纤维素降解能力或需要对降解原料进行化学预处理，这些处理在一定程度上操作要求较高，耗能较多。

发明内容

本发明的目的是为了克服传统复合菌系在降解过程产生的高消耗、高污染和高成本的问题，针对性地筛选出中温木质纤维素降解复合菌系，与传统木质纤维素分解复合菌系相比，中温条件更容易实现且节约能源。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

利用蛋白胨纤维素培养基（PCS）在37℃条件下逐代筛选，最终得到一种中温木质纤维素分解复合菌系，该复合菌系由四株细菌菌株构成，均由秸秆堆沤中筛选分离获得，序列鉴定结果分别为：粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）CDM4、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CDM7、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CDM2以及芽孢杆菌（Bacillus sp.）CDM3，各菌株已于2013年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为：CCTCC M2013168、CCTCC M2013169、CCTCC M2013170和CCTCC M2013171。

本发明涉及菌株取自于堆沤秸秆堆不同位置采集样品，以PCS培养基中滤纸降解性为指标进行初筛，经过秸秆内部各成分降解特性以及相关参数鉴定最终确定本发明的四株细菌菌株，并以菌株体积比1: 0.5~2: 0.5~2: 1进行复配组合，以获得木质纤维素高效降解复合菌系。通过对复合菌系结构组成的研究，确定该复合菌系是以枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌、粪产碱杆菌和解淀粉芽孢杆菌按菌液体积比2：1: 1: 2构成，其中各菌液制备均是以液体LB为培养基，接种单菌落在37 ℃，180 rpm条件下培养至10⁸~10⁹个/mL菌液浓度范围。

所述的木质纤维素降解复合菌系的制备包括如下步骤：

1）、挑选四株菌株单菌落分别接种于液体LB培养基中，在37℃下活化1小时；

2）、将步骤1）中活化后的四株菌株分别接种于液体LB培养基中，在37 ℃，180 rpm条件下进行发酵培养，培养至108~109个/mL菌液浓度；

3）、将步骤2）中四株菌株的发酵菌液以枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌、粪产碱杆菌和解淀粉芽孢杆菌按菌液体积比1: 0.5~2: 0.5~2: 1混合均匀，即制得木质纤维素降解复合菌系。其中液体LB为培养基配方为：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，溶于1000 mL水中，121 ℃灭菌20 min制备。

所述的木质纤维素降解复合菌系在降解富含木质纤维素的农用作物中的应用。

将富含木质纤维素的农用作物风干洗净，粉碎；然后加入到已灭菌PCS培养基中，其中PCS培养基：蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，NaCl 5 g，溶解在1000 mL水中，农用作物添加量1±0.02%（w(g)/v(mL)），即100mL培养基中加入1±0.02g的农用作物），pH自然。将复合菌系以5±0.5%接种量（v/v）接种至上述已灭菌PCS培养基中，37℃静置培养，降解农用作物中的木质纤维素。

该复合菌系在液态发酵过程中分泌大量酶（纤维素酶和半纤维素酶），从而可以再较短时间内完成秸秆等农用作物的降解过程。因此，利用本专利涉及的复合菌系以5±0.5%接种量（v/v）接种于新鲜的蛋白胨纤维素培养基（PCS）中，在37 ℃条件下静置培养12天，对该发酵体系指标参数（秸秆总质量减少率及各组分质量减少率、菌系生长浓度OD、发酵液pH值、关键酶活（纤维素酶活和半纤维素酶活）以及降解产物含量变化等）进行阶段性考察。PCS培养基中以秸秆添加量1±0.02%（w（g）/v(mL)）作为碳源，同时结合秸秆质量变化等参数分析考察该复合菌系对于秸秆降解利用的情况。

以上条件进行液态发酵后，秸秆总降解率达70%以上，半纤维素降解率达75%，纤维素降解率约45%，明显改变秸秆内部结构，提高秸秆的利用效率。

有益效果：本发明筛选提供的复合菌系可以在中温条件下（37℃）对农用作物中的木质纤维素进行有效降解，与传统木质纤维素分解复合菌系相比，中温条件更容易实现且节约能源。利用该复合菌系对农用作物等进行预处理，秸秆总降解率达70%以上，半纤维素降解率达75%，纤维素降解率约45%，在一定程度上改变这类作物的内部结构，提高纤维素等的生物可及性。通过该复合菌系的协同作用能全面降解秸秆中的纤维素、半纤维素及其他有机物质，经过3天液态发酵秸秆中木质纤维素总降解率达到近70％；且发酵周期短，仅3~6天。因此，经过本发明相关的生物预处理，农用作物可以进一步应用于生产加工、沼气生产等工业方面，提高生产效率。此外，秸秆等通过复合菌系的降解，其发酵液中含有大量的低分子有机物（有机酸、醇类物质等），这些降解产物均可直接应用于工业加工生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1：CDM2枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）平板菌落形态图；

