CN110951616B

CN110951616B - 一种纤维素的生物降解方法

Info

Publication number: CN110951616B
Application number: CN201911208705.1A
Authority: CN
Inventors: 朱琳; 冯佩瑶; 张思月; 孔庆辰; 马彩云; 邬甜媛; 陈琦; 钟为章; 杨珂; 许彬; 冯卫博
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2019-11-30
Filing date: 2019-11-30
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2039-11-30
Also published as: CN110951616A

Abstract

本发明涉及一种纤维素的生物降解方法，通过模拟自然条件下纤维素的分解过程，对现有发酵微生物进行预处理，再利用得到的处理后的纤维素降解菌对木质纤维素进行降解；本发明环境友好、操作方便、成本低廉、处理周期短。

Description

一种纤维素的生物降解方法

技术领域

本发明属于生物降解技术领域，具体涉及一种纤维素的生物降解方法。

背景技术

当今世界经济发展高度依赖各种化石能源，如石油、煤炭和天然气等。化石燃料的过度消耗造成了过去几十年里严重的环境污染，引起了温室气体的大幅增加。而生物质资源是短期内可以提供可替代运输燃料的唯一适合和可再生的能源资源。将大量的纤维素类生物质转化为作为运输燃料的生物燃料提供了一个提高能源安全和降低温室气体排放的可行选择。与来源于几百万年前的植物和动物残骸的化石燃料不同，生物燃料来源于现有的植物，它们比化石燃料更为清洁，短周期内的种植和消耗使其吸收和释放出的二氧化碳相平衡。据相关报道，纤维素乙醇和其它生物质乙醇可以减少高达86%的温室气体排放。

玉米秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素这三种木质纤维素组成，其相互交织形成致密的网状结构，其中纤维素和半纤维素被木质素严密地包裹着，而木质素的结构非常顽固，其是具有芳香环的三维聚合物，非水溶性，分子量很大。这样，纤维素和半纤维素不易与纤维素酶接触，难以受到其作用，从而使木质纤维素生物质很难被降解。

自然界中存在着相当多的可以有效分解木质纤维素的细菌、真菌和放线菌等微生物，一般它们都同时和其它一些非木质纤维素分解微生物互生组成小型生态环境，各自发挥各自的优势，更好地分解木质纤维素。纤维素的彻底降解需要多种微生物之间的协同作用，如纤维素降解菌之间的相互作用以及其与非纤维素降解菌间的协同作用。因此，利用协同共生性微生物对纤维素类生物质进行预处理越来越受到关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种环境友好、操作方便、成本低廉、处理周期短的纤维素的生物降解方法。

本发明采用如下技术方案：

一种纤维素的生物降解方法，在对纤维素进行降解之前，首先对发酵微生物进行预处理。所述发酵微生物的预处理具体包括如下步骤：

（1）用玉米秸秆与猪粪、玉米秸秆与微生物催腐剂以及玉米秸秆、微生物催腐剂与猪粪，分别混合调制其C/N为20～25，含水量为80%；在24～26℃下堆积发酵一周；

（2）分别从三个堆体取1g样品各自接种于250mL PCS培养液中，在24～26℃下静止培养，浸入一条新华滤纸（1cm×6cm）作为外观指示，当其刚被分解断开，迅速将该培养液以5%（v/v）的接种量分别转接到新鲜PCS培养液中继续培养；

（3）分别在转接后的培养液中浸入一条新华滤纸（1cm×6cm）作为外观指示，当其刚被分解断开，迅速将该培养液以5%(v/v)的接种量分别转接到新鲜 PCS 培养液中继续培养；重复转接5～6次；

（4）分别检测三组培养液的pH，取pH为7～6.5的培养液和pH为7～7.5的培养液进行混合，对混合后的培养液重复步骤（3），得到纤维素降解菌。

上述纤维素的生物降解方法具体包括如下步骤：

（A）对发酵微生物进行预处理，得到纤维素降解菌；

（B）利用纤维素降解菌对木质纤维素进行降解处理。

其中，所述步骤（B）具体为，向1L PCS培养液中添加木质纤维素5g～40g，并按照5%的接种量向其中接种步骤（A）得到的纤维素降解菌，于25℃静置培养10～15天。

