KR20080053368A - 폴리히드록시알카노에이트 생산이 개선된 탈조절 박테리아 - Google Patents

폴리히드록시알카노에이트 생산이 개선된 탈조절 박테리아 Download PDF

Info

Publication number
KR20080053368A
KR20080053368A KR1020087008454A KR20087008454A KR20080053368A KR 20080053368 A KR20080053368 A KR 20080053368A KR 1020087008454 A KR1020087008454 A KR 1020087008454A KR 20087008454 A KR20087008454 A KR 20087008454A KR 20080053368 A KR20080053368 A KR 20080053368A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pha
bacteria
bacterium
deregulated
phosphate
Prior art date
Application number
KR1020087008454A
Other languages
English (en)
Inventor
필립 리처드 그린
로버트 이안 존슨
스튜어트 안토니 던
Original Assignee
메레디언, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메레디언, 인크. filed Critical 메레디언, 인크.
Publication of KR20080053368A publication Critical patent/KR20080053368A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Abstract

본 발명은 폴리-3-히드록시알카노에이트 (PHA)-생산 특징이 개선된 돌연변이체 박테리아, 및 이것을 생산하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
폴리-3-히드록시알카노에이트, 포스페이트-탈조절 박테리아, 질소-탈조절 박테리아

Description

폴리히드록시알카노에이트 생산이 개선된 탈조절 박테리아 {DEREGULATED BACTERIA WITH IMPROVED POLYHYDROXYALKANOATE PRODUCTION}
본 발명은 증가된 수준의 폴리히드록시알카노에이트 (PHA) 생체중합체를 구성적으로 생산하는 돌연변이 미생물에 관한 것이다.
에너지 저장 화합물로서 히드록시알칸산의 중합체 (폴리히드록시알카노에이트, PHA)를 합성하고 축적하는 다수의 미생물의 능력이 오랫동안 인지되어 왔다. 이러한 계열 화합물로 가장 흔하게 발견되는 화합물은 폴리(D(-)-3-히드록시부티레이트) (PHB)이다. 그러나, 일부 미생물 종은, 히드록시부티레이트 외에 보다 긴 사슬의 히드록시알카노에이트를 함유할 수 있는 공중합체를 축적한다. 이러한 PHA에 관심의 초점을 두어왔는데, 이는 이러한 생체중합체가 생체적합성이고, 생체분해성이며, 석유-화학에 기초한 중합체 (예컨대, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌)의 특성과 유사한 물리적 특성을 나타내는 열가소성 물질이기 때문이다.
PHA를 생산하는 하나의 예시적인 박테리아인 와우테르시아 유트로파(Wautersia eutropha) (랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 또는 알칼리게네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus)로도 공지됨)는 포스페이트 또는 질소와 같은 중요한 영양소의 제한에 대한 반응으로 발효 동안 PHA를 축적한다. PHA는 두 단계의 박테리아 발효에 의해 전형적으로 생성된다. 제1 단계에서, 박테리아가 배수적으로 증식하도록 완전한 공급량의 영양소를 함유하는 배지에서 박테리아를 배양한다. 박테리아가 충분한 바이오매스(biomass) (보통 리터 당 건조 세포 중량으로 측정함)에 이를 때까지 증식시킨다. 제2 단계에서, 증식을 위해 요구되는 영양소 (예를 들어, 질소 또는 인) 1종 이상의 이용도를 제한하는데, 이는 세포 분열을 제한하고, PHA 생산을 유도하는 효과를 갖는다. 영양소 제한이 PHA의 축적을 유도하는 제2 단계까지는 유의한 PHA 생산이 일어나지 않는다.
대부분의 PHA-생산 유기체는 비-제한적 증식 조건 하에 유의한 수준의 PHA를 생산하지 않는다. 예를 들어, 와우테르시아 유트로파 (랄스토니아 유트로파)는 영양소가 제한되지 않는 조건 하에 배양되는 경우, 건조 세포 중량의 ％로서 단지 3％의 PHA를 생성하는 것으로 보고되었다 (Repaske et al., Appl Environ Microbiol. 32: 585- 591, 1976).
비-제한적 수준의 영양소의 존재 하에 유의한 수준의 PHA를 생산하는 변형된 박테리아에 대한 요구가 존재한다.
<발명의 요약>
본 발명은 배수적 증식을 가능하게 하는 충분한 양의 영양소를 함유하는 배지의 존재 하에, 변형되지 않은 박테리아와 비교하여 놀라운 양의 PHA를 생산하는, 단리된 영양소-탈조절된 변형 박테리아를 제공한다. 이러한 박테리아는 비-제한적 수준의 중요한 영양소 (예컨대, 질소, 인, 마그네슘, 술페이트 및 칼륨)의 존재 하에 유의한 수준의 PHA를 생산한다.
본 발명의 단리된 신규 박테리아는, (a) 영양소의 수준이 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 10％ 이상의 폴리히드록시알카노에이트 (PHA)를 생산하고, (b) 철이 제한되지만 다른 영양소는 유의하게 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 20％ 이상의 PHA를 생산할 수 있다. 본 발명은 임의로, 영양소의 수준이 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 약 50％ 이상의 PHA를 생산하고, 철이 제한되지만 다른 영양소는 유의하게 제한되지 않는 배양 조건 하에 약 10％ 이상의 PHA 생산 증가를 나타내는, 당업계에 앞서 공지된 단리된 박테리아를 제외한다.
예시적인 박테리아는 랄스토니아 종, 알칼리게네스 종, 와우테르시아 종, 조오글로에아(Zoogloea) 종, 바실러스(Bacillus) 종, 아에로모나스(Aeromonas) 종, 아조토박터(Azotobacter) 종, 클로스트리둠(Clostridum) 종, 노카르디아(Nocardia) 종, 할로박테리움(Halobacterium) 종 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 본 발명의 박테리아에서, 영양소의 수준이 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 50％ 이상의 PHA를 생산하는 것으로 알려진 박테리아, 예컨대 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus) 및 아조토박터 빈란디(Azotobacter vinlandii) 돌연변이체 (NADH 산화효소의 돌연변이)는 제외된다. 알칼리게네스 라투스는 세포 중량의 대략 88.3％의 PHB를 생산하고 (Lee et al., Polym. Degradation Stab. 59: 387-393, 1998), 아조토박터 빈란디는 세포 중량의 대략 94％의 PHA를 생산한다 (Page et al., Can. J. Microbiol. 41: 106-114, 1995).
이러한 변형된 박테리아는 1종의 영양소에 대해 탈조절되거나 (예를 들어, 포스페이트-탈조절되거나, 질소-탈조절됨), 또는 2종 이상의 영양소에 대해 탈조절될 수 있다 (예를 들어, 포스페이트와 질소 둘 모두에 대해 탈조절됨). 바람직하게는, 상기 박테리아는 영양소-탈조절된 PHA-생산 유기체이거나, 비-천연 PHA-생산 유전자 (예를 들어, phaC, phaA 및/또는 phaB)를 함유하도록 추가로 조작된 PHA-음성 돌연변이체이다.
예시적인 박테리아는 2005년 6월 1일에 각각 기탁 번호 PTA-6759 및 PTA-6760으로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20108 버지니아주 마나사스 피.오. 박스 1549)에 기탁된 것이다.
또한, 본 발명은 ATCC 기탁 번호 PTA-6759 하에 기탁된 박테리아 또는 ATCC 기탁 번호 PTA-6760 하에 기탁된 박테리아의 식별 특징을 모두 나타내는 단리된 박테리아를 제공한다. 이러한 박테리아의 예시적인 실시양태는 기탁된 박테리아의 자손이거나, 기탁된 박테리아의 식별 특징을 보유하는 기탁된 박테리아의 돌연변이체 (즉, 영양소의 수준이 제한되지 않는 배양 조건 하에 변형되지 않은 유기체에 비해 PHA 생산이 증가되도록 하는 동일하거나 유사한 돌연변이를 보유함)이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단리된 박테리아를 함유하는 배양물과 배양 배지를 제공한다. 추가로, 본 발명은 본원에 기재된, 임의의 본 발명의 박테리아를 이용하여 PHA를 생산하는 방법을 제공한다. 그러한 생산 방법은 박테리아가 PHA를 생산하도록 적합한 배양 배지에서 박테리아를 증식시키는 단계를 포함한다. 임의의 추가 단계에는 박테리아를 수확하고/거나 박테리아로부터 PHA를 추출하는 단계 가 포함된다. 별법으로, PHA가 배양 배지로 분비되는 경우, 상기 방법은 박테리아를 적합한 배양 배지에서 증식시키고, 배양 배지로부터 PHA를 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
유기체가 증식하거나 PHA를 생산하도록 충분한 영양소를 공급하는 한, 당업계에 공지된 임의의 배양 배지 및 배양 방법을 사용할 수 있다. 따라서, 한 국면에서, 본 발명은 필수 영양소가 제한되지 않은 배지 (즉, 영양소는, 영양소가 배수적 증식을 정지시키는 양으로 결코 제한되지 않는 농도로 존재함)에서 상기 박테리아를 배양하는 방법을 제공한다. 예로써, 배양 과정에는 박테리아를 한 발효기에서 다른 발효기로 옮기는 것 (규모 확대)과, 회분식(batchwise) 공급 또는 연속식 공급이 포함된다 (단, 배양 배지 내 영양소가, 유의하게 배수적 증식을 억제하는 농도로 제한되지 않음).
또다른 국면에서, 본 발명은 두-단계 배양 방법에 따라 본 발명의 박테리아를 배양하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 박테리아는 1종 이상의 필수 영양소 (예를 들어, 무기 원소)가 제한된 배양 배지에서 배양되는 제2 단계를 거친다.
또한, 본 발명은 박테리아의 탈조절 대상이 아닌 미량 원소를 제한함으로써 PHA를 생산하는 개선된 방법을 제공한다. 예를 들어, 충분한 배수적 증식 기간 후에, 인이 아닌 원소 (예를 들어, 마그네슘, 술페이트 또는 철), 바람직하게는 철을 제한된 수준으로 함유하는 배양 배지에서 포스페이트-탈조절 박테리아를 증식시켜 PHA의 증가된 생산을 달성할 수 있다.
