CN101300354A - 具有改良的聚羟基链烷酸产生能力的去调节的细菌 - Google Patents

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Abstract

提供具有改良的聚－3－羟基链烷酸(PHA)产生特性的突变细菌和产生及使用它们的方法。

Description

具有改良的聚羟基链烷酸产生能力的去调节的细菌
发明领域
本发明涉及基本产生高水平的聚羟基链烷酸(PHA)生物高聚物的突变微生物。
发明背景
许多微生物合成和积聚作为能量存储化合物的羟基链烷酸聚合物(聚羟基链烷酸，PHA)的能力早已得到公认。该类中最常见的化合物为聚(D(-)-3-羟基丁酸)(PHB)。然而，有些种类的微生物积聚共聚物，除羟基丁酸外，该共聚物可包含更长链的羟基链烷酸。兴趣集中于这些PHAs，因为这些生物高聚物为生物相容的、生物可降解的热塑性塑料，显示类似于石化基聚合物如聚乙烯和聚丙烯的性质的物理性质。
一种产生PHA的示例性细菌，真养沃特氏菌(Wautersia eutropha)(也称作真养罗尔斯顿菌(Ralstonia eutropha)或真养产碱菌(Alcaligeneseutrophus))，适应临界营养素如磷酸和氮的限制在发酵期间积聚PHA。由细菌两步发酵典型地产生PHA。在第一阶段，在包含允许增殖性生长的完全供给营养素的培养基中培养细菌。允许细菌繁殖，直到细菌达到足够的生物量，该生物量通常以每升的干细胞重量来测量。在第二阶段，限制至少一种生长所必需的营养素例如氮或磷的利用度，这具有限制细胞分裂和诱导PHA产生的作用。当营养限制诱导PHA的积聚时，直到第二阶段才发生相当量的PHA生成。
大多数产生PHA的生物体在非限制生长条件下不产生显著水平的PHA。例如已报导当在无营养限制的条件下培养时，以干细胞重量的百分比计，沃特氏菌属(Wautersia)(真养罗尔斯顿菌)仅产生3％的PHA。Repaske等，Appl Environ Microbiol。第32卷：第585-591页，1976年。
这需要在存在不限制营养素的水平时产生显著水平的PHA的修饰细菌。
发明概述
本发明提供分离的营养素去调节的修饰细菌，该细菌在含允许增殖性生长的足量营养素的培养基存在下，与未修饰的细菌相比，产生令人惊讶的量的PHA。这样的细菌在存在不限制重要营养素如氮、磷、镁、硫酸盐和钾的水平时，产生显著水平的PHA。
本发明的新型分离细菌(a)在不限制营养素水平的培养条件下，以细胞干重计，产生至少10％的聚羟基链烷酸(PHA)，和(b)在限制铁但不显著限制其它营养素的培养条件下，以细胞干重计，产生至少20％的PHA。本发明任选不包括该领域先前已知的分离细菌，所述细菌在不限制营养素水平的培养条件下，以细胞干重计，产生约50％或更多的PHA，且该细菌在限制铁但不显著限制其它营养素的培养条件下，显示PHA的产生增长至少约10％。
示例性细菌选自罗尔斯顿菌(Ralstonia species)、产碱杆菌(Alcaligenes species)、沃特氏菌(Wautersia species)、动胶菌(Zoogloeaspecies)、芽胞杆菌(Bacillus species)、气单胞菌(Aeromonas species)、固氮菌(Azotobacter species)、芽胞梭菌(Clostridum species)、诺卡氏菌(Nocardia species)、盐杆菌(Halobacterium species)或假单胞菌(Pseudomonas species)，或其组合。本发明的细菌特别不包括已知在不限制营养素水平的培养条件下，以细胞干重计，产生超过50％的PHA的细菌，如广泛产碱菌(Alcaligenes latus)和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)的突变体(在NADH氧化酶中的突变)。以细胞重量计，广泛产碱菌产生约88.3％的PHB(Lee等，Polym.Degradation Stab.第59卷：第387-393页，1998年)，以细胞重量计，维涅兰德固氮菌产生约94％的PHA(Page等，Can.J.Microbiol.第41卷：第106-114页，1995年)。
这些修饰细菌可去除一种营养素的调节如磷酸去调节或氮去调节，或可去除两种或多种营养素的调节如磷酸去调节和氮去调节。优选，细菌为营养素去调节的产生PHA的生物体，或被另外改造以包含非天然产生PHA的基因如phaC、A和/或B的PHA阴性突变株。
示例性细菌为2005年6月1日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box 1549 Manassas，VA 20108，USA的那些细菌，保藏号分别为PTA-6759和PTA-6760。
本发明也提供还显示以ATCC保藏号PTA-6759保藏的细菌或以ATCC保藏号PTA-6760保藏的细菌的所有鉴别特征的分离细菌。这些细菌的示例性实施方案为已保藏的细菌的后代，或保藏的细菌的突变体，其在不限制营养素水平的培养条件下，与未修饰的生物体相比，保留已保藏的细菌的鉴别特征，即保留相同或相似的引起PHA产生增加的突变。
此外，本发明提供包含本发明的分离细菌和培养基的培养物。本发明还提供用本文所述的本发明的任一种细菌产生PHA的方法。这样的产生方法包括在合适的培养基中使细菌生长，以使细菌产生PHA的步骤。另外的任选的步骤包括收获细菌，和/或从细菌中萃取PHA。或者，如果PHA被分泌入培养基内，该方法可包括使细菌在合适的培养基中生长和从培养基中萃取PHA的步骤。
只要将足够的营养素供给给生物体以允许生长或产生PHA，可使用在该领域中所知的任何培养基和培养方法。在一方面，本发明因此提供在不限制必需营养素(即营养素以从不限制到引起增殖性生长停止的程度这样的浓度存在)的培养基中培养这样的细菌的方法。通过实例，只要在培养基中的营养素没有限制到将显著削弱增殖性生长的浓度，培养过程包括将细菌从一个发酵罐转移至另一个发酵罐(按比例增加)、以及分批或连续进料。
在另一方面，本发明还提供依照两步培养法培养本发明的细菌的方法，在该两步培养法中，细菌在限制一种或多种必需营养素如无机元素的培养基中经历第二步的培养。
