CN104630122B - 具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌 - Google Patents

具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌，属于环境微生物领域。该兽生气单胞菌菌株的分类命名为兽气单胞菌(Aeromonas bestiarum)，保藏编号为CGMCC No.10332。本发明菌株从驯化的活性污泥混合菌群体系中筛选所得，可应用于制备聚羟基链烷酸酯。通过选择发酵合成条件，利用乙酸钠为碳源，本发明菌株合成PHAs总量达到菌体干重的63.21％。

Description

具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌
技术领域
本发明涉及一种具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌，具体涉及一株从活性污泥菌群中筛选出的兽生气单胞菌，能利用乙酸钠碳源合成PHAs，合成量达到菌体干重的63.21％，属于环境微生物领域。
背景技术
聚羟基链烷酸酯(Polyhydroxyalkanoate，简称PHAs)是一类细胞在营养非平衡的条件(碳源过量，而氮源、磷、镁、硫等相对缺乏)下生长时积累的碳源和能源储存物质。在自然界，能产生PHAs的微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌，近300种微生物，例如放线菌属、产碱菌属、假单胞菌属、根瘤菌属等。
聚羟基脂肪酸酯具有类似于塑料的理化特性并具有生物可降解性，现己成功开发出缝合线、无纺布和各种包装用材料的系列产品，可望在农业、食品、日用消费品、环保、电子、医学等领域获得广泛的应用。
目前的研究报道中已有关于聚羟基链烷酸酯合成菌种的研究，但尚未见气单胞菌合成聚羟基链烷酸酯的报道。Macrae R M等发现PHAs的积累是菌体在C、N营养失衡条件时生长产生的，从而开创了微生物发酵生产PHAs的先河。Shi H P等发现Brachymonas sp.P12在以醋酸盐为主要碳源时，PHB(聚-β-羟丁酸，poly-β-hydroxybutyrate)是主要的PHAs产物。董兆麟等分离得的一株固氮菌，可利用淀粉在细胞内积累大量的PHB，经小型发酵试验测定，B6菌株产PHB的量达细胞干质量的41.5％。陈宏等从土壤中分离到产生PHB的菌株NS-82#，经过菌种形态和生理生化特征的研究，确定为芽抱杆菌，其PHB产生量约占细胞干质量的53％。Serafim等研究了混合菌群在ADF工艺条件下增加乙酸浓度后PHA的合成情况。该实验以乙酸为底物利用SBR反应器对活性污泥进行了时间长达3年的驯化，用来选择具有较强PHA合成能力的菌群。驯化过程中的PHB合成一直稳定在35％(细胞干重比)，当乙酸浓度由450mg/L增加到5400mg/L时，PHB的合成量占细胞干重的56.9％。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能在乙酸钠活性污泥体系中生长并高效合成PHAs的菌株。
一种具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌，该菌株的分类命名为兽气单胞菌(Aeromonas bestiarum)，保藏编号为CGMCC No.10332，保藏日为2015年1月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明菌株从驯化的活性污泥混合菌群体系中筛选获得。首先进行菌株分离和筛选及纯化；随后进行菌落形态特征、生理和生化特征研究，通过测序和BLAST比对进行鉴定；最后研究了该菌合成PHAs的工艺条件。
本发明兽生气单胞菌株(Aeromonas bestiarum Ace-12)的筛选和分离过程：取自北京市高碑店污水处理厂好氧回流污泥，采用乙酸钠为碳源进行污泥驯化，稳定后，用无菌水稀释不同倍数，取1μL涂布在固体培养基上，30℃恒温箱中培养48h。首先利用尼罗蓝平板染色法，挑取培养基出现橘黄色荧光的菌落。将得到的21株纯菌接种至发酵培养基中进行发酵合成性能测试，复筛出产PHAs的菌株，其中Ace-12的合成量最大。