C4 및 중간 사슬 길이 단량체 (예를 들어, 5개 초과의 탄소를 갖는 단량체 단위)로 구성된 PHA 공중합체를 생산하는 방법이 제공된다. 예시적인 공중합체에는 C6, C7, C8, C10, C12, C14, C16 및 C18 공중합체, 예를 들어 3-히드록시헥사노에이트 (HH) (C6), 3-히드록시헵타노에이트 (HHp) (C7) 및/또는 3-히드록시옥타노에이트 (HO) (C8)를 함유하는 공중합체, 구체적으로 C4 및 C6 (특히, 3-히드록시부티레이트 및 3-히드록시헥사노에이트 또는 상응하는 산)을 함유하는 공중합체, 예를 들어 폴리히드록시부티레이트-코-헥사노에이트 (C4-C6), 가장 구체적으로 80 내지 98 몰％ C4 및 2 내지 20 몰％ C6의 공중합체가 포함된다. 추가적인 공중합체 및 적합한 배지는 미국 특허 제6,225,438호에 기재되어 있다.
본 발명은, 배수적 증식을 가능하게 하는 충분한 양의 영양소를 함유하는 배지의 존재 하에, 변형되지 않은 박테리아에 비해 놀라운 양의 PHA를 생산하는, 단리된 "영양소-탈조절" 변형 박테리아를 제공한다. 이러한 변형된 박테리아는 1종의 영양소에 대해 탈조절되거나 (예를 들어, 포스페이트-탈조절되거나 질소-탈조절됨), 2종 이상의 영양소에 대해 탈조절될 수 있다 (예를 들어, 포스페이트와 질소 둘 모두에 대해 탈조절됨). 다른 예시적인 변형 박테리아에는 마그네슘-탈조절, 술페이트-탈조절, 칼륨-탈조절 또는 철-탈조절 유기체가 포함된다.
예시적인 실시양태에서, 본 발명의 박테리아는 (a) 영양소의 수준이 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 10％, 20％, 25％ 또는 30％, 또는 그 이상의 PHA를 생산하고, (b) 철이 제한되지만 다른 영양소는 유의하게 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 65％, 70％, 75％ 또는 80％, 또는 그 이상의 PHA를 생산할 수 있다. 이러한 박테리아에는 PHA를 생산하는 것으로 당업계에 공지된 임의의 박테리아가 포함되지만, 구체적으로 영양소의 수준이 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 약 50％ 초과의 PHA를 생산하는 것으로 공지된 박테리아 (예컨대, 알칼리게네스 라투스 및 아조토박터 빈란디 돌연변이체 (NADH 산화효소의 돌연변이)가 제외되며, 이들 박테리아 각각은 세포 중량의 90％ 초과의 수준으로 PHB를 축적한다.
포스페이트 탈조절 박테리아에서 PHA를 생산시킴으로써, 중요한 영양소의 제한이 없는 풍부 배지의 존재 하에서도 구성적으로 PHA 생산이 일어난다. 발효 동안에 풍부 배지 또는 보다 풍부한 저가 배지를 이용할 수 있으면, 박테리아가 더 빨리 증식하도록 하고, PHA를 더 많이 생산하도록 하며, 감소된 비용으로 산업적으로 보다 확실한 PHA 생산 공정이 가능하다 (실시예 8 및 9 참조). 또한, 1종 이상의 영양소를 제한할 필요가 없어지면 연속식 발효가 가능하다 (즉, 2-단계 배양법이 필요치 않음).
본원에 사용된 "단리된 박테리아"는 그것의 천연 환경 구성 성분으로부터 동정되고 분리된, 단일 박테리아주의 집단을 지칭한다. 예를 들어, 인공 배양 배지를 함유하는 배양 조성물의 부분인 박테리아는 단리된 것으로 간주된다.
본원에 사용된 "비-제한적 수준의 영양소를 함유하는 배양 배지" 또는 "영양소의 수준이 제한되지 않는 배양 배지"는 박테리아가 빠르게 증식하도록 모든 영양소를 충분한 공급량으로 함유하는 배양 배지를 지칭한다. 유사하게, "비-제한적 수준의 영양소"는 빠른 배수적 증식을 지속시키기에 충분한 농도의 배양 배지 내의 영양소를 지칭한다. 대조적으로, "영양소가 제한된 배양 배지"는 박테리아의 배수적 증식이 본질적으로 정지하도록 하는 농도로 영양소의 수준이 감소된 배양 배지를 지칭하고, "제한적 수준의 영양소"는 박테리아의 배수적 증식이 본질적으로 정지하도록 하는 농도의 배양 배지 내 영양소를 지칭한다.
본원에 사용된 "배수적 증식"은 기하급수적 증식 단계 동안에 관찰되는 것과 같은 박테리아 수의 빠른 증가를 지칭한다.
본원에 사용된 "인-탈조절" 박테리아는, 인 결핍에 의해 보통 상향조절되는 (또는 억제되는) 하나 이상의 유전자가 구성적으로 상향조절되어 (또는 억제되어) 박테리아가 인 결핍의 부재 하에도 증가된 수준의 PHA를 합성하도록, 인 또는 포스페이트 조절에 결함이 있는 박테리아를 지칭한다. 유사하게, "질소-탈조절" 박테리아는 질소 결핍에 의해 보통 상향조절되는 (또는 억제되는) 하나 이상의 유전자가 구성적으로 상향조절되어 (또는 억제되어) 박테리아가 질소 결핍의 부재 하에도 증가된 수준의 PHA를 합성하도록, 질소 조절에 결함이 있는 박테리아를 지칭한다. 다른 영양소-탈조절 박테리아의 의미는 유사하게 상응한다.
본원에 사용된 "PHA-음성" 돌연변이체 박테리아는 PHB 또는 PHA를 생산하지 않도록 돌연변이된 박테리아를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Schlegel et al., Arch. Mikrobiol. 71:283-4830, 1970]을 참조한다. 이러한 박테리아는, 원하는 PHA 유전자를 삽입하여 (예를 들어, 아에로모나스 카비아에(Aeromonas caviae)의 야생형 phaC 유전자를 발현하는 pJRDEE32dl3으로 형질전환시킴) PHA를 생산하도록 유전적으로 조작될 수 있다 (문헌 [Fukui et al., J. Bacteriol. 179:4821-4830, 1997] 및 미국 특허 제5,981,257호).
예를 들어, 인-탈조절 박테리아와 관련된 예로써, 이러한 박테리아는 인 또는 포스페이트 감지 (인이 없을 경우, 박테리아가 인 결핍을 감지하도록 함)와 관련된 유전자 또는 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 작동인자(operator), 조절인자(regulator)에 대한 DNA 결합 위치 등); 또는 포스페이트 수송과 관련된 유전자 또는 조절 영역; 또는 인 결핍에 반응하여 다른 유전자를 활성화시키는 양성 포스페이트 조절인자 (또는, 반대로 인 결핍에 반응하여 유전자를 억제하는 다른 조절인자)의 유전자 또는 조절 영역; 또는 과량의 포스페이트에 반응하여 유전자를 억제하는 음성 포스페이트 조절인자 (또는, 반대로 과량의 포스페이트에 반응하여 유전자를 활성화시키는 다른 조절인자)의 유전자 또는 조절 영역; 또는 양성 또는 음성 포스페이트 조절인자에 의해 전사가 조절되는 하류(downstream) 유전자 중 하나 (또는 그의 조절 영역); 또는 1차 양성 및 음성 포스페이트 조절인자를 변형시키거나 조절하는 유전자 중 하나 (또는 그의 조절 영역)에 돌연변이가 있을 수 있다. 혐기성 조건 및 호기성 조건 하에 상이한 조절 경로가 있을 수 있다.
인 조절에 관련된 예시적인 유전자에는 이. 콜라이(E. coli) 유전자 pstA (phoT) (포스페이트 수송에 관련됨), pstB (포스페이트 수송에 관련됨), phoW (pstC) (포스페이트 수송에 관련됨), phoS (포스페이트 결합 단백질), phoU (포스페이트 수송에 관련됨), phoE (외막 포린(porin)), ugpB (글리세롤-3-포스페이트 결합 단백질), phoR (음성 포스페이트 조절인자), phoB (양성 포스페이트 조절인자), phoM (양성 포스페이트 조절인자), psiE (포스페이트 결핍 유도 유전자), phn (psiD) (포스페이트 결핍 유도 유전자), phoG (psiH) (포스페이트 결핍 유도 유전자)에 대해 상동성인 유전자가 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Amemura et al., J. Mol. Biol. 184:241-250, 1984], [Makino et al., J. Mol. Biol. 190: 37-44, 1986], [Wanner et al., "Phosphate Regulation of gene expression in Escherichia coli," Escherichia coli and Salmonella typhimurium 1326-1333, 1987], [Yamada et al., J. Bacteriol. 171:5601-5606, 1989], [Rao et al., J. Bacteriol. 180: 2186-2193, 1998], [Novak et al., J. Bacteriol. 181: 1126-1133, 1999] 및 [Kim et al., J. Bacteriol. 182: 5596-5599, 2000]에서 이러한 유전자와 경로에 대한 설명을 참조한다.