本发明也提供通过限制细菌未去调节微量元素产生PHA的改良方法。例如，在充分时期的增殖性生长之后，通过使磷酸去调节的细菌在含限制水平的除磷之外的元素如镁、硫酸或铁(优选铁)的培养基中生长，可达到PHA产生的提高。
提供产生由C4和中等链长的单体(如大于5个碳的单体单位)组成的PHA共聚物的方法。示例性共聚物包括含C6、C7、C8、C10、C12、C14、C16和C18共聚物，如3-羟基己酸酯(HH)(C6)、3-羟基庚酸酯(HHp)(C7)和/或3-羟基辛酸酯(HO)(C8)，特别为含C4和C6(特别为3-羟基丁酸酯和3-羟基己酸酯或相应的酸)的共聚物，如羟基丁酸酯与羟基己酸酯共聚物(C4-C6)，最特别为80-98％摩尔范围的C4和2-20％摩尔的C6。在美国专利第6,225,438号中描述了另外的共聚物和合适的培养基。
发明详述
本发明提供分离的、修饰的“营养素去调节”的细菌，该细菌在含有允许增殖性生长的足量营养素的培养基存在下，与未修饰的细菌相比，产生令人惊讶量的PHA。这样的修饰细菌可被去除一种营养素的调节，如磷酸去调节或氮去调节，或可被去除两种或多种营养素的调节如磷酸去调节和氮去调节。其它示例性修饰细菌包括镁去调节、硫酸去调节、钾去调节或铁去调节的生物体。
在示例性实施方案中，本发明的细菌能够(a)在不限制营养素水平的培养条件下，以细胞干重计，产生至少10％、20％、25％，或30％或更高的PHA和(b)在限制铁但不显著限制其它营养素的培养条件下，以细胞干重计，产生至少20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％，或80％或更高的的PHA。这样的细菌包括产生PHA的在该领域中已知的任何细菌，但特别不包括已知在不限制营养素水平的培养条件下，以细胞干重计，产生超过50％PHA的细菌，如广泛产碱菌和维涅兰德固氮菌的突变体(在NADH氧化酶中的突变)，以细胞重量计，该两种细菌中的每种细菌均积聚PHB至超过90％的水平。
甚至在存在包含无限制的重要营养素的丰富培养基时，通过在磷酸去调节的细菌中产生PHA，本质上发生PHA的产生。在整个发酵中利用丰富的培养基或更丰富的、廉价的培养基的能力允许细菌的更快生长、PHA的更高产生，和在降低成本下的更利于PHA工业化产生的方法(见实施例8和9)。消除限制一种或多种营养素的必要性也允许连续发酵(即消除两步培养法的需要)。
当用于本文时，″分离的细菌″指已被鉴别和从其自然环境的成分中分离的细菌单一菌株的群体。例如，为包含人工培养基的培养组合物的部分的细菌被认为为分离的。
当用于本文时，″含不限制营养素水平的培养基″或″其中营养素水平不受限制的培养基″指含适当补给的所有营养素以允许细菌迅速繁殖的培养基。相似地，″营养素的不限制水平″指在足以支持快速增殖性生长的培养基中的那种营养素的浓度。相反，″限制营养素的培养基″指营养素的水平被减少到引起细菌的增殖性生长基本上停止的浓度的培养基；而″营养素的限制水平″指引起细菌的增殖性生长基本上停止的培养基中的那种营养素的浓度。
当用于本文时，″增殖性生长″指如在指数生长期间观察到的细菌数量的快速增长。
当用于本文时，″磷去调节的″细菌指在磷或磷酸调节中具有缺陷，从而由磷耗尽通常被向上调节(或被抑制)的一个或多个基因被基本上向上调节(或被抑制)，结果甚至在没有磷耗尽时细菌合成PHA的水平增高的细菌。相似地，″氮去调节的″细菌指在氮调节中具有缺陷，从而由氮耗尽通常被向上调节(或被抑制)的一个或多个基因被基本上向上调节(或被抑制)，结果甚至在没有氮耗尽时细菌合成PHA的水平增高的细菌。其它营养素去调节的细菌的含义与此相似。
当用于本文时，″PHA阴性″突变细菌指已被突变，从而不产生PHB或PHA的细菌[见例如Schlegel等，Arch.Mikrobiol.第71卷：第283-4830页，1970年]。可通过插入期望的PHA基因，例如通过用来自豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)表达野生型phaC基因的pJRDEE32d13转化，来从基因上改造这样的细菌以产生PHA(Fukui等，J.Bacteriol.第179卷：第4821-4830页，1997年；和美国专利第5,981,257号)。
通过关于如磷去调节细菌的非限制性实例，这样的细菌可具有在以下基因或调节区中的突变：涉及磷或磷酸的检测，因此当无磷或磷酸时细菌似乎探测磷耗尽的基因或调节区(例如启动子区、操纵基因、调节物(regulators)的DNA结合位点等)；或在涉及磷酸转运的基因或调节区；或在激活其它基因对磷耗尽的响应(或相反地抑制基因对磷损耗响应的另一个调节物)的正磷酸调节物的基因或调节区；或在抑制基因对过量的磷酸的响应(或相反地激活基因对过量的磷酸响应的另一个调节物)的负磷酸调节物的基因或调节区；或在由这样的正磷酸调节物或负磷酸调节物调节其转录的一个下游基因(或其调节区)中；或在修饰或调节主要的正磷酸调节物或负磷酸调节物的一个基因(或其调节区)中。在厌氧和需氧条件下可有不同的调节途径。
涉及磷调节的示例性基因包括与以下基因同源的基因：埃希氏大肠杆菌(E.Coli)基因pstA(phoT)(参与磷酸转运)、pstB(参与磷酸转运)、phoW(pstC)(参与磷酸转运)、phoS(磷酸结合的蛋白)、phoU(参与磷酸转运)、phoE(外膜孔蛋白(porin))、ugpB(甘油-3-磷酸结合蛋白)、phoR(负磷酸调节物)、phoB(正磷酸调节物)、phoM(正磷酸调节物)、psiE(磷酸饥饿诱导型基因)、phn(psiD)(磷酸饥饿诱导型基因)、phoG(psiH)(磷酸饥饿诱导型基因)。参见在以下文献中的这样的基因和途径的描述：如Amemura等，J.Mol.Biol.184：241-250，1984；Makino等，J.Mol.Boil.190：37-44，1986；Wanner等，″在埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)中基因表达的磷酸调节″Escherichia coli andSalmonella typhimurium 1326-1333，1987；Yamada等，J.Bacteriol.171：5601-5606，1989；Rao等，J.Bacteriol.180：2186-2193，1998；Novak等，J.Bacteriol.181：1126-1133，1999；和Kim等，J.Bacteriol.182：5596-5599，2000。