结合该兽生气单胞菌株(Aeromonas bestiarum Ace-12)菌落形态特征、生理和生化特征，将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定其为兽生气单胞菌(Aeromonasbestiarum Ace-12)。兽生气单胞菌(Aeromonas bestiarum Ace-12)的16SrDNA序列Accession No.为KF749383。
本发明还提供了上述兽生气单胞菌(Aeromonas bestiarum Ace-12)在制备聚羟基链烷酸酯中的应用。所述的兽生气单胞菌(Aeromonas bestiarum Ace-12)在缺氮培养、好氧条件下合成聚羟基链烷酸酯。
上述应用中，在缺氮培养发酵中合成聚羟基链烷酸酯。所述缺氮培养基包括乙酸钠浓度为20g/L，酵母粉0.35g/L，KH2PO4 2.65g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，Na2HPO4·12H2O3.8g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl2·2H2O 0.05g/L，FeCl3·3H2O 0.01g/L。缺氮培养条件为：pH 7.0-8.5，优选为pH 7.0-8.0，培养温度为25-35℃，培养时间为24-48h，溶解氧1-3mg/L。
通过选择发酵合成条件，利用乙酸钠为碳源，本发明菌株合成PHAs总量达到菌体干重的63.21％。
本发明的优点：
1、本发明提供了一株兽生气单胞菌，能产生聚羟基链烷酸酯，在缺氮培养基中有氧合成48h，PHAs量达菌体干重的63.21％，具有较高的合成量。
2、与其它产PHAs的菌种相比，该株兽生气单胞菌在工业化生产方面更有前景。例如，Aeromonas bestiarum Ace-12菌是使用乙酸钠作为碳源的，所以PHAs的生产成本相对较低。
3、本发明菌株从活性污泥体系中筛选所得，具有天然生长优势，易于发酵培养。
保藏信息：
兽生气单胞菌株(Aeromonas bestiarum Ace-12)，该菌株的分类命名为兽气单胞菌(Aeromonas bestiarum)，保藏编号为CGMCC No.10332，保藏日为2015年1月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1是本发明菌种系统发育树。
图2-1和图2-2分别是碳源类型、氮源类型对本发明菌株合成PHAs的影响。
图3-1和图3-2分别是提取的PHAs产品与标准样品的红外光谱。
具体实施方式
实施例1：兽生气单胞菌(Aeromonas bestiarum Ace-12)菌株的筛选
1、菌种和培养基、培养条件
(1)菌源
菌源来自于城市污水处理厂的活性污泥。接种污泥采用的是北京市高碑店污水处理厂的回流污泥，以乙酸钠、氯化铵、磷酸氢二钾为底物，调节碳氮磷比，采用序批式反应器(Sequencing Batch Reactor，SBR)驯化具有高PHAs储存能力的活性污泥。反应器有效容积为10L，采用瞬时进水方式，每个周期进水2L，运行12h，包括采用鼓风泵曝气10h，沉淀1.5h、排水和进水0.5h，每天运行两个周期，连续两周以上完成驯化。
(2)培养基
选择培养基(g/L)：蒸馏水1000mL，牛肉浸出粉10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖20g，琼脂20g，尼罗蓝50mg，pH7.2，高压蒸汽灭菌0.1MPa，15-20min，温度降至50℃，摇匀倒平板备用。
纯化培养基(g/L)：蒸馏水1000mL，酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，牛肉浸粉15g，(NH4)2SO45g，琼脂20g，pH7.0，高压蒸汽灭菌0.1MPa，15-20min。
种子培养基(g/L)：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，pH7.0，高压蒸汽灭菌0.1MPa，15-20min。
发酵培养基(g/L)：乙酸钠10.0g，NH4Cl 0.35g，KH2PO4 2.65g，MgSO4·7H2O0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.8g，ZnSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·2H2O 0.05g，FeCl3·3H2O 0.01g，pH7.0，高压蒸汽灭菌0.1MPa，15-20min。