질소 조절에 관련된 예시적인 유전자에는 AmtA (암모늄 수송에 관련됨), GlnD (우리딜릴트랜스퍼라제/우리딜릴-제거 효소) (세포내 질소 상태를 감지하는데 관련됨), GlnB (P11) (세포내 질소 상태를 감지하는데 관련됨), GlnK (질소의 조절에 관련된 신호 전달 단백질), glnE (아데닐릴트랜스퍼라제), NtrB (질소 조절인자인 감지 히스티딘 단백질 키나제), NtrC (질소 반응 조절인자인 DNA 결합 단백질), rpoN (일부 슈도모나스 종), GlnR (과량의 질소로 활성화된 바실러스의 음성 질소 조절인자), TnrA (질소 제한에 의해 활성화된 바실러스의 조절인자), CodY (과량의 질소에 의해 활성화된 바실러스의 음성 조절인자)가 포함된다. NtrBC에 의해 전사적으로 조절되는 유전자에는 glnALG, glnHPQ, argT, hisJQMP, nasFEDCBA, nac, gltF가 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Merrick et al., Microbiol. Rev. 59: 604-622, 1995], [Atkinson et al., Molecular Microbiol. 29: 431-437, 1998], [Fisher, Molecular Microbiol. 32: 223-232, 1999] 및 [Blauwkamp et al., Molecular Microbiol. 46: 203-214, 2002]에서 이러한 유전자와 경로에 대한 설명을 참조한다.
랄스토니아 메탈리두란스(Ralstonia metallidurans) CH34 [과거에 랄스토니아 유트로파 및 알칼리게네스 유트로푸스 (및 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 또는 와우테르시아 유트로파로도 나타냄)]의 게놈은 서열분석되었으며, 그 서열 데이터는 디파트먼트 오브 에너지스 조인트 게놈 인스티튜트 (JGI)에 의해 입수가능하다. 또한, 랄스토니아 유트로푸스 (과거에 알칼리게네스 유트로푸스) CH34의 게놈 서열은 브룩헤이븐 국립 연구소(Brookhaven National Laboratory)로부터 입수가능하다. 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)의 게놈 서열은 지노스코프(Genoscope) 및 NCBI로부터 입수가능하다. 이. 콜라이 또는 다른 박테리아에서 조절인자에 대한 상동성을 갖는 서열을 동정하기 위해, 예를 들어 BLAST를 이용하여 랄스토니아 게놈 서열을 검색할 수 있다.
박테리아는 방사선이나 다른 돌연변이화제를 적용하여 변형될 수 있거나, 유전자 조작으로 변형될 수 있다. 실시예 1 내지 3은 원하는 특징을 갖는 박테리아의 돌연변이생성과 선별 과정을 예시한다. 요컨대, 랄스토니아 유트로파의 PHA-음성 돌연변이체를 돌연변이화시키고, 비-제한적 농도의 포스페이트를 함유하는 배지에서 돌연변이화 박테리아를 증식시키고, 알칼리 포스파타제 활성을 검출하여 포스페이트 탈조절에 대하여 선별한다. 다른 영양소-탈조절 돌연변이체 박테리아는 유사한 절차 (예를 들어, 돌연변이생성시킨 다음, 비-제한적 양의 질소, 또는 다른 원하는 영양소를 함유하는 배지에서 증식시킴)를 이용하여 수득한다.
바람직한 돌연변이체 박테리아는 배수적 증식 단계 (또한, 로그 단계로도 알려짐) 동안 PHA의 증가된 수준의 구성적 생산을 나타내어, 비-제한적 농도의 영양소 (예컨대, 포스페이트, 질소 등)의 존재 하에서도 보다 이른 시점에 PHA의 최대 축적량에 거의 도달한다.
이러한 방식으로 제조된 예시적인 박테리아는 2005년 6월 1일에 각각 기탁 번호 PTA-6759 및 PTA-6760으로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20108 버지니아주 마나사스 피.오. 박스 1549)에 기탁되었다.
원하는 탈조절 특성(들)을 나타내는 동일하거나 유사한 돌연변이를 보유하는 이러한 박테리아의 자손 또는 돌연변이체가 본 발명에서 고려된다. 예를 들어, 이러한 박테리아는, 이들이 영양소-탈조절의 특징을 보유하는 한, 부가적으로 원하는 특징을 갖는 박테리아를 단리하기 위해 추가로 돌연변이화될 수 있다. 또한, 부가적인 원하는 특징은 재조합 유전자 조작을 통해 부여될 수 있다. 예를 들어, 원하는 특징을 나타내는 새로운 유전자가 플라스미드 또는 재조합을 통해 도입될 수 있거나, 박테리아 게놈의 기존의 유전자 또는 조절 영역이 이를 활성화시키거나 불활성화시키도록 돌연변이될 수 있다.
또한, 관찰되는 포스페이트-탈조절 또는 질소-탈조절 표현형을 나타내는 돌연변이(들)는, 예를 들어 돌연변이 동정을 위한 돌연변이 박테리아의 게놈 또는 유전자 산물의 서열분석에 의해, 제한효소 단편 길이 다형성 분석 (제한 효소로 분해하여, 돌연변이에 의해 생성된 상이한 제한 효소 부위를 동정)에 의해, 또는 혼성화 패턴 분석(hybridization pattern analysis) (공지된 서열의 프로브(들)과 동일한 게놈 서열과 돌연변이를 갖는 게놈 서열을 구별하기 위한 혼성화 조건 하에, 상기 프로브로 혼성화시킴)에 의해, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 돌연변이 검출 방법에 의해 확인될 수 있다. 돌연변이의 확인시에, 야생형 박테리아는, 동일한 영역 (예를 들어, 조절 영역 또는 유전자)의 돌연변이를 함유하도록, 게놈에서의 삽입 또는 결실을 통해 유전적으로 조작될 수 있다.
박테리아가 PHA-음성 돌연변이체인 경우, 이들은 바람직하게는 원하는 PHA-생산 유전자 (예를 들어, phaC, phaA 및/또는 phaB)를 함유하도록 추가로 조작되며 (예를 들어, 아에로모나스 카비아에(Aeromonas caviae)의 phaC 유전자를 발현하는 플라스미드로 형질전환시킴) (Fukui et al., J. Bacteriol. 179:4821-4830, 1997 및 미국 특허 제5,981,257호), 이는 PHA 생산을 가능케 한다. 다른 예시적인 유전자로는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)의 phaC (미국 특허 제6,475,734호) 또는 아에로모나스 히드로필리아(Aeromonas hydrophila) 4AK4 (서열 1)의 phaC가 포함된다. 미국 특허 제5,661,026호 및 제5,798,235호를 참조한다.
박테리아
본 발명은 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 임의의 박테리아를 고려한다. 이들에는 와우테르시아, 알칼리게네스, 랄스토니아, 조오글로에아, 바실러스, 아에로모나스, 아조토박터, 클로스트리둠, 노카르디아, 할로박테리움 및 슈도모나스 속에 속하는 종들이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 박테리아는 천연 상태이거나, 유전적으로 조작될 수 있다. 이들 중에서, 랄스토니아, 바실러스, 슈도모나스 및 아조토박터가 전형적으로 사용된다. 과거에 랄스토니아 유트로파로 공지되고, 알칼리게네스 유트로푸스로 칭해졌던 와우테르시아 유트로파가 가장 전형적으로 사용된다. 랄스토니아 (알칼리게네스) 속에 속하는 이러한 박테리아의 박테리아적 특성은, 예를 들어 문헌 ["BERGEY'S MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY, Eighth Edition, The Williams ＆ Wilkins Company/Baltimore"]에 기재되어 있다. 구체적으로, 본 발명의 박테리아에서 영양소의 수준이 제한되지 않은 배양 조건하에서 건조 세포 중량으로 50％ 초과의 PHA를 생산하는 것으로 공지된 박테리아, 예컨대 각각 세포 중량의 90％ 초과의 수준으로 PHA를 축적하는 알칼리게네스 라투스 및 아조토박터 빈란디 돌연변이체 (NADH 산화효소의 돌연변이)가 제외된다.
배양 배지
박테리아의 증식에 필요한 필수 영양소에는 탄소 공급원, 및 일반적으로 즉시 동화가능한 형태로 전형적으로 수용성 염으로서 존재하는 적어도 다음의 무기 원소들, 즉 질소, 인, 황, 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 칼슘 및 철과 임의로 미량의 망간, 아연, 니켈, 크롬, 코발트 및/또는 구리가 포함된다.
탄소 공급원은 합성, 천연 또는 변형된 천연 탄소 공급원을 비롯한, 박테리아에 의해 사용될 수 있는 임의의 물질이다. 예시적인 탄소 공급원으로는 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산 및 장쇄 지방산을 비롯한 지방산; 또는 지방산의 염, 에스테르 (히드록실 치환된 산의 경우 락톤 포함), 무수물, 아미드 또는 할라이드; 식물성 오일 공급원, 예컨대 옥수수유, 대두유, 야자씨유, 면실유, 평지씨유, 땅콩유, 이러한 유형의 임의의 식물성 오일의 분별유 및/또는 이들의 유도체, 및/또는 이들의 혼합물을 비롯한 오일; 메탄올, 에탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올 및 데칸올을 비롯한 알코올 뿐만 아니라, 이소 및 다른 분지쇄 지방산 또는 알코올 및 아세트산; 다른 탄소 공급원, 예컨대 이산화탄소, 효모 추출물, 당밀, 펩톤 및 육즙(beef extract), 당류, 예컨대 아라비노스, 글루코스, 만노스, 프럭토스, 갈락토스, 소르비톨, 만니톨 및 이노시톨이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적인 질소 공급원으로는 무기 질소 화합물, 예컨대 암모니아, 암모늄염, 니트레이트, 및/또는 유기 질소 함유 화합물, 예컨대 우레아, 옥수수 침출액, 카세인, 펩톤, 효모 추출물 및 육즙을 들 수 있다.
예시적인 무기 성분으로는 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 몰리브덴염, 코발트염, 니켈염, 크롬염, 붕소 화합물 또는 요오드 화합물을 들 수 있다.
임의로, 비타민이 배양 배지에 포함될 수 있다.
박테리아 배양법
본 발명의 영양소-탈조절된 박테리아는 필수 영양소가 제한되지 않은 배지에서도 우수한 PHA 생산 수준을 달성할 수 있다. 박테리아의 배양법은 간단히 적합한 배양 배지에서 박테리아를 증식시키는 것을 포함한다. 박테리아는 증식하면서 유의한 수준의 PHA를 생산할 것이다. 박테리아의 배수적 증식을 촉진하는 당업계에 공지되고/되거나 본원에 기재된 임의의 배지 및 적합한 배양 조건이 사용될 수 있다.