图2 : CDM3芽孢杆菌（Bacillus sp.）平板菌落形态图；

图3：CDM4粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）平板菌落形态图；

图4： CDM7解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）平板菌落形态图；

图5：复合菌系对于玉米秸秆降解率随时间变化曲线；

图6：复合菌系发酵过程生长曲线及发酵液pH变化曲线；

图7：复合菌系关键酶活（纤维素酶和半纤维素酶）变化曲线；

图8：复合菌系发酵过程中可溶性糖和COD变化曲线；

图9：基于复合菌系的秸秆生物预处理甲烷产量变化曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 复合菌系筛选及培养

富集培养基：NaNO₃ 0.5g、K₂HPO₄ 1g、MgSO₄.7H₂O 0.5g、KCl 0.5g、 FeSO₄·7H₂O 0.005g、滤纸 2g、蒸馏水1000mL，pH自然，灭菌121℃，20min。

筛选培养基：蛋白胨纤维素培养基（PCS）：蛋白胨5g，酵母提取物1g，NaCl 5g，溶解在1000mL水中，玉米秸秆添加量1%（w(g)/v(mL)），即添加10g的玉米秸秆，pH自然，另附60cm*10cm滤纸条为筛选指标，灭菌121℃，20min。

细菌分离培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，溶解在1000mL水中，pH 7.0~7.2，灭菌121℃，20min。

采集位于南京工业大学生物甲烷生产车间内部的农业秸秆堆肥不同位置若干份样品5g，将其分别置于250 mL三角瓶中，加入50 mL无菌水混匀，37 ℃、180 rpm培养1小时制备悬液，取5 mL 悬液加入到盛有50 mL富集培养基的三角瓶中，振荡培养5～7d 后，取培养液分别稀释10^-1～10^-6，分别以10%(v/v)接种量接种到PCS培养基中，37℃培养，以培养基中滤纸完全崩裂所用时间为标准考察各体系菌群木质纤维素降解能力，并以此作为指标进行复合菌系的初筛。初筛完成后，对初筛菌系的菌液稀释10^-1～10^-6，分别接种到新鲜的PCS培养基，以秸秆降解性以及秸秆内部纤维素和半纤维素的含量变化情况为标准进行复筛。如此继代培养，淘汰分解能力差的培养物，最终得到三组保持高效分解能力且稳定的复合菌系，进行保存和性质研究。

取1mL筛选稳定复合菌系悬浮菌液，稀释10^-1～10^-6，将梯度稀释液分别涂布到细菌分离培养基中。37 ℃静置培养12小时后，将培养的肉眼可见的菌落依照形态特征差异初步鉴别细菌类型，将平板上的细菌分别接到分离培养基上，获得纯化培养物。

实施例2 菌种的鉴定

1. 菌株的形态学鉴定

将分离纯化菌株接种到固体LB培养基上，在适宜的条件下培养一段时间观察菌种的平板菌落形态。其中，固体LB培养基配方为：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，溶解在1000 mL水中，pH 7.0~7.2，灭菌121℃，20min。

如图1，菌株CDM2，在固体LB培养基生长1天后，菌落直径3~6cm，形状呈不规则的突起物，半透明的奶油色，表面干燥，成薄片状的水泡样，无特殊气味；如图2，菌株CDM3，白色，背面淡黄色，圆形或不规则，不透明，表面有一层膜，无光泽；如图3，菌株CDM4，黄色，呈圆形或不规则，干燥、粗糙；如图4，菌株CDM7，菌体呈短杆状，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则。