其中，所述步骤（B）中，所述木质纤维素为玉米秸秆或小麦秸秆。

本发明的有益效果在于：本发明模拟自然条件下纤维素的分解过程，对现有发酵微生物进行预处理，利用微生物之间的协同关系，提高了现有发酵微生物对玉米秸秆和小麦秸秆的降解效果。

本方法与传统的物理化学和生物预处理方法相比，环境友好，操作方便，成本低廉，处理周期短，启动速度快，大大降低了资金成本，具有明显的经济效益、社会效益和环保效益。

附图说明

图1为玉米秸秆在不同培养时间内各木质纤维素的变化示意图。

图2为不同时间培养下的发酵液pH变化。

具体实施方式

本发明提供实施例是为了详尽的且完全地公开本发明，并且向所属技术领域的技术人员充分传达本发明的范围。对于表示在附图中的示例性实施方式中的术语并不是对本发明的限定。

实施例1发酵菌种的预处理

（1）用玉米秸秆与猪粪、玉米秸秆与微生物催腐剂以及玉米秸秆、微生物催腐剂与猪粪，分别混合调制其C/N为20～25，含水量为80%；在24～26℃下堆积发酵一周。所述微生物催腐剂为市售产品。

（2）分别从三个堆体取1g样品各自接种于250mL PCS 培养液中，在24～26℃下静止培养，浸入一条新华滤纸（1cm×6cm）作为外观指示，当其刚被分解断开，迅速将该培养液以5%（v/v）的接种量分别转接到新鲜PCS培养液中继续培养。

其中，PCS培养液具体组成成分如下：5g/L蛋白胨，5g/L纤维素（滤纸或玉米秸秆粉），5g/L NaCl，1g/L CaCO₃，2g/L 酵母粉，自然pH。

（3）分别在转接后的培养液中浸入一条新华滤纸（1cm×6cm）作为外观指示，当其刚被分解断开，迅速将该培养液以 5%(v/v)的接种量分别转接到新鲜 PCS 培养液中继续培养；重复转接5～6次。

（4）分别检测三组培养液的 pH，取pH为7～6.5的培养液和pH为7～7.5的培养液进行混合，对混合后的培养液重复步骤（3），得到纤维素降解菌液。

本实施例中的微生物催腐剂购自四川成都合成生物科技有限公司。

实施例2

对实施例1得到的纤维素降解菌的纤维素酶酶活进行测定，采用中华人民共和国国家标准QB 2583-2003。

在含有0.5g滤纸的 100ml PCS培养液中，接种实施例1得到的纤维素降解菌液5mL，25℃静止培养，第 24h、48h、96h、120h、144h和168h取样测定发酵液中纤维素酶活，结果见表1所示。

表1滤纸分解活性

。

由表1可知，第 144h的活性最高，其酶活性为50.6U。在实际观察时，第24h时纸片开始蓬松，第48h时纸片部分被分解，第96小时大部分区域被分解，第120h时纸片已经全部融化掉。如表1可知，96h、120h和144h的发酵时间时，0.5g滤纸分别失重 0.3623g、0.4626g和 0.4834g，其分解率分别为72.46%、92.52%和96.68%，最高失重率出现在144h，而最高的酶活性出现在120h，酶活峰值和失重率峰值不在同一时间，酶活出现时间比较早，而失重是纤维素降解的直接反映，体现了纤维素降解能力。

实施例3

在分别含有0.5g小麦秸秆和0.5g玉米秸秆的 100mL PCS培养液中接种实施例1得到的纤维素降解菌液15ml，25°C静止培养，每24h测定失重和失重率， 120h内的分解率结果见表2。

表2 小麦秸秆和玉米秸秆的分解率

。

表2所示，玉米秸秆的分解率为30.88%，小麦秸秆的分解率为28.2%。作为作物秸秆，其结构较复杂，网联结构和木质素的存在是阻碍酶作用的多重原因。总体说来，经实施例1预处理后得到的纤维素降解菌液相对于原微生物催腐剂对秸秆等复杂的木质纤维素有很好的降解能力。