배양 온도는 유기체에 따라 달라질 수 있다. 랄스토니아의 경우, 예시적인 배양 온도는 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 약 25 내지 35℃이고, pH는, 예를 들어 약 6 내지 10, 바람직하게는 약 6.5 내지 9.5이다. 배양은 이러한 조건하에 호기적으로 수행된다.
급속한 증식 및 PHA의 생산을 허용하는 풍부 배지를 사용하여, 생산 비용을 유의하게 저하시킬 수 있도록 연속식 발효 반응기가 디자인될 수 있다 (문헌 [Principles of Fermentation Technology, 2nd Edition, P.F. Stanbury, A. Whitaker and S.J. Hall, eds., Butterworth-Heinemann, publishers 1984, pp. 16-27]; [Henderson et al., Microbiology 143: 2361-2371, 1997]; [Ackermann et al., Polymer Degradation and Stability 59: 183-186, 1998] 참조).
예로써, 1-단계 배양법에는 박테리아를 한 발효기로부터 다른 발효기로 옮기는 것 (규모 확대) 뿐만 아니라, 배양 배지의 회분식 공급 또는 연속식 공급이 포함된다. 1종 이상의 필수 영양소가 제한된 제2 배양 단계의 부재로 인해, 박테리아의 더 빠른 증식, PHA의 더 많은 생산, 및 감소된 비용으로 산업적으로 보다 확실한 PHA 생산 공정이 제공된다.
2-단계 배양
별법으로, 예를 들어, 미국 특허 제5,364,778호 또는 미국 특허 제5,871,980호 또는 미국 특허 제6,225,438호에 기재된 통상적인 방법을 비롯한 2-단계 배양법에 따라 박테리아를 배양할 수 있다. 본 발명의 박테리아의 경우 이러한 2-단계 배양법을 반드시 사용할 필요는 없지만, 이러한 통상적인 방법에 따라 본 발명의 박테리아가 배양될 수 있다.
요컨대, 제1 단계에서 비-증식 제한 조건하에 박테리아를 증식시키고, 보통 리터 당 특정 건조 세포 중량으로 측정되는 충분한 바이오매스에 이를 때까지 박테리아를 증식시킨다. 제2 단계에서, 증식을 위해 필요한 1종 이상의 영양소를 제한하여, 배수적 증식이 중단되고 PHA 생산이 증가되게 한다. 산소 공급을 제한하여 PHA의 생산을 증대시킬 수 있지만, 제한하기에 가장 실용적인 영양소는 질소, 인 또는 덜 바람직하게는, 마그네슘, 황, 칼륨 또는 철이다.
임의의 탄소 공급원이 어느 한 단계에서 사용될 수 있다. 일부 선행 기술의 방법에서, 제1 단계에 사용되는 배양 배지는 즉시 대사가능한 탄소 공급원, 예컨대 탄수화물 (예를 들어, 글루코스)을 함유하는 한편, 제2 단계에 사용되는 배양 배지는 보다 복잡한 탄소 공급원, 예를 들어 지방산 또는 지방 알코올을 함유한다.
일부 방법에서, 박테리아 세포는 제1 단계에서 수득된 배양액으로부터 통상적인 고체-액체 분리 수단 (예컨대, 여과 또는 원심분리)에 의한 분리로 회수되고, 이렇게 수득된 세포는 제2 단계에서 배양된다. 별법으로, 제1 단계의 배양에서, 중요한 영양소가 실질적으로 제거되고, 배양액은 거기서 배양되는 세포를 분리에 의해 회수하지 않고 제2 단계의 배양으로 이동될 수 있다.
한 예시적인 방법에서, 초기에 박테리아를 충분한 공급량의 모든 영양소를 함유하는 배양 배지에 두어 배수적으로 증식시킨다. 박테리아가 증식하고 영양소를 소모함에 따라, 1종 이상의 필수 영양소 (예를 들어, 무기 원소)의 공급량을, 배수적 증식을 중단시키고 PHA의 생산을 증가시키는 제한적 수준으로 감소시킨다. 영양소를 함유하는 배양 배지가 박테리아에 재공급될 경우, 이러한 배양 배지는 적어도 이러한 필수 영양소가 계속 제한된다.
배양 배지가 연속적으로 또는 다양한 시간 간격으로 공급되는 또다른 예시적인 방법에서, 초기에 공급되는 배양 배지는 비-제한적 수준의 영양소를 함유하고, 충분한 배수적 증식의 기간 후에, 공급되는 배양 배지는 1종 이상의 필수 영양소가 제한된다.
미국 특허 제6,225,438호에는 PHA-생산 박테리아가 높은 수준의 중간 사슬 길이 단량체 (예를 들어, 5개 초과의 탄소를 갖는 단량체 단위)를 함유하는 PHA 공중합체를 생산하도록 PHA-생산 박테리아를 배양하여 증가된 가요성 및 가공성, 성형 동안의 감소된 열분해성 및 우수한 성형성을 갖고, 바람직하게는 약 30 내지 150℃의 융점 온도를 갖는 공중합체를 생성하는 또다른 방법이 기재되어 있다. 상기 방법에는 6개 이상의 탄소를 함유하는 탄소쇄를 갖는 지방산 및/또는 지방 알코올 및 지방산 산화 억제제의 존재하에 박테리아를 배양하는 것이 포함된다. 본 발명의 박테리아에 이러한 방법을 사용할 수 있다.
탄소 공급원 및 지방산 산화 억제제는 제2 단계의 배양 동안에 배양의 초기 단계 내지 최종 단계 중 임의의 시기에 첨가될 수 있다. 초기 단계에서 첨가하는 것이 바람직하다. 이 방법에 따른 적합한 지방산 산화 억제제의 예로는 아크릴산, 2-부틴산, 2-옥틴산, S-페닐프로프리온산, R-페닐프로프리온산, 프로피올산 및 트랜스-신남산이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 억제제는 산 그 자체 또는 그의 염일 수 있다. 아크릴산나트륨은 하나의 바람직한 지방산 산화 억제제이다. 지방산 산화 억제제는 3-히드록시헥사노에이트 (HH) (C6), 3-히드록시헵타노에이트 (HHp) (C7) 및/또는 3-히드록시옥타노에이트 (HO) (C8) 공중합체의 축적을 원하는 양만큼 증가시킬 수 있는 양 (그러나, 세포에 대해 허용가능한 수준의 독성을 나타내는 양)으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 아크릴산나트륨은 배양 배지 중에서 약 1 내지 40 mM, 바람직하게는 약 10 내지 35 mM, 보다 바람직하게는 25 내지 32 mM의 농도로 사용될 수 있다.
영양소 제한에 의한 PHA 생산의 증대
본 발명의 박테리아는 배양 동안 어떠한 필수 영양소도 제한할 필요없이 유의한 수준의 PHA를 구성적으로 생산한다. 그러나, 영양소의 제한 (예를 들어, 인, 질소, 마그네슘, 술페이트, 칼륨 또는 철의 제한)에 의해 더 높은 수준의 PHA 생산을 달성할 수 있다. 바람직하게는, 제한되는 영양소는 박테리아가 탈조절되지 않은 영양소이다. 예를 들어, 본원에 기재된 한 포스페이트-탈조절 유기체로부터 PHA의 생산은 포스페이트 제한에 의해 증대되지 않지만, 철 제한에 의해 증대된다. PHA의 생산은 철과 또다른 무기 원소의 다양한 조합을 제한함으로써 극대화될 수 있다.
한 실시양태에서, 배지 중 철의 농도는 철에 대한 포스페이트의 비가 약 50 이상, 또는 약 350 이상, 또는 약 500 이상, 또는 약 2800 이하, 또는 약 1400 이하 또는 약 900 이하이도록 제한된다. 예시적인 범위에는 약 58 내지 약 2773, 또는 약 350 내지 약 1400, 또는 약 500 내지 900 또는 약 600 내지 800 (예를 들어, 693)이 포함된다.
PHA 공중합체의 추출
박테리아는 통상적인 고체-액체 분리 수단 (예컨대, 여과 또는 원심분리)을 비롯한 (이에 한정되지는 않음), 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 배양액으로부터 수확할 수 있다.
PHA 공중합체는 다음의 예시적인 절차를 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 박테리아로부터 추출될 수 있다.
박테리아 세포를 배양액으로부터 수확하고, 세포를 0.1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 1회 세척하고, 물에 현탁시킨 후, 동결 건조시킨다. PHA 공중합체를 약 50:1의 클로로포름 대 세포 건조 중량으로 약 5시간 이상 환류시켜 클로로포름으로 추출한다. 추출물을 왓맨(Whatman) #4 여과지를 통해 여과하고, 최소 부피로 건조시키고, 점성 용액을 10 x 부피의 디에틸 에테르/헥산 (3/1 v/v)에 첨가하여 PHA 공중합체를 침전시킨다. 물질을 캡핑된 테플론(Teflon) 원심분리 튜브에서 원심분리하고, 에틸 에테르/헥산으로 1회 세척한 후, 진공하에 밤새 건조시켰다. 비등 아세톤 중에서, 고체 에틸 에테르/헥산으로 침전된 PHA 공중합체를 5시간 동안 환류시켜 PHA 공중합체의 추가의 분별을 수행한다. 아세톤 추출물을 질소하에 건조시키고, PHA 공중합체를 클로로포름에 용해시키고, 에틸 에테르/헥산으로 침전시킨다. 별법으로, 건조된 세포를 아세톤으로 직접 추출하고, 가용성 PHA 공중합체를 질소하에 건조시키고, 클로로포름에 용해시키고, 에틸 에테르/헥산으로 침전시켜 단리한다.