2、菌株的分离与鉴定
(1)菌株的分离
利用尼罗蓝平板染色法，采用梯度稀释及涂布法将SBR反应器中的混合液均匀涂布于尼罗蓝培养基(选择培养基)，30℃恒温培养48h。随着细胞的生长，尼罗蓝将逐渐渗入细胞，与胞内的PHAs结合，当达到一定量后，就可在紫外灯下直接观察菌落发出的荧光，通过菌落所发荧光的强弱，就可判断细胞内所含PHAs的量。在365nm紫外灯的照射下，挑取培养基出现橘黄色荧光并且菌落形态不相同的单菌落21个。
采用纯化培养基在平板上划线进行菌株的纯化。划线筛选得到的纯菌株在试管中划斜面保存(用纯化培养基)。
然后将各菌株接种于种子培养基中培养24h，以5％(体积百分比)的接种量(100ml培养液中接种5ml)接种至发酵培养基中进行发酵合成性能测试，复筛出纯的产PHAs的菌株。其中，Ace-12的合成量最大。
(2)菌株的形态特征与生理生化特性
该菌菌落为微白色、半透明、椭圆形。该菌与培养基紧贴性较弱且在显微镜下观察到该菌菌体为杆状，周生鞭毛。通过革兰氏染色，该菌在显微镜下呈现红色，为阴性。生理生化反应表明，该菌株具有氧化酶，过氧化氢酶实验呈阳性，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡，能够很好的水解淀粉，能够很好的利用糖和柠檬酸盐，MR反应呈阳性说明菌株分解葡萄糖时产酸，pH在4.5以下，酸性很强。
采用细菌通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；反向引物1492R：5’-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增，送至北京市三博远志公司进行测序。应用BLAST在GenBank数据库中把序列和16SrDNA基因进行比较，用MEGA 4构建分子进化树，采用Neighbor.Joining rNJ法的Complete Deletion模式建树，用Bootstrap进行检验，并重复1000次，得到的菌种系统发育树如图1所示。分析表明Ace-12菌十分接近兽生气单胞菌(100％亲缘性)，确定该菌株为兽生气单胞菌。
实施例2：兽生气单胞菌(Aeromonas bestiarum Ace-12)合成PHAs
1、碳源、氮源利用实验
应用单一变量法来研究碳源类型、氮源类型对第二步菌株有氧合成PHAs的影响。葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油、乙酸钠、丁酸钠、乙醇、可溶性淀粉作为碳源，对鉴定出的兽生气单胞菌进行单一碳源利用实验时，氯化铵、硝酸铵、硝酸钠、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、尿素作为氮源，对鉴定出的兽生气单胞菌进行单一氮源利用实验。
所有的培养基均含有KH2PO4 2.65g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，Na2HPO4·12H2O3.8g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl2·2H2O 0.05g/L，FeCl3·3H2O 0.01g/L，pH7.0，所有的细菌均在30℃、160r/min条件下摇床培养48h。
离心收集，冻干、真空冷冻干燥24h，称量菌体得出菌体干重。气相色谱法测定PHAs及其单体组成的含量。通过计算PHAs占干菌重的百分比例分析菌株的合成PHAs的能力。
结果如下：
从图2-1中可以看出，该菌以不同碳源合成PHAs的能力有所不同，该菌利用乙酸钠为碳源合成PHAs产量最高，可达菌重的53.51％。
从图2-2中可以看出，该菌以不同氮源合成PHAs的能力有所不同，该菌利用酵母粉为氮源合成PHAs产量最高，可达菌重的57.89％。
2、正交发酵试验
在确定了发酵培养基中碳源和氮源的最佳配方的基础上，设计正交试验，采用兽生气单胞菌(Aeromonas bestiarum Ace-12)在缺氮培养、好氧条件下合成聚羟基链烷酸酯，确定最佳条件。