实施例4

400mL PCS培养液中按玉米秸秆0.5%、1%、2%、3%和4%的添加量分别添加，即分别添加玉米秸秆 2.0g、4.0g、8.0g、12.0g和16.0g，自然pH值，121°C灭菌15min。无菌条件下按5%（v/v）的接种量接种实施例1得到的菌液，于恒温培养箱中25°C恒温静止培养20d，每天测定发酵液的pH值。20d培养后测定玉米秸秆重量变化，结果如表3。

表3 不同添加量的玉米秸秆分解量和分解率

。

由表3可知，随着秸秆添加量的增加，分解量增加，但分解率减少，0.5%添加量的分解量和分解率分别为 1.41g 和 70.9%，而 4%接种量的分解量和分解率分别为7.78g 和48.6%。分析，分解率下降主要是因为在相同的接种量的情况下，反应底物玉米秸秆增加，从而使单位玉米秸秆的菌量减少，从而造成反应不够彻底。在一定时间内，玉米秸秆添加量越大，其绝对分解量也相应的较大。分解量和分解率二者都是研究微生物对纤维素的分解力、持续性和稳定性的重要指标。

从上可知，经预处理后的菌系分解能力强，可以分解小麦秸秆、玉米秸秆等多种纤维素类物质，而且分解效率高，能在较短时间内分解较大部分的纤维素。

实施例5

用含2%玉米秸秆粉末的PCS培养液 100mL接种培养 5%的实施例1预处理后得到的菌液，在第0d、5d、10d、15d和20d测定培养物中纤维素、半纤维素、木质素的含量。结果见图1。

由图1可知，前10天的培养中各成分减少较小，各成分在第 10天到第15天有很大程度的减少，第15天和第20天的减少量不显著。经过20d的培养，玉米秸秆的总干重由1982mg减少至683mg，减少了65.54%，纤维素、半纤维素和木质素分别减少66.59%、65.64%和51.31%，表现出较强的木质纤维素分解能力。优选作用时间为10～15d。

实施例6

用含2%玉米秸秆粉末的PCS培养液100mL接种培养 5%的实施例1预处理后得到的菌液，在0～120h测定发酵液pH值的变化，结果见图2。

由图2可知，pH值变化曲线呈V字形，先快速降低到最低点后又快速回升到保持稳定。

从开始接种到接种发酵36h后，发酵液的pH从8.6左右迅速下降到最低值5.5左右，此后持续上升到96h的7.9左右，此后基本保持稳定，处于8.0左右。

在发酵84h前，发酵液pH值一直处于7.5以下，分析，此时正是纤维素降解的旺盛时期，其分解产生大量的有机挥发性脂肪酸，从而使发酵液pH值持续降低。而发酵进行到96h时，滤纸基本分解完毕，其中发酵液中组分不会再发生大的变化，使发酵液pH值保持稳定，并维持与开始时发酵时发酵液的同等pH水平。

pH值是影响微生物生长代谢的重要因素之一，因此在研究复合系的纤维素分解能力时，把复合系的pH调节能力也进行了充分的研究。因为很多微生物的代谢体系因为生存环境的pH发生改变从而使代谢体系失去平衡，而从我们的研究结果发现，经预处理后，发酵菌在分解纤维素时具有非常强的pH自我调节能力，在旺盛分解纤维素时由于产生有机酸而使pH值降低，但是发酵菌由多种微生物组成，其他组分可能利用这一代谢产物，组分之间通过协同作用，把pH调解到一定水平并保持稳定，从而保证了复合系高效持久地进行纤维素地分解。