또한, 공중합체 생성물을, PHA 공중합체를 여러가지 유용한 물리적 형태로 생산하는 다양한 공개된 방법을 사용하여 박테리아로부터 회수할 수 있다. 이러한 방법에는, 염소화 용매 (예를 들어, 미국 특허 제4,562,245호), 비-염소화 용매 (WO 공개 번호 제97/07230호), 한계(marginal) 용매 (미국 특허 제5,821,299호)를 사용하는 화학적 추출, 미국 특허 제4,910,145호에 기재된 일례인 PHA 입자의 단리를 위한 열 및 효소의 사용, 또는 공기 분급 (미국 특허 제5,849,854호) 및 원심분리 (미국 특허 제5,899,339호)와 같은 물리적 수단의 사용이 포함된다.
PHA 생산의 정량화 또는 비교 평가
수확한 세포를 건조시키고, 칭량하고, 상기한 바와 같이 염소화 용매를 사용하여 PHA를 추출한다. 추출된 PHA를 진공하에 밤새 건조시키고, 칭량하여 건조 바이오매스 중 PHA의 백분율 및 발효된 배지액 중 역가를 수득한다. 별법으로, PHA를 기체 크로마토그래피 (GC)에 의해 정량적으로 및 정성적으로 분석한다. 액체 배양물을 10,00O g에서 15분 동안 원심분리한 후, 세포를 0.9％ 염화나트륨 염수로 2회 세척하고, 밤새 동결 건조시킨다. 동결 건조된 세포 물질 (8 내지 10 mg)을 15％ (v/v) 황산의 존재하에 가메탄올분해시킨다. 생성된 성분 3-히드록시알칸산의 메틸 에스테르를 문헌 [Brandl et. al., Appl. Environ. Microbiol. 54: 1977, 1988]에 따라, 그리고 문헌 [Timm et al., Appl. Environ. Microbiol. 56: 3360, 1990]에 상세하게 기재된 바와 같이 GC에 의해 분석한다. 샘플 3 L를 직경 0.5 m, 길이 60 m의 페름페이즈(Permphase) PEG 25 Mx 모세관 컬럼을 사용하는 아길렌트 테크놀로지스 모델(Agilent Technologies model) 6850 기체 크로마토그래피 (독일 발트브론)에 주입하여 GC 분석을 수행한다.
생산된 PHA 의 용도
또한, 본 발명은 본 발명의 박테리아에 의해 생산된 PHA를 제공한다. 이러한 PHA는 섬유, 성형품 및 필름으로 전환되고, 의료 물질 (예컨대, 외과용 실 또는 골 셋팅 물질(bone setting material)), 위생 용품 (예컨대, 기저귀 또는 생리 용품), 농업 또는 원예 물질 (예컨대, 멀티 필름), 서방형 화학물질(slow release chemical) 또는 어업용 물질 (예컨대, 어망) 및/또는 포장재 (예컨대, 병, 패스트 푸드 포장지 및 박스)를 비롯한, PHA 또는 다른 플라스틱에 대해 당업계에 공지된 임의의 용품에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 비-제한적 실시예에서 보다 상세하게 기재되며, 이는 본 발명을 보다 충분히 예시하기 위해 제공되는 것이지, 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 영양소-탈조절 랄스토니아 유트로파의 단리, PHA를 생산하기 위한 상기 탈조절 랄스토니아 유트로파의 발효 방법, 및 미량 원소의 제한에 의한 개선된 PHA 생산을 예시한다.
실시예 1
포스페이트 - 탈조절 랄스토니아 유트로파의 단리
포스페이트-탈조절 랄스토니아 유트로파를 하기와 같이 단리하였다. 랄스토니아 유트로파의 PHA 음성 돌연변이체를 효모 추출물 (10 mL, 3％)을 함유하는 100-mL 진탕 플라스크에서 OD600이 10 초과가 될 때까지 30℃에서 16 내지 20시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 배양액 (3 ml)을 멸균 인산염 완충 염수 (PBS) 27 mL에 옮겼다. 돌연변이되지 않은 대조군으로 플레이팅하기 위해 희석된 세포 5 mL를 꺼내고, 나머지 현탁액 (25 mL)을 어둠 속에서 계속 교반하면서 1 내지 10％의 생존률을 제공하기에 충분한 UV 조사에 노출시켰다. 조사된 배양액 중 1 mL의 분취액을 100-mL 진탕 플라스크 안의 미리-가온된 영양소 풍부 배지 (1％ w/v 폴리펩톤, 1％ w/v 효모 추출물, 0.5％ w/v 육즙, 0.5％ w/v 황산암모늄, pH 7) 11 mL로 옮겼다. 플라스크를 알루미늄 호일로 감싸 광회복(photorepair)을 최소화하고, 세포를 분리시키고 돌연변이를 "고정(fixing)"시키기 위해 30℃에서 3시간 동안 200 rpm으로 어둠 속에서 진탕시켰다. 분리된 세포를, 비색성 알칼리 포스파타제 기질인 BCIP (40 g/ml)를 함유하는 LB 한천 (1％ w/v 트립톤, 0.5％ w/v 효모 추출물, 0.5％ w/v 염화나트륨, pH 7) 상에서 배양하고, 이 세포를 30℃에서 2 내지 3일 동안 인큐베이션시켰다. 진한 암청색 콜로니를 포스페이트-탈조절 랄스토니아 유트로파의 균주로 추정하여 단리하였다. 예시적인 포스페이트-탈조절 랄스토니아 유트로파는 2005년 6월 1일에 기탁 번호 PTA-6759 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20108 버지니아주 마나사스 피.오. 박스 1549)에 기탁되어 있다.
실시예 2
질소- 탈조절 랄스토니아 유트로파의 단리
질소-탈조절 랄스토니아 유트로파를 하기와 같이 단리하였다. 랄스토니아 유트로파의 PHA 음성 돌연변이체를, 효모 추출물 (10 mL, 3％)을 함유하는 100-mL 진탕 플라스크에서 OD600이 10 초과가 될 때까지 30℃에서 16 내지 20시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 배양액 (3 ml)을 멸균 인산염 완충 염수 27 mL에 옮겼다. 돌연변이되지 않은 대조군으로 플레이팅하기 위해 희석된 세포 5 mL를 꺼내고, 나머지 현탁액 (25 mL)을 어둠 속에서 계속 교반하면서 1 내지 10％의 생존률을 제공하기에 충분한 UV 조사에 노출시켰다. 조사된 배양액 중 1 mL의 분취액을 100-mL 진탕 플라스크 안의 미리-가온된 영양소 풍부 배지 (1％ w/v 폴리펩톤, 1％ w/v 효모 추출물, 0.5％ w/v 육즙, 0.5％ w/v 황산암모늄, pH 7) 11 mL로 옮겼다. 플라스크를 알루미늄 호일로 감싸 광회복을 최소화하고, 세포를 분리시키고 돌연변이를 "고정"시키기 위해 30℃에서 3시간 동안 200 rpm으로 어둠 속에서 진탕시켰다. 분리된 세포를, 200 mM의 암모늄 유사 메틸아민 및 복합 질소 공급원 (예컨대, 0.1％ w/v 글리신)을 함유하는 최소 한천 상에서 분리된 세포를 배양하고, 30℃에서 3일 이상 인큐베이션시켰다. 잘 증식하는 것으로 보이는 콜로니를 질소-탈조절 균주로 추정하여 단리하였다.
실시예 3
이중- 탈조절 ( 포스페이트와 질소 둘 모두에 대해 탈조절됨 ) 랄스토니아 유트로파의 단리
포스페이트 및 질소 둘 모두에 대해 탈조절된 랄스토니아 유트로파를 하기와 같이 단리하였다. 실시예 1로부터의 랄스토니아 유트로파 DSM541 포스페이트-탈조 절 돌연변이체를 3％ 효모 추출물 10 mL를 함유하는 100-mL 진탕 플라스크에서 OD600이 10 초과가 될 때까지 30℃에서 16 내지 20시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 배양액 3 ml를 멸균 인산염 완충 염수 27 mL에 옮겼다. 돌연변이되지 않은 대조군으로 플레이팅하기 위해 희석된 세포 5 mL를 꺼내고, 나머지 현탁액 (25 mL)을 어둠 속에서 계속 교반하면서 1 내지 10％의 생존률을 제공하기에 충분한 UV 조사에 노출시켰다. 조사된 배양액 중 1 mL의 분취액을 100-mL 진탕 플라스크 안의 미리-가온된 영양소 풍부 배지 (1％ w/v 폴리펩톤, 1％ w/v 효모 추출물, 0.5％ w/v 육즙, 0.5％ w/v 황산암모늄, pH 7) 11 mL로 옮겼다. 플라스크를 알루미늄 호일로 감싸 광회복을 최소화하고, 세포를 분리시키고 돌연변이를 "고정"시키기 위해 30℃에서 3시간 동안 200 rpm으로 어둠 속에서 진탕시켰다. 분리된 세포를, 200 mM의 암모늄 유사 메틸아민 및 복합 질소 공급원 (예컨대, 0.1％ w/v 글리신)을 함유하는 최소 한천 상에서 배양하고, 30℃에서 3일 이상 인큐베이션시켰다. 잘 증식하는 것으로 보이는 콜로니를 이중-탈조절 (포스페이트와 질소 둘 모두에 대해 탈조절됨) 균주로 추정하여 단리하였다. 예시적인 포스페이트-탈조절 및 질소-탈조절 랄스토니아 유트로파는 2005년 6월 1일에 기탁 번호 PTA-6760 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20108 버지니아주 마나사스 피.오. 박스 1549)에 기탁되어 있다.