对四株细菌进行菌种鉴定，菌种鉴定基于NCBI数据库的细菌16S rDNA序列库。氯化苄法提取各菌种的总DNA，并利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR 扩增，引物序列为：27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)、1492R(5’-GGYTACCTTGTTACGACT-3’)。PCR 反应体系为（25 μL）：模板 DNA 10 ng，10×PCR 缓冲液2.5 μL，25 m mol/L MgCl₂ 1.5 μL，dNTP mix（各2 mmol/L）2.5 μL，引物各0. 25 μL，5U/μL rTaq 聚合酶 (Takara，Japan) 0.125μL。PCR 反应程序为：94℃预变性5 min，随后35个循环（94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min），最后72℃反应10 min。将纯化后的PCR扩增片段16S rDNA测序，并将测序结果通过NCBI中Genbank的BLAST程序进行相似性比对。

分子学鉴定结果：

CDM2 16srDNA区序列如SEQ ID NO:1所示，鉴定结果为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；

CDM3 16srDNA区序列如SEQ ID NO:2所示，鉴定结果为芽孢杆菌（Bacillus sp.）；

CDM4 16srDNA区序列如SEQ ID NO:3所示，鉴定结果为粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）；

CDM7 16srDNA区序列如SEQ ID NO:4所示，鉴定结果为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

实施例3 复合菌系应用于秸秆预处理特性考察

选用风干洗净的玉米秸秆（采集于江苏省泗阳县），粉碎过40目筛，准确称取1.5 g，置于250 mL 三角瓶中，锡箔纸封口，121℃灭菌20 min。待灭菌后，加入已灭菌PCS培养基142.5mL，接种7.5mL复合菌系（四株菌株的发酵菌液以枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌、粪产碱杆菌和解淀粉芽孢杆菌按菌液体积比2：1: 1: 2混合均匀），37℃静置培养。分别在第0、1、3、5、7、9、12天取样，测定秸秆总质量减少率及各组分质量减少率（图5）、菌系生长浓度OD、发酵液pH值（图6）、关键酶活（纤维素酶活和半纤维素酶活）（图7）、降解产物含量变化（图8）等。以培养基浸泡秸秆不接菌液做空白对照。其中，PCS培养基配方为：蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，NaCl 5 g，溶解在1000 mL水中，pH自然。

接种复合菌系后，分别在培养1、3、5、7、9、12天后取样，发酵液及残留底物通过抽滤漏斗进行分离，抽滤漏斗内壁用恒重滤纸包裹，通过真空抽滤和不断的清水冲洗，最后残留物连同滤纸置于60℃烘箱烘至恒重。总质量减去滤纸质量即为残留秸秆质量。准确称取残留秸秆0.1 g，参照文献（王玉万，徐文玉.木质纤维素固体基质发酵物中半纤维素、纤维素和木素的定量分析程序[J].微生物学通报，1987，14(2)：81- 84.）测定残留秸秆内半纤维素、纤维素的降解率。结果发现，经过复合菌系处理3天后，秸秆总质量降解率达到近70%，纤维素降解率达40%，半纤维素降解率达60%（图2）。表明利用该复合菌系可以在较短的时间对秸秆进行有效的分解，从而达到改变秸秆组成的目的。

纤维素酶活以滤纸酶活（FPase）表征，半纤维素酶活以木聚糖酶（Xylanase）表征。接种复合菌系后，分别在培养1、3、5、7、9、12天后取样，发酵液首先在4℃，5500 r/min 下离心10 min，获得上清液并进行相应酶活的测定，酶活测定方法参照文献（Mandelsm, Andreotti R, Roche C. Measurement of saccharifying cellulase[J]. Biotechnol, 1976(6): 21-23; Bailey M J, Peter B, and Kaisa P. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity[J]. Journal of Biotechnology, 1992, 23(3): 257-270.），其中，滤纸酶活力单位（IU）定义为1 min 水解滤纸生成1 μg 葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位；木聚糖酶活力单位（IU）定义为1 min 水解木聚糖底物生成1 μg木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。如图7所示，本发明涉及的复合菌系在发酵周期内，随着时间推移，不断分泌纤维素酶和半纤维素酶，这类关键酶对于秸秆的降解过程有很大的促进作用。

实施例4 木质纤维素降解复合菌系的制备

木质纤维素降解复合菌系的制备，包括如下步骤：

2）、将步骤1）中活化后的四株菌株分别接种于液体LB培养基中，在37 ℃，180 rpm条件下进行发酵培养，培养至10⁸~10⁹个/mL菌液浓度；

3）、将步骤2）中四株菌株的发酵菌液以枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌、粪产碱杆菌和解淀粉芽孢杆菌按菌液体积比 1:0.5~2: 0.5~2: 1混合均匀，即制得木质纤维素降解复合菌系。其中液体LB为培养基配方为：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，溶于1000 mL水中，121 ℃灭菌20 min制备。