实施例7

实施例1得到的纤维素发酵菌液在分解纤维素时是多菌种协同作用的，在其协同分解纤维素时，会产生多种有机物质，比如乙醇、挥发性脂肪酸、乳酸和甘油等。而其中的挥发性脂肪酸是发酵生成甲烷的直接前体，其含量的多少能对生物预处理玉米秸秆后续厌氧消化产甲烷的启动快慢和厌氧消化效率产生直接影响，故其含量测定是纤维素降解菌群对玉米秸秆预处理后用于甲烷生产的重要评价指标。

对预处理后的发酵菌液对玉米秸秆处理 10d，15d 和 20d 后发酵液中挥发性脂肪酸的含量测定结果见表4。

表4 不同时间下处理玉米秸秆发酵液中挥发性脂肪酸的含量

。

由表4可知，发酵时间0天时发酵液中有微量的乙酸（低于0.1mg/L），这是PCS培养液和玉米秸秆本身含有的。不同发酵时间的各种挥发性脂肪酸中，乙酸的浓度最高，其所占比例一般超过总挥发性脂肪酸浓度的一半。各种挥发性脂肪酸浓度随着预处理时间的增加而增加，以前一直处在积累之中，到20d时达到最高，2%和5%接种量的TVFA浓度分别为2602mg/L和2876mg/L。而总体看来，5%接种量比2%接种量的发酵液的VFA浓度均有所增加，但是增加不明显（小于10%）。分析，当TVFA浓度≥2.0g/L时，再高的VFA浓度会抑制纤维素水解酶的活性，从而抑制纤维素水解效率，而在15d预处理的TVFA浓度高于2.0g/L，因此此后的纤维素水解酶对玉米秸秆的活性受到抑制从而降低，从而因玉米秸的水解酸化过程中的VFA生产受到反馈抑制，因此预时间的增加没有出现TVFA浓度的大幅增长。

此外，由表4还可知，正是由于VFA等有机酸在发酵初期的大量积累，其浓度迅速增加，从而造成了复合菌系在分解玉米秸秆前期pH的迅速下降，而到发酵中后期，有机酸积累相对减少，pH又逐渐恢复。发酵液中pH值是VFA浓度变化的一个间接反映。

通过对以上指标的分析，经预处理后，菌剂在降解玉米秸秆的过程中可以通过组分之间的协同作用，把pH调解到一定水平并保持稳定，在10～15d即可将纤维素、半纤维素和木质素分别减少66.59%、65.64%和51.31%，表现出较强的木质纤维素分解能力。

从甲烷生产的有效发酵产物挥发性脂肪酸来看，含量比较高，其中最重要的乙酸和丙酸的含量占大多数。这些物质都是重要的化工原料，在能源领域发挥着重要的作用。可以利用其一产物生产为主要目标，调控其发酵过程的，促进该有效成分的大量积累，实现加快和有效提高纤维素物质利用于能源生产的产率和规模化和产业化进程。

此外，与传统的物理化学和生物法相比，本发明的操作简单，成本低廉，作用周期短，启动速度快，产物产率高且对设备要求不高从而大大降低了资金成本，具有明显的经济效益、社会效益和环保效益。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种纤维素的生物降解方法，其特征在于，

（A）对发酵微生物进行预处理，得到纤维素降解菌；其包括如下步骤：

（2）分别从三个堆体取1g样品各自接种于250ml PCS培养液中，在24～26℃下静止培养，浸入一条新华滤纸作为外观指示，当其刚被分解断开，迅速将该培养液以5%的接种量分别转接到新鲜PCS培养液中继续培养；

（3）分别在转接后的培养液中浸入一条新华滤纸作为外观指示，当其刚被分解断开，迅速将该培养液以5%的接种量分别转接到新鲜PCS培养液中继续培养；重复转接5～6次；

（4）分别检测三组培养液的pH，取pH为7～6.5的培养液和pH为7～7.5的培养液进行混合，对混合后的培养液重复步骤（3），得到纤维素降解菌；

（B）利用纤维素降解菌对木质纤维素进行降解处理：

向1L PCS培养液中添加木质纤维素5g～40g，并按照5%的接种量向其中接种步骤（A）得到的纤维素降解菌，于25℃静置培养10～15天；

所述木质纤维素为玉米秸秆或小麦秸秆。