실시예 4
PHA 유전자로의 영양소- 탈조절 랄스토니아 유트로파의 형질전환
영양소-탈조절 랄스토니아 유트로파 세포를 다양한 PHA 생산 유전자로 형질전환시켜 (예를 들어, 아에로모나스 카비아에의 야생형 phaC 유전자를 발현하는 플라스미드 pJRDEE32d13으로 형질전환시킴) PHA를 생산할 수 있었다 (문헌 [Fukui et al., J. Bacteriol. 179:4821-4830, 1997] 및 미국 특허 제5,981,257호). 다양한 형질전환 방법, 예를 들어 파크(Park) 등에 의한 문헌 [Biotechnology Techniques 9:31-34, 1995]에 기재된 바와 같은 전기천공법 또는 프리드리히(Friedrich) 등에 의한 문헌 [J. Bacteriology 147: 198-205, 1981]에 기재된 바와 같은 이. 콜라이 S17-1과의 교차접합(transconjugation)을 통한 방법이 당업계에 공지되어 있다.
이어서, 비-제한적 농도의 탈조절 영양소, 예를 들어 인 (또는 이중 탈조절 영양소, 예를 들어 인 및 질소)을 함유하는 배지 중에서 박테리아를 증식시키고, 하기 기술된 바와 같이 PHA 축적에 대해 측정하였다.
실시예 5
PHA 축적의 측정
박테리아를 원심분리하고, 0.1 M NaCl, 50 mM 트리스 8.0으로 1회 세척하고, 원심분리하고, 물 2 내지 3 mL 중에 현탁시키고, 동결시키고, 2일 동안 동결건조시켰다. 건조된 세포를 100℃에서 4시간 동안 클로로포름 1 mL + 메탄올 중 15％ 황산 1 mL 중에서 반응시켰다. 클로로포름 1 mL + 1 M NaCl 1 mL를 첨가하여 샘플을 상 분리하였다. 클로로포름 상을 무수 황산나트륨으로 처리하여 건조시키고, 1 mL를 꺼내고, 질소 하의 샘플 바이알 또는 밤새 후드에서 건조시켰다. 샘플을 아세톤 1 mL + 1 g/L 메틸벤조에이트 중에 용해시킨 다음 캡핑하였다. 별법으로, 10 g/L 메틸벤조에이트 100 μL를 클로로포름 1 mL에 직접 첨가한 다음, 샘플을 캡핑하고 분석하였다.
샘플은 20 cm/초의 선형 유속과 동등한 1 cm3/초의 유속으로 헬륨을 사용하여, 수펠코왁스(Supelcowax) 10 컬럼 (30 m, 0.32 mmID, 0.25 μm 필름)을 사용하는 HP5890 GC 상에서 분석하였다. 주입기는 225℃로 설정하였고, FID 검출기는 300℃로 설정하였다. 오븐 온도를 2분 동안 80℃에서 유지한 다음 1 μL를 주입하고 (50:1 분할), 분 당 10℃로 230℃까지 온도를 올리고나서 12분 동안 230℃에서 유지하였다. 별법으로, 최종 온도가 7분 동안 230℃에서 유지되는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프로그램을 사용하여 샘플을 J＆W DB-5MS (122-5531 부분, 30 m, 0.25 mmID, 0.1 μm 필름) 상에서 분석하였다.
표준물질로서 사용하기 위한 3-히드록시알카노에이트 및 메틸 3-히드록시알카노에이트는 시그마(Sigma)사 (카탈로그 번호 H6501: dl-베타-히드록시부티르산, 카탈로그 번호 H4023: 3-히드록시카프릴산 메틸 에스테르, 카탈로그 번호 H3773: 3-히드록시카프르산 메틸 에스테르, 카탈로그 번호 H3523: 3-히드록시라우르산 메틸 에스테르, 카탈로그 번호 H4273: 3-히드록시미리스트산 메틸 에스테르, 카탈로그 번호 H4523: 3-히드록시팔미트산 메틸 에스테르)로부터 구입하였고, 3-히드록시카프로산 메틸 에스테르는 라우르산에서 증식된 아에로모나스 히드로필리아로부터 가공된 PHA 공중합체로부터 확인되었다.
실시예 6
폴리 -3- 히드록실알카노에이트 ( PHA )의 생산을 위한 포스페이트 - 탈조절 랄스토니아 유트로파의 발효
식물성 오일, 지방산, 지방 알코올 및 에스테르를 공급 기질로서 사용하여, 폴리히드록시부티레이트-코-헥사노에이트를 생성할 수 있도록 조작된 재조합 포스페이트-탈조절 랄스토니아 유트로파의 유가배양(fed batch culture)을 수행하였다. 식물성 오일에는 옥수수유, 대두유, 야자유, 야자씨유, 면실유, 평지씨유, 땅콩유, 이들의 분별유, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 또한, 유가배양은 프럭토스, 글루콘산, 글루코스 및 당밀을 비롯한 PHA-이용 탄수화물 공급물을 제조할 수 있으며, 이 중 일부는 특정한 공급물에 대해 증식을 위해 선별된 균주를 필요로 한다.
균주를 먼저 영양 배지액 100 mL 중에서 OD600이 2.0이 될 때까지 30℃에서 증식시켰다. 이어서, 하기 배지를 사용한 3 L의 종자 배양 발효조의 접종 및 증식에 상기 배지액을 사용하였다.
종자 발효조:
Na2HPO4 11.0 g/L
KH2PO4 1.90 g/L
(NH4)2SO4 12.87 g/L
MgSO4·7H2O (20 g/100 ml) 5 mL/L
미량 원소 5 mL/L
CoCl2·6H2O 0.218 g
FeCl3·6H2O 16.2 g
CaCl2·2H2O 10.3 g
NiCl2·6H2O 0.118 g
CuSO4·5H2O 0.156 g
0.1 N HCl을 사용하여 1 L로 희석
배지를 121℃에서 20분 동안 멸균하고, 냉각시킨 다음, 식물성 오일 30 g/L 및 카나마이신 50 mg/L을 첨가하였다.
조작:
온도 30℃
초기 pH 6.8
pH 제어 지점 7％ NH4OH로 6.8
통기 0.6 vvm
교반 500 rpm
OD600이 69.9일 때, 배양액을 수확하였고, 배양액 175 mL를 사용하여 주요 발효기에서 3.5 L를 접종하였다. 배지 중 포스페이트의 농도는 노바 바이오메디칼(Nova Biomedical) 300 바이오프로파일 분석기를 사용하여 측정하였으며, 제한되지 않는 것으로 입증되었다.
Na2HPO4 4.36 g/L
KH2PO4 1.90 g/L
(NH4)2SO4 2.91 g/L
소포제 3 mL/L
MgSO4·7H2O (20 g/100 mL) 5 mL/L
미량 원소 5 mL/L
조작:
온도 28℃
초기 pH 6.8
pH 제어 지점 14％ NH4OH로 6.8
통기 0.6 vvm
교반 400 rpm
배압(back pressure) 1-2 psi
하기 시간에 총 110 g/L의 식물성 오일을 공급하였다.
0시간 0.56 mL/L
2시간 0.92
4시간 1.28
6시간 1.67
8시간 2.02
10시간 2.37
12-60시간 2.67
또한, 상기 균주는 배양 동안 (보통 20 내지 36시간의 배양 시간) 첨가된 인의 완전한 이용이 야생형 균주로 하여금 PHA의 생산 증가를 유도하게 하는 포스페이트 제한 배지 상에서도 증식되었다.
포스페이트 제한 배지:
Na2HPO4 3.85 g/L
KH2PO4 0.67 g/L
(NH4)2SO4 2.91 g/L
소포제 3 mL/L
MgSO4·7H2O (20 g/100 ml) 5 mL/L
미량 원소 5 mL/L
5％ v/v의 종자 발효조로 접종하였다.
조작:
온도 16시간 동안 30-34℃, 이후 28℃
초기 pH 6.8
pH 제어 지점 14％ NH4OH로 6.8
통기 0.6 vvm
교반 400 rpm
배압 1-2 psi
하기 시간에 총 110 g/L의 식물성 오일을 공급하였다.
0시간 0.56 mL/L
2시간 0.92
4시간 1.28
6시간 1.67
8시간 2.02
10시간 2.37
12-60시간 2.67
보다 풍부한 배지는 최소의 지체 시간(lag time)으로 세포를 증식시킨다. 보다 높은 포스페이트 농도에서 증식된 세포는 구성적으로 PHA를 생산하고, 세포 증식의 기간 내내 PHA를 축적하였다. 보다 높은 포스페이트 농도에서 증식된 세포는, 포스페이트 제한 배지 상에서 증식된 세포에 의해 생산된 PHA의 양의 165％로 PHA를 생산하였다. 반면, 탈조절되지 않은 배경 수준의 PHA 생산 랄스토니아 유트로파는 포스페이트 제한 배지에서와 같이, 보다 높은 농도의 포스페이트 배지에서의 PHA 생산량의 단지 55％만을 생산하였다.
이는 랄스토니아 유트로파의 활동적인 증식 단계 (로그 단계) 동안 유의한 수준의 PHA의 구성적 생산이 비-제한적 농도의 포스페이트 존재에 관계없이, 보다 이른 시점에 PHA의 거의 최대 혼입을 초래함을 최초로 입증한 것이다.
실시예 7
PHA 의 생산을 위한 질소- 탈조절 , 이중- 탈조절 및 다른 영양소- 탈조절 랄스토니아 유트로파의 발효
랄스토니아 유트로파의 질소-탈조절 균주, 이중 탈조절 균주 (포스페이트와 질소 둘 모두에 대해 탈조절됨) 및 다른 영양소-탈조절 균주를 상기 실시예 6에서 기재된 바와 같은 비-제한적 영양소 배지액에서 증식시켜, 천연 랄스토니아 유트로파보다 높은 농도로 PHA를 생산하였다.
실시예 8
PHA 의 생산을 위한 풍부 배지에서 영양소- 탈조절 랄스토니아 유트로파의 발효
영양소-탈조절 균주는 다량의 PHA를 생산하기 위해 영양소 제한에 의한 유도를 필요로 하지 않았다. 따라서, 풍부한 영양소 공급원인 복합 배지를 첨가하여 높은 PHA 생산을 유지하면서 총 바이오매스 생산을 증가시키고, 이에 따라 주어진 배양 용기 내 총 PHA 역가를 증가시킬 수 있었다. 풍부 배지는 효모 추출물, 펩톤, 트립톤, 아미노산, 육즙, 및 유기 질소, 포스페이트 및 다른 영양소의 기타 공급원을 포함할 수 있다.