实施例5 木质纤维素降解复合菌系在降解富含木质纤维素的农用作物中的应用选用风干洗净的玉米秸秆（采集于江苏省泗阳县），粉碎过40目筛，准确称取1.5 g，置于250 mL 三角瓶中，锡箔纸封口，121℃灭菌20 min。待灭菌后，加入已灭菌PCS培养基142.5mL，接种7.5mL复合菌系，37℃静置培养3天，降解玉米秸秆中的木质纤维素，其中PCS培养基配方为：蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，NaCl 5 g，溶解在1000 mL水中，pH自然。秸秆降解率及所述的复合菌系中四株菌株的发酵菌液以不同比例复配见表1。从表1中可以看出，本发明提供的复合菌系具有较好的降解秸秆的能力，其中尤其以枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌、粪产碱杆菌和解淀粉芽孢杆菌按菌液体积比 2: 1: 1: 2 时降解率最高，达到63.46%。

表1 复合菌系复配比例及秸秆降解性对比

a：以构建菌系接种新鲜PCS培养3天为测定标准。

实施例6 基于复合菌系的秸秆预处理对生物甲烷生产的提高

基于上述分析，本专利涉及复合菌系在一定程度上可以改善农作物秸秆中紧密结合的木质纤维素结构，从而提高了秸秆内部成分的酶可及性，提高了秸秆的利用价值。

因此，本实施例中介绍了基于复合菌系的秸秆生物预处理，并将其应用于生物甲烷生产，以期提高秸秆的使用价值，同时对于改善生物发酵产甲烷的技术起到一定的技术指导作用。

采用两阶段发酵工艺，即将甲烷发酵过程中的原料水解阶段和甲烷生成阶段分开进行. 用1 L三角瓶模拟一级发酵罐，在三角瓶内添加PCS培养液760 mL（本次发酵过程添加20 g灭菌玉米秸秆作为碳源），复合菌系（四株菌株的发酵菌液以枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌、粪产碱杆菌和解淀粉芽孢杆菌按菌液体积比2：1: 1: 2混合均匀）40 mL，该组标记为处理组；以不接复合菌系的PCS培养基为对照组。37℃ 静置发酵6 d 后，将发酵液和玉米秸秆整体倒入二级发酵罐即甲烷发酵罐中，同时接种发酵沼液500 mL，在37 ℃条件下进行甲烷发酵生产，采用排水法测定生物甲烷日产量，对该发酵体系进行周期性产气考察。空白对照组以800 mL未接复合菌系的PCS培养基加入二级发酵罐，进行生物甲烷生产考察。

在沼气厌氧发酵过程中，每日定时记录甲烷的日产气量，结果如图9所示。在发酵的第4天，处理组进入产气高峰期，在第6天出现产气量的最高峰，日产气量可高达1400 mL左右，然后从第7天开始到第10天都保持很高的日产气量，日产气量均在1000 mL以上，随后的发酵阶段日产气量逐渐下降，但仍维持在较高的甲烷生产水平。相比较而言，对照组在第10天进入产气高峰期，在第12天出现产气量的最高峰，日产气量为1250 mL左右，从第16天开始，日产气量则显著下降。总体来看，在甲烷发酵过程中，处理组比对照组甲烷生产过程启动时间较短，处理组比对照组可提前4天进入产气高峰期。

此外，对甲烷发酵过程中处理组和对照组累积产气量进行比较可知，经过20天的厌氧发酵，处理组累积产气量为15150 mL，对照组累积产气量为11010 mL，可见处理组比对照组甲烷产量提高了近40%。同时，厌氧发酵的前15天内处理组累积产气量明显高于对照组的累积产气量，厌氧发酵进行到第15天时，处理组累积产气量为12140 mL，对照组累积产气量为8270 mL，处理组比对照组累积产气量提高了46.8 %。由此可见，利用本专利涉及的复合菌系对农作物秸秆进行预处理，并将其应用于生物甲烷实际生产，具有很好的发展潜力。

以上对本发明实施例所提供的木质纤维素降解复合菌系进行了详细介绍，本文中应用了具体实例对本发明的内容及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本专利方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本专利的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京工业大学