参与氮调节的示例性基因包括AmtA(参与铵转运)、GInD(尿苷酰转移酶(uridylyltransferase)/消除尿苷酰(uridylyl)的酶)(涉及感觉细胞内的氮状况)、GInB(P11)(涉及感觉细胞内的氮状况)、GInK(参与氮调节的信号转换蛋白)、glnE(腺苷腺转移酶(adeylyltransferase))、NtrB(为氮调节物的感觉组氨酸蛋白激酶)、NtrC(为氮反应调节物的DNA结合蛋白)、rpoN(在某些假单胞菌中)、GInR(在由过量的氮激活的芽胞杆菌属(Bacillus)中的负氮调节物)、TnrA(在由氮限制激活的芽胞杆菌属中的调节物)、CodY(在由过量的氮激活的芽胞杆菌属中的负调节物)。受NtrBC转录调节的基因包括glnALG、glnHPQ、argT、hisJQMP、nasFEDCBA、nac、gltF。参见在以下文献中对这样的基因和途径的描述：如Merrick等，Microbiol.Rev.59：604-622，1995；Atkinson等，Molecular Microbiol.29：431-437，1998；Fisher，Molecular Microbiol.32：223-232，1999；和Blauwkamp等，Molecular Microbiol.46：203-214，2002。
耐抗重金属罗尔斯顿菌(Ralstonia metallidurans)CH34，以前的真养罗尔斯顿菌和真养产碱菌(及也被称作钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)或真养沃特氏菌)，的基因组已被测序，序列数据可从能源部的联合基因组协会(JGI)获得。真养罗尔斯顿菌(以前的真养产碱菌CH34)的基因序列也可从Brookhaven国家实验室获得。茄科罗尔斯顿菌(Ralstonia solanacearum)的基因组序列可从Genoscope和NCBI获得。可例如使用BLAST来搜寻罗尔斯顿菌属(Ralstonia)的基因组序列，以用在埃希氏大肠杆菌或其它细菌中的调节物的同源性来鉴别序列。
可通过辐射或其它诱变剂来修饰细菌，或可通过基因工程来修饰细菌。实施例1-3举例说明具有所需特性的细菌的突变发生和选择。简言之，通过使诱变的细菌在含不限制浓度的磷酸和检测碱性磷酸酯酶活性的培养基中生长，诱变和选择用于磷酸去调节的真养罗尔斯顿菌(R.eutropha)的PHA阴性突变株。使用类似的方法(例如突变发生后在含非限量的氮或其它所需营养素的培养基中生长)，获得其它的营养素去调节的突变细菌。
在活跃的增殖性生长期(也称为对数期)，优选的突变细菌显示增强的PHA的基本的产生水平，导致甚至在存在不限制浓度的营养素如磷酸、氮等时，在较早的时间点，就接近PHA的最大积聚。
以该方式制备的示例性细菌已于2005年6月1日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box 1549 Manassas，VA 20108，USA，保藏号分别为PTA-6759和PTA-6760。
本发明预期保留相同的或相似的突变导致期望的去调节特性的这样细菌的后代或突变体。例如，只要它们保留营养素去调节的特性，可进一步诱变这样的细菌，以分离具有另外的所需特性的细菌。也可通过重组基因工程来赋予另外的所需特性。例如，可通过质粒或重组导入具有所需特性的新基因，或可使细菌的基因组中存在的基因或调节区突变，以使它们激活或失活。
此外，例如通过对突变细菌的基因组或基因产物测序以鉴别突变，或限制片段长度的多形性分析(用限制酶消化以鉴别由突变造成的不同的限制点)，或杂交模式分析(在与探针相同的基因组序列和包含突变的基因组序列之间区分的杂交条件下，已知序列的探针杂交)，或在该领域中已知的突变检测的任何其它方法，可鉴定具有引起可观察到的磷酸去调节或氮去调节表型的突变体。对于突变的鉴定，可通过在它们的基因组中插入或删除，从遗传上改造野性型细菌，以在相同的区域(例如调节区或基因)包含突变。
如果细菌为PHA阴性突变株，例如通过用能产生PHA的、从豚鼠气单胞菌表达phaC基因的质粒来转化，优选将该细菌另外设计以包含期望的产生PHA的基因例如phaC、A和/或B(Fukui等，J.Bacteriol.179：4821-4830，1997；和美国专利第5,981,257号)。备选的示例性基因包括来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的phaC(美国专利第6,475,734号)或来自嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)4AK4的phaC(SEQ ID NO：1)。见美国专利第5,661,026号和第5,798,235号。
细菌
本发明包括能产生聚羟基链烷酸的任何细菌。这些细菌包括但不限于属于以下属的菌种：沃特氏菌属、产碱杆菌属、罗尔斯顿菌属、动胶菌属(Zoogloea)、芽胞杆菌属、气单胞菌属(Aeromonas)、固氮菌属(Azotobacter)、梭状芽胞杆菌属(Clostridum)、诺卡氏菌属(Nocardia)、盐杆菌属(Halobacterium)和假单胞菌属(Pseudomonas)。细菌可为天然的或被基因工程改造的。在以上菌属中，罗尔斯顿菌属、芽胞杆菌属、假单胞菌属和固氮菌属被典型地使用。真养沃特氏菌，以前被称为真养罗尔斯顿菌，以前称为真养产碱菌，被最典型地使用。在例如″伯基氏细菌学鉴定手册(BERGEYIS MANUAL OF DETERMINATIVEBACTERIOLOGY)，第八版，The Williams&Wilkins公司/巴尔的摩″中描述了属于罗尔斯顿菌属(产碱杆菌属)的这些细菌的细菌学性质。本发明的细菌特别不包括已知在不限制营养素水平的培养条件下，以细胞干重计，产生超过50％的PHA的细菌，如广泛产碱菌和维涅兰德固氮菌的突变体(在NADH氧化酶中的突变)，以细胞重量计，这两种细菌各自积聚PHA至超过90％的水平。
培养基
通常以易同化的形式存在的、典型地作为水溶性盐的、细菌生长期望的必需营养素包括碳源和至少以下的无机元素：氮、磷、硫、钾、钠、镁、钙和铁，任选具有痕量的锰、锌、镍、铬、钴和/或铜。
碳源为可被细菌利用的任何物质，包括合成的、天然的或修饰的天然碳源。示例性碳源包括但不限于脂肪酸包括己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸，和更长链的脂肪酸；或脂肪酸的盐、酯(包括与羟基取代酸有关的内酯)、酐、酰胺或卤化物；油包括植物油来源，如玉米油、大豆油、棕榈仁油、棉籽油、菜籽油、花生油、这些类型植物油的任何的分馏油，和/或其衍生物，和/或其混合物；醇包括甲醇、乙醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇和癸醇、以及异和其它支链脂肪酸或醇和醋酸；其它的碳源例如二氧化碳、酵母提取物、糖蜜、蛋白胨，和肉提取物、糖例如阿拉伯醣、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇和肌醇。
示例性氮源包括无机氮化合物例如氨、铵盐、硝酸盐，和/或有机含氮化合物例如尿素、玉米浆、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物和肉提取物。
示例性无机成分包括：钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐、钼盐、钴盐、镍盐、铬盐、硼化合物或碘化合物。
任选地，在培养基中可包括维生素。
细菌培养方法
本发明的营养素去调节的细菌甚至在不限制必需营养素的培养基中可达到良好的PHA产生水平。培养细菌的方法简单地包括使细菌在合适的培养基中生长。细菌甚至在繁殖时将产生显著水平的PHA。可利用促进细菌的增殖性生长的、在该领域已知的和/或本文所描述的任何培养基和合适的培养条件。
培养温度可依赖于生物体而改变。对于罗尔斯顿菌属，示例性培养温度的范围从约20至40℃，优选约25至35℃；而pH值为例如约6至10，优选约6.5至9.5。在这些条件下实行需氧培养。
使用允许迅速生长和产生PHA的丰富营养基，可设计能显著降低产生成本的连续发酵反应器。(见发酵技术原理(Principles ofFermentation Technology)，第二版，P.F.Stanbury，A.Whitaker和S.J.Hall，eds.，Butterworth-Heinemann出版社，1984年，第16-27页；Henderson等，Microbiology 143：2361-2371，1997年；Ackermann等，聚合物的降解和稳定性(Polymer Degradation and Stability)59：183-186，1998年。)
通过举例，一步培养法包括将细菌从一个发酵罐转移到另一个发酵罐(按比例放大)，以及分批发酵或培养基的连续进料。在其中限制一种或多种必需营养素的第二步培养的缺乏提供细菌的更快生长、PHA的更高产生，和在减少的成本下更有利的PHA的工业化产生方法。
两步培养
作为选择，可依照两步培养法来培养细菌，包括在例如美国专利第5,364,778号或美国专利第5,871,980号或美国专利第6,225,438号中所描述的常规方法。当不需要利用这样的两步培养法来培养本发明的细菌时，可依照这样的常规方法来培养本发明的细菌。
简言之，在第一阶段，在非生长限制条件下生长细菌，允许细菌繁殖直到它达到足够的生物量，通常用每公升的某个干细胞重量来衡量。在第二阶段，限制至少一种生长所需的营养素，因此增殖性生长停止，开始增加PHA的产生。当通过限制氧的供应可能提高PHA的产生时，限制的最实用的营养素为氮、磷或其次优选为镁、硫、钾或铁。
任何碳源均可用于任一阶段。在一些先前的工艺过程中，用于第一阶段的培养基包含易代谢的碳源例如碳水化合物例如葡萄糖，而用于第二阶段的培养基包含更复杂的碳源例如脂肪酸或脂肪醇。
在一些方法中，通过分离回收细菌细胞，通过常规的固-液分离方法例如过滤或离心，从在第一阶段获得的培养肉汤过滤，使如此获得的细胞在第二阶段培养。或者，在第一阶段的培养中，临界的营养素被充分地耗尽，培养肉汤可被移至第二阶段培养，而没有通过在那里培养的细胞的分离而回收。
在一个示例性方法中，最初将细菌置于含充分供应的所有营养素的培养基中，以允许增殖性生长。当细菌生长并消耗营养素时，至少一种必需营养素如无机元素的供给减少至引起停止增殖性生长和增加PHA的产生的限制性水平。如果含营养素的培养基再供给细菌，至少该必需营养素在这样的培养基中连续受到限制。
在备选的示例性方法中，连续供应或在不同的时间间隔供应培养基，供应的初始培养基包含不限制水平的营养素，在一段时间的充分的增殖性生长之后，在供应的培养基中限制至少一种必需营养素。
美国专利号6,225,438描述培养PHA产生细菌的另外的方法，因此细菌产生包含更高水平的中等链长单体(如具有大于5个碳的单体单位)的PHA共聚物，导致具有增加的弹性和处理能力的共聚体，在成型和卓越的模压期间减少热分解，优选具有熔点温度约30至150℃。方法包括在具有含6个或更多个碳的碳链的脂肪酸和/或脂肪醇和脂肪酸氧化抑制剂存在下培养细菌。用本发明的细菌可使用这样的方法。
在第二步培养期间，从培养的初始阶段到结束阶段的任何时间均可添加碳源和脂肪酸氧化抑制剂。优选在初始阶段添加。依照该方法合适的脂肪酸氧化抑制剂的实例包括但不限于：丙烯酸、2-丁酸、2-辛酸、S-苯丙酸、R-苯丙酸、丙炔酸和反式肉桂酸。抑制剂可为酸本身或其盐。丙烯酸钠为一种优选的脂肪酸氧化抑制剂。可使用一定量的脂肪酸氧化抑制剂，能按期望的量增加3-羟基己酸酯(HH)(C6)、3-羟基庚酸酯(HHp)(C7)和/或3-羟基辛酸酯(HO)(C8)共聚物的积聚，但对细胞具有可接受水平的毒性。例如，丙烯酸钠可以约1-40mM，优选约10-35mM和更优选25-32mM的浓度用于培养基中。
通过营养素限制增强PHA产生
本发明的细菌产生显著水平的PHA，而在培养期间基本上不需要限制任何必需营养素。然而，通过限制营养素例如限制磷、氮、镁、硫酸盐、钾或铁，可达到甚至更高水平的PHA产生。优选，受限制的营养素为细菌未去调节的营养素。例如，通过限制磷酸，没有提高本文所述的一个磷酸去调节的生物体的PHA产生，但通过限制铁提高了该生物体的PHA产生。通过限制铁和其它无机元素的各种组合，可使PHA的产生最大化。
在一个实施方案中，限制培养基中的铁浓度，因此磷酸对铁的比率为约50或更高，或约350或更高，或约500或更高，或约2,800或更低，或约1,400或更低，或约900或更低。示例性范围包括从约58至约2,773，或约350至约1,400，或约500-900，或约600-800如693。
PHA共聚物的提取
可由在该领域中已知的任何方法，包括但不限于常规的固-液分离法如过滤法或离心法，从培养肉汤中收获细菌。
可由在该领域中已知的任何方法，包括以下的示例性方法，从细菌中提取PHA共聚物。
从培养肉汤中收获细菌细胞，用O.1M NaCl、50mM Tris-HCl、pH8.0将细胞清洗一次，悬浮于水中，然后冻干。通过在约50∶1的氯仿对细胞干重中，回流至少约5小时，将PHA共聚物萃取入氯仿中。将萃取液通过过Whatman#4过滤纸过滤，干燥至最小体积，通过添加粘性溶液至10倍体积的二乙醚/己烷3/1v/v，使PHA共聚物沉淀。在加盖的特氟纶离心管中离心这些物质，在整夜真空干燥之前用乙醚/己烷洗涤一次。通过乙醚/己烷沉淀的固体PHA共聚物在沸腾的丙酮中回流5小时，施行PHA共聚物的进一步分馏。在氮气下干燥丙酮萃取物，将PHA共聚物溶于氯仿中，用乙醚/己烷沉淀该共聚物。或者，用丙酮直接萃取干燥的细胞，通过在氮气下干燥、溶于氯仿中、用乙醚/己烷沉淀，分离可溶的PHA共聚物。
此外，可用各种已公布的方法从细菌中回收共聚物产物，以产生各种有用的物理形态的PHA共聚物。这些包括使用氯化溶剂(例如美国专利号4,562,245)、非氯化溶剂(国际公布号97/07230)、边缘溶剂(美国专利号5,821,299)的化学萃取法、热的使用和分离PHA微粒的酶、在美国专利号4,910,145中所述的实例，或物理方法如风选法(airclassification)(美国专利号5,849,854)和离心法(美国专利号5,899,339)的使用。
PHA产生的定量或对比评价
将收获的细胞干燥、称重，使用所述的氯化溶剂萃取PHA。在整夜真空下将提取的PHA干燥，称重以获得在干燥的生物量中的PHA百分比和在发酵肉汤中的滴定量。或者，通过气相色谱(GC)对PHA进行定量和定性分析。培养液在10,000g下离心15分钟，然后在0.9％氯化钠溶液中洗涤细胞两次，冻干过夜。在存在15％(v/v)硫酸时使冻干的细胞材料(8-10mg)经过甲醇分解。依照Brandl等(Appl.Environ.Microbiol.54：1977，1988)和如(Timm等，Appl.Environ.Microbiol.56：3360，1990)所详述的，用GC对产生的成分3-羟基链烷酸的甲酯进行分析。通过将3L的样品注入使用0.5m直径60m长的Permphase PEG 25Mx毛细管柱的Agilent Technologies 6850型气相色谱仪(Waldbronn，Germany)，进行GC分析。
产生的PHA的用途
本发明也提供由本发明的细菌产生的PHA。这样的PHA可转变成光纤、模制品和薄膜，用于在该领域中已知的PHA或其它塑料的任何应用，包括医学材料如外科线或骨骼安置材料、卫生制品如尿布或清洁用品、农业或园艺材料如多层薄膜、缓释化学制品，或渔业材料如渔网，和/或包装材料如瓶子、快餐包装和盒子。
实施例
参考以下的非限制性实施例，更详细地描述本发明，提供该实施例以更充分地举例说明本发明，但该实施例不解释为限制其范围。实施例举例说明营养素去调节的真养罗尔斯顿菌的分离、用于产生PHA的所述去调节的真养罗尔斯顿菌的发酵过程，和通过限制微量元素修饰PHA的产生。
实施例1
磷酸去调节的真养罗尔斯顿菌的分离
按以下分离磷酸去调节的真养罗尔斯顿菌。真养罗尔斯顿菌的PHA阴性突变株在含酵母提取物(10mL，3％)的100ml摇瓶中培养16-20小时，转速200rpm，温度30℃，直到OD600超过10。将培养物(3mL)转移入27mL的无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中。移除5mL的稀释细胞以便制平板，作为未突变的对照，暴露残留的悬浮液(25mL)，在暗处连续搅拌，经过充分的紫外照射，得到1％和10％之间的存活率。将已照射的培养基的1mL等分试样转移至在100mL摇瓶中的11mL预热的富含营养素的培养基(1％w/v胰蛋白胨、1％w/v酵母提取物、0.5％w/v牛肉提取物、0.5％w/v硫酸铵、pH7)中。用铝箔包装烧瓶，以最小化光修复(photorepair)，在暗处振荡3小时，转速200rpm，温度30℃，以使细胞分离和突变体“固定”。在含比色的碱性磷酸酯酶底物、BCIP(40g/ml)的LB琼脂(1％w/v胰蛋白胨，0.5％w/v酵母提取物，0.5％w/v氯化钠，pH 7)上培养分离的细胞，和在30℃培育细胞2到3天。强烈地暗蓝色群体被分离，为真养罗尔斯顿菌的假定的磷酸去调节的菌株。示例性磷酸去调节的真养罗尔斯顿菌为保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box 1549 Manassas，VA 20108，USA的那些细菌，保藏号为PTA-6759。
实施例2
氮去调节的真养罗尔斯顿菌的分离
按以下分离氮去调节的真养罗尔斯顿菌。真养罗尔斯顿菌的PHA阴性突变株在含酵母抽提物(10mL，3％)的100ml摇瓶中培养16-20小时，转速200rpm，温度30℃，直至OD600超过10。将培养物(3mL)转移至27mL的无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中。移除5mL的稀释细胞以便制平板，作为未突变的对照，暴露残留的悬浮液(25mL)，在暗处连续搅拌，经过充分的紫外照射，得到在1％和10％之间的存活率。将已照射的培养基的1mL等分试样转移至在100mL摇瓶中的11mL预热的富含营养素的培养基(1％w/v胰蛋白胨、1％w/v酵母提取物、0.5％w/v牛肉提取物、0.5％w/v硫酸铵、pH7)中。用铝箔包装烧瓶，以最小化光修复，在暗处振荡3小时，转速200rpm，温度30℃，以使细胞分离和突变体“固定”。在含200mM的铵类似物甲胺和复合氮源例如0.1％w/v甘氨酸的最少量的琼脂上培养分离的细胞，在30℃时培育至少3天。分离看来生长良好的菌落，作为假定的氮去调节的菌种。
实施例3
双去调节的(既磷酸去调节的又氮去调节的)真养罗尔斯顿菌的分离
按以下分离磷酸和氮均去调节的真养罗尔斯顿菌。来自实施例1的真养罗尔斯顿菌DSM541的磷酸去调节的突变体在含10mL 3％酵母抽提物的100ml摇瓶中培养16-20小时，转速200rpm，温度30℃，直至OD600超过10。将3mL的培养物转移至27mL的无菌磷酸缓冲盐水中。移除5mL的稀释细胞以便制平板，作为未突变的对照，暴露残留的悬浮液(25mL)，在暗处连续搅拌，经过充分的紫外照射，得到的存活率在1％和10％之间。将已照射的培养基的1mL等分试样转移至在100mL摇瓶中的11mL预热的富含营养素的培养基(1％w/v胰蛋白胨、1％w/v酵母提取物、0.5％w/v牛肉提取物、0.5％w/v硫酸铵、pH7)中。用铝箔包装烧瓶，以最小化光修复，在暗处振荡3小时，转速200rpm，温度30℃，以使细胞分离和突变体“固定”。在含200mM的铵类似物甲胺和复合氮源例如0.1％w/v甘氨酸的最少量的琼脂上培养分离的细胞，在30℃时培育至少3天。分离看来生长良好的菌落，作为假定的双去调节的(磷酸和氮均去调节的)菌株。示例性的磷酸和氮调节的真养罗尔斯顿菌为于2005年6月1号为保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box 1549 Manassas，VA 20108，USA的那些细菌，保藏号为PTA-6760。
实施例4
具有PHA基因的解除营养素调节的真养罗尔斯顿菌的转化
例如，通过用质粒pJRDEE32d13表达来自豚鼠气单胞菌的野生型phaC基因来转化(Fukui等，J.Bacteriol 179：4821-4830，1997；和美国专利第5,981,257号)，用各种产生PHA的基因转化营养素去调节的真养罗尔斯顿菌细胞，以使PHA能够产生。在该领域中已知各种转化方法，例如Park等(Biotechnology Techniques 9：31-34，1995)所述的电穿孔法或用Friedrich等(J.Bacteriology 147：198-205，1981)所述的E.coli S 17-1的直接转运结合(transconjugation)。
然后在含不限制浓度的去调节的营养素例如磷(或双去调节的营养素例如磷和氮)的培养基中使细菌生长，然后按以下陈述测量PHA的积聚。
实施例5
PHA积聚的测量
离心细菌，用0.1M NaCl、50mM Tris 8.0洗涤一次，离心，悬浮于2-3mL的水中，冷冻和冻干2天。使干燥的细胞在1mL氯仿加1mL15％硫酸的甲醇溶液中在100℃反应4小时。添加1mL的氯仿加1mL的1M NaCl使样品相分离。用无水硫酸钠处理氯仿相至干燥，取出1mL，在氮气下或通宵加罩在样品瓶中干燥。将样品溶于1mL的丙酮加1g/L苯甲酸甲酯中并加盖。或者，将100μL的10g/L苯甲酸甲酯直接加入1mL的氯仿中；然后加盖和分析样品。
使用30m长，0.32mm ID，0.25μm膜厚的Supelcowax10柱，使用氦气，以1cm3/秒的流速等于20cm/秒的线流速，在HP5890GC上分析样品。注射器温度设置在225℃，FID检测器温度设置在300℃。在1μL注射(50∶1分流)之后炉箱温度保持在80℃维持2分钟，以10℃/min升温至230℃，在230℃保持12分钟。或者，使用和以上相同的程序，但最终温度在230℃保持7分钟，在J&W DB-5MS(零件122-5531，30m长，0.25mm直径，0.1um膜厚)上分析样品。
3-羟基链烷酸和3-羟基链烷酸甲酯，用作标准物，购自Sigma(目录#H6501 dl-β-羟基丁酸，目录#H40233-羟基羊脂酸甲酯，目录#H37733-羟基癸酸甲酯，目录#H35233-羟基月桂酸甲酯，目录#H42733-羟基豆蔻酸甲酯，目录#H45233-羟基棕榈酸甲酯)，从在月桂酸上生长的嗜水气单胞菌处理的PHA共聚物鉴别3-羟基己酸甲酯。
实施例6
用于产生聚-3-羟基链烷酸(PHA)的磷酸去调节的真养罗尔斯顿菌的发酵
使用植物油、脂肪酸、脂肪醇和酯作为给料底物，实施被设计能够产生羟基丁酸酯与羟基己酸酯共聚物的重组的磷酸去调节的真养罗尔斯顿菌的分批给料培养物。植物油包括：玉米油、豆油、棕榈油、棕榈仁油、棉籽油、菜籽油、花生油、它们的分馏油、它们的混合油。分批给料培养物也可制备PHA利用的碳水化合物养料，包括果糖、葡糖酸、葡萄糖和糖蜜，一些养料需要选择菌株在特殊养料上生长。
首先在30℃在100mL的营养肉汤中使该菌株生长至OD600为2.0。然后使用该肉汤接种，并使用以下培养基在3L的种子培养发酵罐中生长：
菌种发酵：
Na2HPO4                   11.0g/L
KH2PO4                    1.90g/L
(NH4)2SO4                 12.87g/L
MgSO4.7H2O(20g/100ml)     5ml/L
微量元素                  5mL/L
CoCl2.6H2O                0.218g
FeCl3.6H2O                16.2g
CaCl2.2H2O                10.3g
NiCl2.6H2O                0.118g
CuSO4.5H2O                0.156g
用0.1N HCl稀释至1L
在121℃保持20min将培养基灭菌；冷却，并添加30g/L植物油和50mg/L卡那霉素。
操作条件：
温度                      30℃
初始pH                    6.8
pH控制点                  用7％NH4OH调至6.8
通风                      0.6vvm
搅拌                      500rpm
当OD600＝69.9时，收获培养物。使用175mL的培养物接种至主发酵罐中达3.5L。使用Nova Biomedical 300 Bioprofile Analyzer测量培养基中的磷酸浓度，显示从未被限制。
Na2HPO4                   4.36g/L
KH2PO4                    1.90g/L
(NH4)2SO4                 2.91g/L
消泡剂                    3ml/L
MgSO4.7H2O(20g/100mL)     5mL/L
微量元素                  5mL/L
操作条件：
温度                      28℃
初始pH                          6.8
pH控制点                        用14％NH4OH调至6.8
通风                            0.6vvm
搅拌                            400rpm
背压                            1-2psi
用总共110g/L植物油进料：
时间
0h                              0.56ml/L
2h                              0.92
4h                              1.28
6h                              1.67
8h                              2.02
10h                             2.37
12-60h                          2.67
菌种也在限制磷酸的培养基中生长，在该培养基中在培养期间，通常在20h和36h培养时间之间，添加的磷的完全利用诱导野生型菌株以增加PHA的产生。
限制磷酸的培养基：
Na2HPO4                         3.85g/L
KH2PO4                          0.67g/L
(NH4)2SO4                       2.91g/L
消泡剂                          3mL/L
MgSO4.7H2O(20g/100ml)           5mL/L
微量元素                        5mL/L
种子发酵罐的5％v/v的接种
操作条件：
温度                            30-34℃持续16h，然后28℃
初始pH                          6.8
pH控制点                        用14％NH4OH调至6.8
通风                            0.6vvm
搅拌                            400rpm
背压                          1-2psi
用总共110g/L植物油进料：
时间
0h                            0.56ml/L
2h                            0.92
4h                            1.28
6h                            1.67
8h                            2.02
10h                           2.37
12-60h                        2.67
更丰富的培养基允许细胞在最短的滞后时间内生长。在更高磷酸浓度的细胞生长基本上是为了在细胞生长的所有时间产生PHA和积聚PHA。在更高磷酸浓度的细胞生长产生的PHA为由限制磷酸时的细胞生长产生的PHA的量的165％。通过对比，具有非去调节背景的产生PHA的真养罗尔斯顿菌在高磷酸的培养基中产生的PHA仅为在限制磷酸的培养基中产生的PHA的55％。
这是第一次证明在真养罗尔斯顿菌的活性生长期(对数期)显著水平的基本PHA产生，不管存在磷酸的不限制性浓度，均导致在更早的时间点接近PHA的最大掺入。
实施例7
用于产生PHA的氮去调节的、双去调节的，和其它营养素去调节的真养罗尔斯顿菌的发酵
真养罗尔斯顿菌的氮去调节的菌株、双去调节的菌株(磷酸和氮均去调节)，和其它营养素去调节的菌株在实施例6所述的不限制性营养肉汤中生长，以比天然的真养罗尔斯顿菌产生更高的浓度PHA。
实施例8
用于产生PHA的在丰富培养基中的营养素去调节的真养罗尔斯顿菌的发酵
营养素去调节的菌株不需要通过限制营养素的诱导来产生大量的PHA。因此，当保持高PHA产生，因此在给定的培养容器中增加PHA的总滴定量时，可添加丰富营养源的复合培养基以增加生物总量的产生。丰富的培养基可包括酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸、牛肉提取物和其它的有机氮源、磷酸和其它营养素。
实施例9
用于产生PHA的在更丰富的廉价培养基中的营养素去调节的真养罗尔斯顿菌的发酵
营养素去调节的菌株不需要通过限制营养物而诱导，以产生大量的PHA；然而，添加昂贵的丰富的培养基源还不经济。营养素可由更经济的供应品来补给，通过供给例如磷酸、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、玉米浆、大豆水解物、粗甘油、乳清、工业用油、醣类或蛋白质废液，或其它更便宜的简单的或复合的培养基，不用考虑由于过度供给关键营养而抑制PHA的产生。
实施例10
通过限制微量元素在营养素去调节的真养罗尔斯顿菌中的高水平PHA产生的诱导
真养罗尔斯顿菌的磷酸去调节和氮去调节的菌株分别在不限制磷酸和不限制氮的培养基中为PHA的基本产生者。当给予植物油时，通过限制培养基中的微量元素，增加PHA的产生。
磷酸去调节的或磷酸和氮军区调节的真养罗尔斯顿菌，和能够产生羟基丁酸酯与羟基己酸酯共聚物(C4C6)的真养罗尔斯顿菌在包含以下成分的培养基中生长：
Na2HPO4                  7.70g/L
KH2PO4                   1.34g/L
(NH4)2SO4                2.91g/L
MgSO4.7H2O(20g/100mL)    5mL/L
需要时加入消泡剂
微量元素                  0-1mL/L
CoCl2.6H2O                0.218g
FeCl3.6H2O                16.2g
CaCl2.2H2O                10.3g
NiCl2.6H2O                0.118g
CuSO4.5H2O                0.156g
用0.1N HCl稀释到1L
用植物油分批给予细菌。典型水平为5mL/L微量元素、3.85g/LNa2HPO4和0.67g/L KH2PO4。
发现了PHA水平超过85％重量的细胞。作为对照，磷酸去调节的细胞在限制磷酸的培养基中积聚了35％PHA，在不限制性培养基中积聚了49％PHA。未去调节的细胞在不限制性培养基中不积聚PHA，在限制微量元素的培养基中仅积聚1.9％PHA。
另外，对于表达来自豚鼠气单胞菌(Fukui等，J.Bacteriol.179：4821-4830，1997；和美国专利第5,981,257号)的野生型phaC基因(pJRDEE32d13)的磷酸去调节的突变体，在同样量的生物量中，在限制磷酸的条件下，与35％PHA的PHA产生相比，在培养基中限制80％的微量元素改善74％PHA的PHA产生。
使用其中加入2X磷酸的对照培养基和其中调节微量元素的量的测试培养基，在3.5L初始体积中使用含豚鼠气单胞菌phaC基因的质粒转化的真养罗尔斯顿菌(在实施例1中所述)发酵。给予细菌玉米油，用氢氧化铵中和酸。与对照培养基相比，限制测试培养基中的微量元素导致细胞的PHA含量加倍。在对照培养基中限制微量元素的量至20％的量，足以支持细胞生长等同于在对照培养基上生长，与此同时还提供细胞的增加的PHA含量。
下面的表1显示限制微量元素对磷酸去调节的细胞生长和PHA积聚的效果与微量元素之间的关系。当在限制磷酸的条件下培养时，细胞包含35％重量的PHA(每个细胞干重(DCW)的PHA重量)，具有0.51gPHA/L/h的产率，产生39.3g/L的PHA。严格地限制微量元素在90％或更多，当供应过量的磷酸时，能使每个细胞的PHA高积聚，但限制细胞生长和PHA产生。耗尽80％的微量元素使得细胞完全生长和84.1g/L的PHA产生(73.6％重量的PHA和1.17gPHA/L/h的产率)。
Figure A20068004129700261
实施例11
通过限制铁在营养素去调节的真养罗尔斯顿菌中的修饰的PHA产生
在微量元素的变化量的进一步测试中，含20％铁的培养基存在于对照培养基中，但全量的其它微量元素产生同样的结果。这些结果显示铁的限制提供增加PHA产生的预期效果。
下面陈述表明增加的PHA积聚的用于培养的示例性磷酸对铁的比率(摩尔浓度/摩尔浓度)。表明修饰的PHA积聚的发酵培养基包含磷酸(41.6mM)和铁(0.06mM)，其比率为693∶1。也可能减少一半的铁浓度或加倍磷酸至1，387∶1的比率。磷酸对铁的比率可从约58∶1至约2773∶1变化。磷对铁的示例性比率不受限制。在该领域中的一项技术可测定这样的比率。
贯穿该申请，引用了各种出版物。全部这些出版物的公开，包括但不限于本文引用的公开的特定方面，通过引用结合到该申请中，以便更充分地描述技术人员已知的该领域的状况，在这里作为本文描述的和要求保护的发明日期。
本专利文件的公告包含受版权保护的材料。版权拥有者不反对专利文件或专利公告中的任一项的传真复制，当它出现在专利与商标局的专利文件或记录中时，但无论如何另外保留所有的版权。
已举例说明和描述本发明的详细实施方案，其对本领域的那些技术人员是显而易见的：在不偏离本发明的精神和范围时，可做各种其它的改变和修饰。因此，在附加的权利要求中有意覆盖在本发明范围内的所有这样的改变和修饰。

Claims (20)

1.分离的营养素去调节的细菌，所述细菌能够(a)在不限制营养素水平的培养条件下，以细胞干重计，产生至少10％的聚羟基链烷酸(PHA)，和(b)在限制铁但不显著限制其它营养素的培养条件下，以细胞干重计，产生至少20％的PHA，其中所述细菌不包括广泛产碱菌(Alcaligenes latus)和具有NADH氧化酶突变的维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)突变体。
2.分离的细菌，所述细菌显示以ATCC保藏号PTA-6759保藏的细菌的所有鉴别特征。
3.分离的细菌，所述细菌显示以ATCC保藏号PTA-6760保藏的细菌的所有鉴别特征。
4.权利要求1的细菌，所述细菌为沃特氏菌属(Wautersia)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、芽胞杆菌属(Bacillus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、气单胞菌属(Aeromonas)或假单胞菌属(Pseudomonas)菌种。
5.权利要求1的细菌，所述细菌为磷酸去调节的沃特氏菌属菌种。
6.权利要求2的细菌，所述细菌为磷酸去调节的沃特氏菌属菌种。
7.权利要求1的细菌，所述细菌为磷酸去调节的和氮去调节的细菌。
8.权利要求2的细菌，所述细菌为磷酸去调节的和氮去调节的细菌。
9.权利要求1的细菌，所述细菌包含非天然的产生PHA的基因。
10.权利要求2的细菌，所述细菌包含非天然的产生PHA的基因。
11.权利要求3的细菌，所述细菌包含非天然的产生PHA的基因。
12.权利要求9的细菌，其中所述产生PHA的基因选自phaA、phaB或phaC基因。
13.一种产生PHA的方法，所述方法使用的细菌能够(a)在不限制营养素水平的培养条件下，以细胞干重计，产生至少10％的聚羟基链烷酸(PHA)，和(b)在限制铁但不显著限制其它营养素的培养条件下，以细胞干重计，产生至少20％的PHA，其中所述细菌不包括广泛产碱菌和具有NADH氧化酶突变的维涅兰德固氮菌突变体，所述方法包括所述细菌在培养基中生长的步骤，以使所述细菌产生PHA。
14.一种产生PHA的方法，所述方法使用的细菌显示以ATCC保藏号PTA-6759保藏的细菌的所有鉴别特征，所述方法包括所述细菌在培养基中生长的步骤，以使所述细菌产生PHA。
15.一种产生PHA的方法，所述方法使用的细菌显示以ATCC保藏号PTA-6760保藏的细菌的所有鉴别特征，所述方法包括所述细菌在培养基中生长的步骤，以使所述细菌产生PHA。
16.权利要求13的方法，其中所述细菌在不限制必需营养素的培养基中培养。
17.权利要求16的方法，所述方法还包括在限制一种或多种无机元素的培养基中培养所述细菌的步骤。
18.权利要求17的方法，其中所述受限制的元素为铁。
19.权利要求13的方法，其中所述培养基包含植物油。
20.权利要求14的方法，其中所述培养基包含植物油。
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