실시예 9
PHA 의 생산을 위한 보다 풍부한 저가 배지에서 영양소- 탈조절 랄스토니아 유트로파의 발효
영양소-탈조절 균주는 다량의 PHA를 생산하기 위해 영양소 제한에 의한 유도 를 필요로 하지 않지만, 고가의 풍부 배지 공급원을 첨가하는 것은 여전히 경제적이지 않을 수 있다. 예를 들어, 인산, 암모늄염, 질산염, 아질산염, 옥수수 침출물, 대두 가수분해물, 조질의 글리세린, 유청, 공업용 가공유, 탄수화물 또는 단백질 폐기 스트림, 또는 중요한 영양소의 과량 공급으로 인한 PHA 생산 억제에 대한 염려가 없는 다른 덜 고가인 단순 또는 복합 배지를 공급함으로써 보다 경제적으로 영양소를 보충하였다.
실시예 10
미량 원소 제한에 의한 영양소- 탈조절 랄스토니아 유트로파에서 높은 수준의 PHA 생산 유도
랄스토니아 유트로파의 포스페이트-탈조절 및 질소-탈조절 균주는 각각 비-제한적 인 및 질소 배지에서 PHA의 구조적 생산자이다. 식물성 오일을 공급하면서 배양 배지 내 미량 원소를 제한함으로써, PHA 생산이 증가되었다.
포스페이트 또는 포스페이트와 질소에 대해 영양소-탈조절되고, 폴리히드록시부티레이트-코-헥사노에이트 (C4C6)를 생산할 수 있는 랄스토니아 유트로파를 하기 물질을 함유하는 배지에서 증식시켰다.
Na2HPO4 7.70 g/L
KH2PO4 1.34 g/L
(NH4)2SO4 2.91 g/L
MgSO4·H2O (20 g/100 mL) 5 mL/L
소포제는 필요에 따라 첨가함
미량 원소 0 내지 1 mL/L
CoCl2·6H2O 0.218 g
FeCl3·6H2O 16.2 g
CaCl2·2H2O 10.3 g
NiCl2·6H2O 0.118 g
CuSO4·5H2O 0.156 g
0.1N HCl을 사용하여 1L로 희석
상기 박테리아를 식물성 오일과 함께 회분식으로 공급하였다. 전형적인 수준은 5 mL/L 미량 원소, 3.85 g/L Na2HPO4 및 0.67 g/L KH2PO4였다.
세포의 85 중량％를 초과한 PHA 수준이 관찰되었다. 대조적으로, 포스페이트 탈조절 세포는 포스페이트 제한 배지에서 35％ PHA를 축적하였고, 비-제한 배지에서 49％ PHA를 축적하였다. 비-탈조절 세포는 비-제한 배지에서 PHA를 축적하지 않았고, 미량 원소 제한 배지에서 단지 1.9％의 PHA만을 축적하였다.
또한, 아에로모나스 카비아에의 야생형 phaC 유전자 (pJRDEE32dl3)를 발현하는 포스페이트-탈조절 돌연변이체 (문헌 [Fukui et al., J. Bacteriol. 179:4821-4830, 1997] 및 미국 특허 제5,981,257호)에 있어서, 배지 내 미량 원소를 80％만큼 제한하는 것은, 동량의 바이오매스에서 포스페이트-제한된 조건하에 35％의 PHA 생산과 비교하여, PHA 생산을 74％ PHA만큼 개선하였다.
아에로모나스 카비아에 phaC 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 랄스토니아 유트로파 (실시예 1에 기재됨)를, 2X 포스페이트 염이 첨가된 대조군 배지 및 미량 원소의 양이 조정된 시험군 배지를 사용하여 출발 부피 3.5 L에서 발효시켰다. 상기 박테리아에 옥수수유를 공급하고, 수산화암모늄을 사용하여 산을 중화하였다. 시험군 배지 내 미량 원소의 제한 결과, 대조군 배양 배지와 비교하여 세포의 PHA 함량이 2배가 되었다. 미량 원소의 양을 대조군 배지 내 양의 20％로 제한하는 것은, 세포의 PHA 함량을 여전히 증가시키면서 대조군 배지 상의 세포 증식과 동등한 증식을 지속시키기에 충분하였다.
하기 표 1은 미량 원소를 기준으로 한 포스페이트 탈조절 세포 증식 및 PHA 축적에 대한 미량 원소 제한의 효과를 나타낸다. 포스페이트 제한 조건하에 배양시, 세포는 PHA 35 중량％ (건조 세포 중량 (DCW) 당 PHA 중량)를 함유하였고, 생산성은 0.51 gPHA/L/시간이었으며, 39.3 g/L의 PHA를 생산하였다. 과량의 포스페이트를 공급하면서 미량 원소를 90％ 이상으로 심하게 제한하는 것은 세포 당 높은 PHA 축적을 가능하게 하지만, 세포 증식 및 PHA 생산을 제한하였다. 미량 원소를 80％만큼 고갈시키는 것은 완전한 세포 증식 및 84.1 g/L의 PHA 생산 (PHA 73.6 중량％ 및 생산성 1.17 gPHA/L/시간)을 가능하게 하였다.
포스페이트 - 탈조절 돌연변이체 PGC -5에서 pJRDEE32d13
포스페이트 제한 배지 0％ 미량 원소 2％ 미량 원소 5％ 미량 원소 10％ 미량 원소 20％ 미량 원소
DCW g/L 106 61 70 67 76 114
％PHA 35 73 72 65 68 73.6
g PHA/L/시간 0.51 0.62 0.7 0.6 0.72 1.17
수율 g PHA/g 오일 0.35 0.38 0.42 0.38 0.45 0.76
g PHA/L 39.3 51.5 56.1 50.5 58.5 84.1
실시예 11
철 제한에 의한 영양소- 탈조절 랄스토니아 유트로파에서 개선된 PHA 생산
다양한 양의 미량 원소에 대한 추가 시험에서, 대조군 배지에 존재하는 철의 20％를 함유하지만 다른 미량 원소는 완전한 양을 함유하는 배양 배지로부터 동일한 결과를 얻었다. 이들 결과는, 철의 제한이 PHA의 생산을 증가시키는 원하는 효과를 제공한다는 것을 나타낸다.
PHA 축적 증가가 증명된, 배양시 이용된 예시적인 포스페이트 대 철 비 (몰농도/몰농도)를 하기에 제시하였다. 개선된 PHA 축적을 증명하는 발효 배지는 포스페이트 (41.6 mM) 및 철 (0.06 mM)을 693:1의 비로 포함하였다. 또한, 1,387:1의 비가 되도록 철 함량을 절반으로 감소시키거나, 포스페이트를 2배로 증가시키는 것도 가능하였다. 포스페이트 대 철의 비는 약 58:1 내지 약 2,773:1로 변경할 수 있었다. P 대 Fe의 예시적인 비는 제한적이지 않다. 당업자는 상기 비를 결정할 수 있다.
본 출원의 전반에 걸쳐, 다양한 간행물이 언급된다. 본원에 언급된 개시 내용의 특정 국면 등을 비롯하여 이들 간행물의 전체 개시 내용은 그 거명에 의해 본 출원에 포함되어, 본원에 기재되고 청구된 발명의 완성일을 기준으로 당업자에게 공지된 기술의 상태를 보다 완전하게 기재한다.
상기 특허 문서의 개시 내용은 저작권 보호를 받는 자료를 포함한다. 저작권자는 특허청 및 상표청 특허 파일 또는 기록에 나타나 있는 특허 문서 또는 특허 개시 내용의 불특정인에 의한 모사본에는 이의가 없지만, 다른 모든 소유권은 보유한다.
본 발명의 특정 실시양태가 예시 및 기재되었지만, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 기타 변경 및 변형이 가능하다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주 내에 속한 이러한 모든 변경 및 변형을 첨부된 청구의 범위에 포함하고자 한다.

Claims (20)

  1. (a) 영양소의 수준이 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 10％ 이상의 폴리히드록시알카노에이트 (PHA)를 생산하고, (b) 철이 제한되지만 다른 영양소는 유의하게 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 20％ 이상의 PHA를 생산할 수 있는, 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus) 및 아조토박터 빈란디(Azotobacter vinlandii) 돌연변이체 (NADH 산화효소에 돌연변이가 있음)를 제외한 단리된 영양소-탈조절 박테리아.
  2. ATCC 기탁 번호 PTA-6759 하에 기탁된 박테리아의 식별 특징을 모두 나타내는 단리된 박테리아.
  3. ATCC 기탁 번호 PTA-6760 하에 기탁된 박테리아의 식별 특징을 모두 나타내는 단리된 박테리아.
  4. 제1항에 있어서, 와우테르시아(Wautersia), 랄스토니아(Ralstonia), 바실러스(Basillus), 노카르디아(Nocardia), 아에로모나스(Aeromonas) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종인 박테리아.
  5. 제1항에 있어서, 포스페이트-탈조절 와우테르시아 종인 박테리아.
  6. 제2항에 있어서, 포스페이트-탈조절 와우테르시아 종인 박테리아.
  7. 제1항에 있어서, 포스페이트-탈조절 및 질소-탈조절 박테리아.
  8. 제2항에 있어서, 포스페이트-탈조절 및 질소-탈조절 박테리아.
  9. 제1항에 있어서, 비-천연 PHA-생산 유전자를 함유하는 박테리아.
  10. 제2항에 있어서, 비-천연 PHA-생산 유전자를 함유하는 박테리아.
  11. 제3항에 있어서, 비-천연 PHA-생산 유전자를 함유하는 박테리아.
  12. 제9항에 있어서, PHA-생산 유전자가 phaA, phaB 또는 phaC 유전자로부터 선택된 것인 박테리아.