<120> 木质纤维素降解复合菌系及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1456

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acagtacaga gtacttagaa tgcgagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120

gaaaccgggg ctaataccgg atgcttgatt gaaccgcatg gttcaattat aaaaggtggc 180

ttttagctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240

caccaaggca acgatgcgta gccaacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300

acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga caaaagtctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttaggga 420

agaacaagta ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540

gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600

gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660

gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720

aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780

cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgcagcaaac 840

gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900

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ggtcttgaca tcctctgaca accctagaga tagggcttcc ccttcggggg cagagtgaca 1020

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080

cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140

caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200

cacgtgctac aatgggcaga acaaagggca gcgaagccgc gaggctaagc caatcccaca 1260

aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320

taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa cctttggagc cagccgccga 1440

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<212> DNA

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ttgacatcct ctgctacttc tagagataga aggttccctt cggggacaga gtgacaggtg 1020

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<400> 3

ggggttacat agagtttgat cctggctcaa tcgtaacaag gtaaccagtt tgatttgatc 60

gttggcgagt gcgcggacgg gtgagcaata tatcttgaac gtgcccagta gcgggggata 120

actactcgaa agagtggcta ataccgcata cgccctacgg gggaaagggg gggattcttc 180

ggaacctctc actattggag cggccgatat cggattagct agttggtggg gtaaaggctc 240

accaaggcaa cgatccgtag ctggtttgag aggacgacca gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaattttg gacaatgggg gaaaccctga 360

tccagccatc ccgcgtgtat gatgaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt tggcagagaa 420

gaaaaggtat ctcctaatac gagatactgc tgacggtatc tgcagaataa gcaccggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc 540

gtaaagcgtg tgtaggcggt tcggaaagaa agatgtgaaa tcccagggct caaccttgga 600

actgcatttt taactgccga gctagagtat gtcagagggg ggtagaattc cacgtgtagc 660

agtgaaatgc gtagatatgt ggaggaatac cgatggcgaa ggcagccccc tgggataata 720

ctgacgctca gacacgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccctaaacga tgtcaactag ctgttggggc cgttaggcct tagtagcgca gctaacgcgt 840

gaagttgacc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacggggac 900

ccgcacaagc ggtggatgat gtggattaat tcgatgcaac gcgaaaaacc ttacctaccc 960

ttgacatgtc tggaatgccg aagagatttg gcagtgctcg caagagaacc ggaacacagg 1020

tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080

caacccttgt cattagttgc tacgcaagag cactctaatg agactgccgg tgacaaaccg 1140

gaggaaggtg gggatgacgt caagtcctca tggcccttat gggtagggct tcacacgtca 1200

tacaatggtc gggacagagg gtcgccaacc cgcgaggggg agccaatctc agaaacccga 1260

tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgc 1320

ggatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggtcttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380

gggagtgggc cacaccagca gtaggtagcc tcacggtata cgatggcagc tacgcagcct 1440

gagatgctgg ccc 1453

<210> 4

<211> 1454

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggaaccgcg ggctataatg cgagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60

gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120

aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt 180

cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240

caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300

gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360

gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420

acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480

ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540

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ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660

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gggggacaga aggg 1454

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggytaccttg ttacgact 18

Claims

1.一种木质纤维素降解复合菌系，其特征是：该复合菌系由粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）CDM4、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CDM7、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CDM2 以及芽孢杆菌（Bacillus sp.）CDM3组成, 各菌株已于2013年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为：CCTCC M2013168、CCTCC M2013169、CCTCC M2013170和CCTCC M2013171；复合菌系是以枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌、粪产碱杆菌和解淀粉芽孢杆菌按菌液体积比2:1:1:2构成，各菌液浓度为10⁸~10⁹个/mL菌液。

2.权利要求1所述的木质纤维素降解复合菌系在降解富含木质纤维素的农用作物中的应用。

3.根据权利要求2述的应用，其特征是：该复合菌系在37 ℃条件下静置培养于蛋白胨纤维素液体培养基中，其中PCS培养基：蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，NaCl 5 g，溶解在1000 mL水中，农用作物添加量1±0.02%（w/v），pH自然，该复合菌系以5±0.5%接种量（v/v）加入到新鲜PCS培养基中，37 ℃条件下静置培养对其中的木质纤维素进行有效降解。