所有的培养基均含有酵母粉0.35g/L，KH2PO4 2.65g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，Na2HPO4·12H2O 3.8g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl2·2H2O 0.05g/L，FeCl3·3H2O0.01g/L，以乙酸钠为碳源，pH7.0，溶解氧为1-3mg/L，所有的细菌均在30℃、160r/min条件下摇床培养48h。
离心收集，冻干、真空冷冻干燥24h，称量菌体得出菌体干重。气相色谱法测定PHAs含量。通过计算PHAs占干菌重的百分比例分析菌株的合成PHAs的能力。
表1基于四因素三水平的正交实验设计
发酵实验结果与分析：
表2正交实验结果
借助IBM SPSS Statistics 19.0软件进行数据分析，从表3可以看出，对兽生气单胞菌(Aeromonas bestiarum Ace-12)的PHAs合成能力影响因素最主要的是碳源浓度，其次为pH和时间，温度的影响最小。
通过上述实验，可以看到在碳源浓度为10-30g/L，初始pH为7.0-8.0，培养温度为25-35℃，培养时间为24-48h，溶解氧为1-3mg/L的条件下，合成PHAs的产率可达到50.38％-63.21％。
通过正交试验优选出该菌株的合成PHAs的优选培养条件为：温度为35℃、培养时间为36h、初始pH值为7.0、碳源浓度为30g/L。在最优水平条件下，PHAs的合成量达到细菌干重的63.21％。
表3正交实验结果分析
实施例3：兽生气单胞菌(Aeromonas bestiarum Ace-12)合成PHAs的提取与红外检测
取1L发酵液，4℃6000r/min离心10min，弃清液加入次氯酸钠破壁，离心10min，弃掉上清液，蒸馏水洗离心10min，弃掉上清液，加入适量丙酮离心10min，弃掉上清液，将菌体置于60℃恒温下30min，待丙酮挥发殆尽，加入适量三氯甲烷，摇匀，将溶解PHAs的三氯甲烷置于培养皿中，70℃恒温120min，三氯甲烷挥发殆尽得到PHAs膜。
提取的PHAs膜进行红外光谱分析，一般认为，羰基峰在1724cm-1左右，确定为PHAs。如图3-1和图3-2所示，分别得到的样品与标准样品具有相似的红外谱图，经过对比，确定该株兽生气单胞菌(Aeromonas bestiarum Ace-12)合成的样品为PHAs。
本发明菌株从驯化的活性污泥混合菌群体系中筛选得到，可应用于制备聚羟基链烷酸酯。通过选择发酵合成条件，利用乙酸钠为碳源，本发明菌株合成PHAs总量可达到菌体干重的63.21％。

Claims (5)

1.一种具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌，其特征在于：该兽生气单胞菌菌株的分类命名为兽气单胞菌(Aeromonas bestiarum)，保藏编号为CGMCC No.10332。
2.根据权利要求1所述的具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌在制备聚羟基链烷酸酯中的应用。
3.根据权利要求2所述的具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌在制备聚羟基链烷酸酯中的应用，其特征在于：采用所述的兽生气单胞菌在缺氮培养、好氧条件下合成聚羟基链烷酸酯。
4.根据权利要求3所述的具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌在制备聚羟基链烷酸酯中的应用，其特征在于：所述的缺氮培养中，采用的培养基包含20g/L的乙酸钠，0.35g/L的酵母粉，2.65g/L的KH2PO4，0.2g/L的MgSO4·7H2O，3.8g/L的Na2HPO4·12H2O，0.01g/L的ZnSO4·7H2O，0.05g/L的CaCl2·2H2O，0.01g/L的FeCl3·3H2O。
5.根据权利要求4所述的具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌在制备聚羟基链烷酸酯中的应用，其特征在于：所述的缺氮培养中，pH为7.0-8.0，培养温度为25-35℃，培养时间为24-48h，溶解氧为1-3mg/L。
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