  13. (a) 영양소의 수준이 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 10％ 이상의 폴리히드록시알카노에이트 (PHA)를 생산하고, (b) 철이 제한되지만 다른 영양소는 유의하게 제한되지 않는 배양 조건 하에 건조 세포 중량으로 20％ 이상의 PHA를 생산할 수 있는, 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus) 및 아조토박터 빈 란디(Azotobacter vinlandii) 돌연변이체 (NADH 산화효소에 돌연변이가 있음)를 제외한 박테리아가 PHA를 생산하도록 상기 박테리아를 배양 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는, 상기 박테리아를 이용하여 PHA를 생산하는 방법.
  14. ATCC 기탁 번호 PTA-6759 하에 기탁된 박테리아의 식별 특징을 모두 나타내는 박테리아가 PHA를 생산하도록 상기 박테리아를 배양 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는, 상기 박테리아를 이용하여 PHA를 생산하는 방법.
  15. ATCC 기탁 번호 PTA-6760 하에 기탁된 박테리아의 식별 특징을 모두 나타내는 박테리아가 PHA를 생산하도록 상기 박테리아를 배양 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는, 상기 박테리아를 이용하여 PHA를 생산하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 박테리아를 필수 영양소가 제한되지 않은 배지에서 배양하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 1종 이상의 무기 원소가 제한된 배양 배지에서 상기 박테리아를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제한된 원소가 철인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 배양 배지가 식물성 오일을 포함하는 것인 방법.
  20. 제14항에 있어서, 배양 배지가 식물성 오일을 포함하는 것인 방법.
KR1020087008454A 2005-09-08 2006-09-08 폴리히드록시알카노에이트 생산이 개선된 탈조절 박테리아 KR20080053368A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US71502805P 2005-09-08 2005-09-08
US60/715,028 2005-09-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080053368A true KR20080053368A (ko) 2008-06-12

Family

ID=37836243

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087008454A KR20080053368A (ko) 2005-09-08 2006-09-08 폴리히드록시알카노에이트 생산이 개선된 탈조절 박테리아

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20070161097A1 (ko)
EP (1) EP1951875A2 (ko)
JP (1) JP2009507483A (ko)
KR (1) KR20080053368A (ko)
CN (1) CN101300354A (ko)
AU (1) AU2006288684A1 (ko)
CA (1) CA2624966A1 (ko)
WO (1) WO2007029213A2 (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8735113B2 (en) 2003-10-15 2014-05-27 Newlight Technologies, Llc Methods and systems for production of polyhydroxyalkanoate
US7745197B1 (en) 2003-10-15 2010-06-29 Newlight Technologies, Llc Process for the utilization of ruminant animal methane emissions
US7579176B2 (en) 2003-10-15 2009-08-25 Newlight Technologies, Llc Method for the production of polyhydroxyalkanoic acid
US20100092954A1 (en) * 2006-08-02 2010-04-15 Bernhard Palsson Method for Determining the Genetic Basis for Physiological Changes in Organisms
US20090181068A1 (en) 2008-01-14 2009-07-16 Dunn Richard L Low Viscosity Liquid Polymeric Delivery System
JP5115708B2 (ja) * 2008-01-17 2013-01-09 学校法人慶應義塾 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ及びそれをコードするｄｎａ
MY155003A (en) * 2009-01-13 2015-08-28 Plainexus Res Lab Sdn Bhd A method for producing biodegradable resins
KR101293886B1 (ko) 2009-02-05 2013-08-07 주식회사 엘지화학 폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체 생성능을 지닌 재조합 랄스토니아 유트로파 및 이것을 이용하여 폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체를 제조하는 방법
US9040267B2 (en) 2011-03-08 2015-05-26 Newlight Technologies, Llc Polyhydroxyalkanoate production method
US20200347417A1 (en) 2012-03-29 2020-11-05 Newlight Technologies, Inc Polyhydroxyalkanoate production methods and materials and microorganisms used in same
US9085784B1 (en) 2012-03-29 2015-07-21 Newlight Technologies, Llc Polyhydroxyalkanoate production methods and materials and microorganisms used in same
WO2014096276A1 (en) * 2012-12-21 2014-06-26 Carbios Preparation of long-chain length poly(hydroxyfatty acids)
CN104630122B (zh) * 2015-03-11 2017-08-08 北京工商大学 具有合成PHAs性能的兽生气单胞菌
AT520996A1 (de) * 2018-03-13 2019-09-15 Lackner Ventures & Consulting Gmbh Verfahren zum Mutieren von Cyanobakterien
CN116376856B (zh) * 2022-04-06 2023-11-03 深圳蓝晶生物科技有限公司 表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的工程化微生物及提高pha产量的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8311677D0 (en) * 1983-04-28 1983-06-02 Ici Plc Extraction process
EP0145233B2 (en) * 1983-11-23 1991-11-06 Imperial Chemical Industries Plc Separation processfor a 3-hydroxybutyrate polymer
US5229279A (en) * 1987-06-29 1993-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
GB8927794D0 (en) * 1989-12-08 1990-02-14 Ici Plc Copolymer production
CN1079835C (zh) * 1994-06-01 2002-02-27 普罗克特和甘保尔公司 利用空气分级作用回收聚羟基链烷酸酯的方法
CN1071379C (zh) * 1994-06-01 2001-09-19 普罗克特和甘保尔公司 利用离心分级回收聚羟基链烷酸酯的方法
US5821299A (en) * 1996-02-16 1998-10-13 The Proctor & Gamble Company Solvent extraction of polyhydroxy-alkanoates from biomass facilitated by the use of marginal nonsolvent
US6091002A (en) * 1996-03-13 2000-07-18 Monsanto Company Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants
JP3062459B2 (ja) * 1996-08-14 2000-07-10 理化学研究所 ポリエステル重合酵素遺伝子及びポリエステルの製造方法
US7455999B2 (en) * 1998-01-22 2008-11-25 Metabolix, Inc. Transgenic systems for the manufacture of poly (3-hydroxy-butyrate-co-3-hydroxyhexanoate)
MXPA01001111A (es) * 1998-08-04 2002-04-24 Metabolix Inc Produccion de polihidroxialcanoato a partir de polioles.
WO2000011188A1 (en) * 1998-08-18 2000-03-02 Metabolix, Inc. Transgenic microbial polyhydroxyalkanoate producers
US6475734B1 (en) * 1999-09-29 2002-11-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Polyhydroxyalkanoate synthase genes
US6225438B1 (en) * 2000-01-31 2001-05-01 The Procter & Gamble Company Medium chain length PHA copolymer and process for producing same

Also Published As

Publication number Publication date
CN101300354A (zh) 2008-11-05
WO2007029213A2 (en) 2007-03-15
EP1951875A2 (en) 2008-08-06
CA2624966A1 (en) 2007-03-15
US20070161097A1 (en) 2007-07-12
JP2009507483A (ja) 2009-02-26
AU2006288684A1 (en) 2007-03-15
WO2007029213A3 (en) 2007-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20080053368A (ko) 폴리히드록시알카노에이트 생산이 개선된 탈조절 박테리아
Tan et al. Unsterile and continuous production of polyhydroxybutyrate by Halomonas TD01
Jiang et al. High poly (β-hydroxybutyrate) production by Pseudomonas fluorescens A2a5 from inexpensive substrates
Tanaka et al. Cell growth and P (3HB) accumulation from CO 2 of a carbon monoxide-tolerant hydrogen-oxidizing bacterium, Ideonella sp. O-1
Quillaguaman et al. Poly (β-hydroxybutyrate) production by a moderate halophile, Halomonas boliviensis LC1
CN101184843B (zh) 具有产生聚乳酸酯或其共聚物能力的细胞或植物及制备聚乳酸酯或其共聚物的方法
Kahar et al. High yield production of polyhydroxyalkanoates from soybean oil by Ralstonia eutropha and its recombinant strain
US8372611B2 (en) Method for producing polyhydroxyalkanoate (PHAs) using halobacterium and halobacterium
Kshirsagar et al. Scale up production of polyhydroxyalkanoate (PHA) at different aeration, agitation and controlled dissolved oxygen levels in fermenter using Halomonas campisalis MCM B-1027
US5569595A (en) Production of poly-β-hydroxybutyrate in prokaryotic host cells
JP4643799B2 (ja) ポリエステルの製造方法
Thuoc et al. Bioconversion of crude fish Oil into poly-3-hydroxybutyrate by Ralstonia sp. M91
Szacherska et al. Effect of short-and medium-chain fatty acid mixture on polyhydroxyalkanoate production by Pseudomonas strains grown under different culture conditions
Byrom The synthesis and biodegradation of polyhydroxyalkanoates from bacteria
US10876140B2 (en) Method for producing polyhydroxyalkanoic acid, and microbes
KR100957775B1 (ko) 신규 ３­하이드록시부티레이트­ｍｃｌ３­하이드록시알카노에이트­락테이트 삼중합체 및 그제조방법
Masood et al. Production and characterization of Tailor-made polyhydroxyalkanoates by Bacillus cereus FC11
Parshad et al. Poly-3-hydroxybutyrate production by Azotobacter chroococcum
Chobchuenchom et al. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas putida ATCC47054 using glycerol and sodium octanoate as substrates
Đoàn et al. Isolation of halophilic bacterial strains from mangrove soil samples for polyhydroxyalkanoate production
Jinda et al. The isolation and screening of polyhydroxyalkanoates producing bacteria from wastewater and soil from palm oil manufacturing plant
JP4931009B2 (ja) ポリヒドロキシブチレート（ｐｈｂ）の産生方法
Martínez et al. Production of Poly (3-Hydroxybutyrate-Co-3-Hydroxyvalerate) by Bacillus megaterium LVN01 Using Biogas Digestate
WO2008135065A1 (en) PHAs PRODUCING MICROORGANISM AND PHA OBTAINABLE THEREWITH
CN117143793A (zh) 一种生产5-碳化合物或其聚合物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid