AT520996A1 - Verfahren zum Mutieren von Cyanobakterien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der durch Photosynthese produzierten Menge eines Expressionsprodukts in einem Cyanobakterium durch Manipulation des Erbmaterials des Bakteriums, indem das Erbmaterial eines den Energiespeicherstoff Polyhydroxybutyrat, PHB, produzierenden Cyanobakteriums manipuliert wird, um die Menge an produziertem PHB zu erhöhen, mit dem Kennzeichen, dass in einem das phosphat-spezifische Transportsystem, PST, umfassenden Cyanobakterium eine Genmanipulation durch ortsspezifische Mutagenese oder Zufallsmutagenese in dem für ein PST-Protein kodierenden Gen pstA durchgeführt wird, um die Phosphataufnahmefähigkeit des Bakteriums und dadurch die PHB-Expression zu erhöhen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der durch Photosynthese produzierten Menge eines Expressionsprodukts in einem Cyanobakterium.

STAND DER TECHNIK

Zufällige Mutagenese ist in der Biotechnologie seit einigen Jahren ein weit verbreitetes Mittel zur Verbesserung verschiedener Eigenschaften von Mikroorganismen. Dazu werden Zellen eines ausgewählten Mikroorganismus in parallelen Mehrfachansätzen (z.B. in Mikrotiterplatten) mutagenen, d.h. erbgutverändernden, Bedingungen ausgesetzt, wofür UV-Strahlung oder bekanntermaßen stark mutagene Chemikalien (wie z.B. Methylmethansulfonat, Hydroxylamin, Ethylmethansulfonat, N-Methyl-N-nitro-Nnitrosoguanidin, Ethidiumbromid) eingesetzt werden können, und anschließend auf die dadurch herbeigeführten Veränderungen einer gewünschten Eigenschaft gescreent. Dies kann mitunter auch in mehreren Runden von Mutagenese und Screening erfolgen, wobei eine oder mehrere jener Mutanten, die im Screening die vorteilhaftesten Veränderungen gezeigt haben, erneut den mutagenen Bedingungen ausgesetzt und danach neuerlich gescreent werden. Eines der Hauptziele dieser Vorgangsweise war und ist die Produktion natürlicher Antibiotika, wie z.B. Erythromycin, das beispielsweise von Saccharopolyspora erythraea produziert wird (siehe z.B. Demain und Adrio, Prog. Drug Res. 65, 251,253-289 (2008); Fallahpour et al., Assay Drug Dev. Techn. 15(7), 314-319(2017)).

Arai et al., Biotechnol. Bioeng. 114 (8), 1771-1778 (2017), offenbaren die Mutagenese von Synechococcus elongatus PCC 7942. Synechococcus ist eine photoautotrophe d.h. bei Lichteinstrahlung zur Energiegewinnung Photosynthese unter Verwertung von anorganischem Kohlenstoff (z.B. CO2) ausführende - Gattung von Cyanobakterien. Dabei ist Synechococcus elongatus jene Art, die in der Biologie als Modellorganismus gilt und deren Genom bereits erfolgreich sequenziert wurde. Ziel dieser mittels UV-CBestrahlung induzierten zufälligen Mutagenese von Synechococcus elongatus PCC 7942 war die Erhöhung der Alkoholtoleranz, um einen für die Bioalkoholproduktion besser geeigneten Stamm zu erzeugen.

2/29

Synechocystis ist eine weitere Gattung phototropher Cyanobakterien, die in den letzten Jahren Gegenstand von Forschungen war, wobei der Stamm Synechocystis sp. PCC6803 eines der meistuntersuchten Cyanobakterien darstellt, da er sowohl zu photoautotropher als auch heterotropher Ernährung in der Lage ist, d.h. in Gegenwart von Licht unter Verwertung von anorganischem Kohlenstoff und in der Dunkelheit unter Verwertung von organischem Kohlenstoff. So ist auch das Genom dieses Stamms seit über 20 Jahren bekannt (siehe Kaneko et al., Sequence Analysis of the Genome of the Unicellular Cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC6803. II. Sequence Determination ofthe Entire Genome and Assignment of Potential Protein-coding Regions, DNA Res. 3, 109-136(1996)).

Seit wenigen Jahrzehnten ist es möglich, gezielte Veränderungen im Genom von Zellen und im Speziellen auch in jenem von Mikroorganismen, mittels ortsspezifischer Mutagenese (site-directed mutagenesis) herbeizuführen. Damit können gezielt einzelne Nukleinbasen eines Gens ausgetauscht oder auch ganze Gene entfernt werden. Dieses Verfahren ist eine inzwischen weit verbreitete Methode in der Molekularbiologie und reicht von der Veränderung eines Gens auf einem Plasmid bis hin zur KnockoutMaus.

Im Laufe der Zeit wurde eine Vielzahl von Methoden entwickelt. Dazu zählen beispielsweise die Kassettenmutagenese, Primer-Extension-Mutagenese, Ligation-DuringAmplification (QuikChange), Megaprimer-Mutagenese und die Overlap-ExtensionPCR (siehe z.B. Ling und Robinson, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal. Biochem. 254, 157-178 (1997)). Allen Verfahren ist die Verwendung von mindestens einem synthetischen, eine Mutation beinhaltenden Oligonukleotid und der Einsatz einer zu mutierenden DNA als Vorlage, in der Regel ein Plasmid, gemein. Vorder Transformation der mutierten DNA in Bakterien kann man nicht-mutierte AusgangsDNA zerstören. Dazu wird das Restriktionsenzym Dpnl hinzugegeben. Es schneidet und zerstört DNA, die aus Organismen kommt, weil bei der statistisch häufig vorkommenden DNA-Sequenz GATC Adenin methyliert ist. Die mutierte, durch PCR erzeugte DNA bleibt bestehen, da sie am Adenin unmethyliert ist.

-23/29 • · · · ·· Λ

Generell ist die Genmanipulation von Cyanobakterien im Vergleich zu Pflanzen und Algen deutlich einfacher, und es ist möglich, zahlreiche der Methoden, die anhand von Modellorganismen wie etwa Escherichia coli entwickelt wurden, gleichermaßen für die Manipulation von Cyanobakterien einzusetzen (siehe z.B. Heidorn et al., Synthetic Biology in Cyanobacteria, Methods in Enzymology (Elsevier), S. 539-579 (2011)). Im Allgemeinen kann homologe Rekombination in Verbindung mit natürlicher Transformation eingesetzt werden, um gezielt ein spezielles Genom eines Cyanobakteriums mittels Deletion, Insertion oder Punktmutation zu verändern, wie z.B. durch Nukleotidänderungen, die Aminosäureänderungen zur Folge haben (siehe z.B. Lan und Wei, Metabolie engineering of cyanobacteria forthe photosynthetic production of succinate, Metab. Eng. 38, 483-493 (2016)).

Zudem können neuerdings CRISPR/Cas9-basierte Verfahren eingesetzt werden, um die Auswirkungen von Geninaktivierung zu untersuchen (siehe z.B. Yao et al., Multiple Gene Repression in Cyanobacteria Using CRISPRi, ACS Synth. Biol. 5, 207-212 (2016); Beispiele für erfolgreiche Genmanipulationen umfassen z.B. verbesserte Lichtausbeuten, erhöhte RuBisCO-Aktivität, d.h. eine Steigerung der Aktivität des Enzyms Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/-oxygenase (RuBisCO), das dafür verantwortlich ist, dass photosynthetisch aktive Bakterien (und auch Pflanzen) überhaupt zur Aufnahme von CO2 in der Lage sind, sowie die Einführung heterologer Biosynthesewege (siehe z.B. Gomaa et al., Metabolie engineering of Cyanobacteria and microalgae for enhancedproduction of biofuels and high-value products, J. Appl. Microbiol. 121,919931 (2016); Lan und Wei, s.o.; Li et al., s.o.; Masukawa et al., Genetic Engineering of Cyanobacteria to Enhance Biohydrogen Production from Sunlight and Water, AMBIO 41,169173 (2012); und Ramey et al., Genome Engineering in Cyanobacteria: Where WeAre and Where We Need To Go, ACS Synth. Biol. 4, 1186-1196 (2015)).

Auch zur Produktion von Biodiesel, d.h. Ci6-Ci8-Fettsäuremethylestern, werden inzwischen genmanipulierte Cyanobakterien herangezogen, wobei die wichtigsten Ansatzpunkte der synthetischen Biologen bisher die Effizienzsteigerung der Photosynthese und eine verbesserte Aufnahme von Kohlendioxid waren, um erhöhte Ausbeuten an Biodiesel zu erzielen, während neuerdings die nicht-oxidative Glykolyse den Verlust -34/29 ·· ·· · ···· ·· · • ·· ··· ·· · · • · · · · ····· • · ♦ · · ········ ···· ··♦ · · • * ·♦ ··· ·· · · » von Kohlenstoff-Bausteinen während der Biosynthese verringern und die BiodieselProduktion noch effizienter gestalten soll (Bogorad et al., Synthetic non-oxidative glycolysis enables complete carbon Conservation, Nature 502, 693-697 (2013)).

Allerdings produzieren Cyanobakterien auch ohne Genmanipulation natürliche Energiespeichermoleküle. Im Licht wird dazu CO2 im Calvin-Zyklus assimiliert und im reduktiven Pentosephosphatzyklus in Kohlenhydrate, wie z.B. Zellwandkomponenten und Energiespeicherstoffe, umgewandelt. Im endogenen Dunkelstoffwechsel (Erhaltungsstoffwechsel) werden diese Energiespeicherstoffe im oxidativen Pentosephosphatweg abgebaut, das entstehende NADPH über die Atmungskette mit molekularem Sauerstoff oxidiert und dabei Energie (ATP) gewonnen. In gleicher Weise verläuft der Energiegewinn bei den Arten, die im Dunkeln auch Glucose als exogenes Substrat verwerten können. Als Energiespeicherstoff dient dabei vor allem Glykogen, aber auch andere Makromoleküle wie etwa Polyhydroxyalkanoate (PHA), z.B. Polyhydroxybutyrat (PHB), deren kommerzielle Verwertung ebenfalls lohnenswert erscheint.

So offenbart beispielsweise die WO 2015/083769 A1 ein Verfahren zur Steigerung der Produktion von PHA, unter anderem auch PHB, durch Einführung eines für Acetoacetyl-CoA kodierenden Gens in Cyanobakterien des bekannten Stamms Synechocystis sp. PCC6083. Und WO 2014/142051 A1 offenbart Cyanobakterien, die das Gen rre37 überexprimieren und dadurch verstärkte Produktion von PHA und u.a. PHB zeigen, wobei wiederum der Stamm Synechocystis sp. PCC6083 erwähnt wird.

Darüber hinaus offenbart die koreanische Patentanmeldung KR 2003/0087868 A die Genmanipulation des Stamms Synechocystis sp. PCC6083 zur Erhöhung der PHBProduktion, indem aus Zellen dieses Stamms das für Katalase A kodierende Gen CTA1 isoliert und beschädigt wurde, das beschädigte Gen in einen Vektor inseriert wurde, damit das Plasmid pGEM Z konstruiert wurde und Synechocystis sp. PCC6083 durch Rekombination mit dem Plasmid pGEM Z transformiert wurde. Dabei wurde eine Mutante Synechocystis sp. PCC6083 ACtal (KCTC 10247BP) mit erhöhter PHB-Produktivität erhalten.

-45/29 ·· 9 9999 99 9

99 99 99

Ziel der Erfindung war vor diesem Hintergrund die Erzeugung eines weiteren mutierten Cyanobakteriums, das erhöhte PHB-Produktion zeigt.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Dieses Ziel erreicht die vorliegende Erfindung durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Erhöhung der durch Photosynthese produzierten Menge eines Expressionsprodukts in einem Cyanobakterium durch Manipulation des Erbmaterials des Bakteriums, indem das Erbmaterial eines den Energiespeicherstoff Polyhydroxybutyrat, PHB, produzierenden Cyanobakteriums manipuliert wird, um die Menge an produziertem PHB zu erhöhen, mit dem Kennzeichen, dass in einem das phosphatspezifische Transportsystem, PST, umfassenden Cyanobakterium eine Genmanipulation durch ortsspezifische Mutagenese oder Zufallsmutagenese in dem für ein PST-Protein kodierenden Gen pstA durchgeführt wird, um die Phosphataufnahmefähigkeit des Bakteriums und dadurch die PHB-Expression zu erhöhen.

Die Erfinder haben nämlich im Zuge ihrer Forschungen völlig überraschenderweise festgestellt, dass nicht - wie der Fachmann vermutet hätte - eine Manipulation in einem für die Carbonataufnahme oder CO2-Assimilation oder direkt für die PHB-Synthese verantwortlichen Gen eine Erhöhung der PHB-Produktion bewirkt hat, sondern in einem für die Phosphataufnahme, genauer gesagt den Phosphattransport oder phosphatspezifischen Transport, PST, verantwortlichen Gen, nämlich pstA.

Dieses Gen pstA ist (genau wie pstB und pstC) Teil eines Operons, das die Phosphataufnahme und dessen Transport in Bakterienzellen steuert. Dabei kodiert das Gen pstA für das Zellmembran-Permeaseprotein PstA, das für die Permeation von Phosphat durch die Zellmembran in die Zelle verantwortlich ist. Dieses Transportsystem ist bereits aus sehr frühen Studien mit E. co//-Zellen bekannt und ist in verschiedensten Bakteriengattungen, insbesondere in Cyanobakterien, weit verbreitet. Für die beiden gut erforschten Gattungen Synechococcus und Synechocystis wurden zum E. coliSystem homologe Systeme gefunden, wobei speziell für Synechocystis sogar zwei zum PST-System homologe Operons (sl 10679-0684 und slr1247-1250) beschrieben wurden (siehe Μ. Dignum et al., Nutrient limitation offreshwater cyanobacteria: tools -56/29 to monitor phosphorus limitation at the individual level, Harmful Cyanobacteria (Aquatic Ecology Series), J. Huisman, H.C.P. Matthijs, P.M. Visser (Hrsg.), 1. Aufl., S. 6577, Springer (2005); D. Bhaya et al., Molecular responses to environmental stress, The Ecology of Cyanobacteria: Their Diversity in Time and Space, B.A. Whitton und Μ. Potts (Hrsg.), Kluwer Academic Pubilshers, S. 397-442 (2002)).

Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, nehmen die Erfinder an, dass durch die so erhöhte Phosphataufnahme in den eingangs erwähnten oxidativen Pentosephosphatweg eingegriffen wird, so dass es zu einer verstärkten Hydrolyse des zuvor gebildeten Glykogens und infolgedessen zu einer Anhäufung des alternativen Energiespeicherstoffs PHB kommt. Eine nähere Erklärung folgt in den späteren Ausführungsbeispielen.

Die erfindungsgemäße Manipulation des Gens pstA kann entweder mittels ortsspezifischer Mutagenese oder mittels Zufallsmutagenese erfolgen, was in beiden Fällen sowohl Vor- als auch Nachteile mit sich bringt. Einerseits ist zielgerichtetes genetic engineering von Bakterien-DNA für Fachleute auf diesem Gebiet inzwischen alltägliche Routine geworden, so dass es für den Fachmann ein Leichtes ist, unter den eingangs zitierten Herangehensweisen die für die ortsspezifische Mutagenese dieses Gens optimale Methode zu ermitteln. Deren großer Vorteil gegenüber der Zufallsmutagenese läge natürlich in der Reproduzierbarkeit des Verfahrens für jeden einzelnen Ansatz. Siehe auch die eingangs zitierte KR 2003/0087868 A.

Speziell die Mutagenese von Cyanobakterien ist allerdings deutlich komplexer als jene vieler anderer Bakterienabteilungen, wobei das Hauptproblem darin besteht, dass Cyanobakterien mehrere Kopien ihres Genoms in einer einzigen Zelle enthalten können. Dadurch ist es selbst mit den Methoden zielgerichteter Mutagenese nicht allzu einfach, definierte Mutationen dieses speziellen Gens stabil herbeizuführen.

Demgegenüber sind zwar die Resultate von Zufallsmutagenese nicht vorhersagbar und für einzelne Mutationsvorgange schon gar nicht reproduzierbar. Allerdings ist die

-67/29

Durchführung zahlreicher Runden von Mutation und Screening für synthetische Biologen heutzutage ebenfalls schon Routine und mit einer riesigen Anzahl an Proben gleichzeitig in kurzer Zeit zu bewerkstelligen, zumal Hochdurchsatz-Screening zum Standard geworden ist und inzwischen Mikrotiterplatten mit hunderten von Wells (z.B. 384 oder sogar 1536 Wells) zur Verfügung stehen. Dadurch erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass zumindest eine der zahlreichen, gleichzeitig erzeugten Mutanten die gewünschte Mutation im betreffenden Gen trägt und folglich im Screening auf die PHB-Produktion deutlich erhöhte Mengen dieses Stoffwechselprodukts aufweist, enorm.

Dazu kommt, dass gentechnisch veränderte Mikroorganismen in den meisten Ländern nur in geschlossenen Systemen (Fermentern, Photobioreaktoren) eingesetzt werden dürfen. Durch den Einsatz von natürlicher, zufälliger Mutation ist eine Zulassung für offene Systeme, wie z.B. Teiche und Open-raceway-pond-Reaktoren oder Dünnschichtsysteme, möglich, was zu Kosten- und Energieeinsparungen führt. Da sich die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Mutanten zudem als robuster in Bezug auf schwankende Umgebungsbedingungen erwiesen haben, sind sie für offene Systeme besser geeignet als der jeweilige Wildtyp, zumal große, offene Zuchtsysteme starke Unterschiede in Temperatur, pH-Wert, Salzgehalt und anderen Parametern im Verlauf von Tag und Nacht zeigen.

Aus diesen Gründen ist gemäß vorliegender Erfindung die Zufallsmutagenese die zu bevorzugende Methode, um das Gen pstA zu manipulieren.

Daher wird in bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens die Manipulation mittels Zufallsmutagenese durchgeführt, indem

a) Bakterienzellen in Parallelansätzen mutagener UV-Strahlung ausgesetzt werden; und

b) die dadurch erhaltenen Mutanten Bedingungen ausgesetzt werden, die zur PHBExpression geeignet sind, und anschließend auf die dadurch produzierte Menge an PHB gescreent werden; wobei

-78/29 * » • ·· · die Schritte a) und b) vorzugsweise wiederholt und die Zellen somit mehreren Runden von Mutagenese, PHB-Produktion und anschließendem Screening unterzogen werden, wobei jeweils jene Mutante, die im Screening auf die Menge an PHB das beste Ergebnis zeigt, einerweiteren Runde unterzogen wird.

Auf diese Weise ist es den Erfindern gelungen, bereits nach nur einer Runde von Mutagenese und Screening Mutanten zu erhalten, die aufgrund einer Mutation im Gen pstA nahezu das Fünffache der vom Wildtyp produzierten Menge an PHB produzieren, wie in den späteren Beispielen belegt wird.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen werden die Schritte a) und b) wiederholt, bis die PHB-Produktion bezogen auf die spezifische Produktleistung (Raum-ZeitAusbeute) und/oder den PHB-Gehalt im Wesentlichen ein Maximum erreicht hat. Die Erfinder haben nämlich festgestellt, dass die von den Zellen speicherbare Menge an PHB limitiert ist und zudem mit der Menge an gespeichertem Glykogen zusammenhängt. Offenbar gibt es für die speicherbare Gesamtmenge an Glykogen und PHB zusammen eine (vom Mikroorganismus abhängig) definierte Obergrenze, die bei dem in den Beispielen verwendeten Synechocystis-Siamm bei etwa 90 % der Trockenmasse der Zellen lag. Aus diesem Grund wird es bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Regel völlig ausreichend sein, die Bakterienzellen zwei oder drei Runden von Mutation und Screening zu unterziehen, bis diese Obergrenze erreicht ist.

Weiters werden in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zur Steigerung der Effizienz des Verfahrens die Mutanten in Schritt b) zunächst unter vorbestimmten Bedingungen kultiviert, bis die Biomassekonzentration im Wesentlichen ein Maximum erreicht hat, bevor sie den Bedingungen zur PHB-Produktion ausgesetzt werden.

Die zur PHB-Produktion geeigneten Bedingungen in Schritt b) sind vorzugsweise nährstofflimitierte Bedingungen, die die Produktion von PHB als Energiespeichermolekül begünstigen, noch bevorzugter stickstofflimitierte Bedingungen, unter denen Glykogenphosphorylase Glykogen zu Glucose-1-phosphat spaltet, das in der Folge unter

-89/29

Glykolyse zu Pyruvat/Acetyl-CoA verstoffwechselt wird und in dieser Form für die PHBSynthese zur Verfügung steht.

Vorzugsweise werden gemäß vorliegender Erfindung Zellen von Cyanobakterien der Gattung Synechococcus oder Synechocystis mutiert, da für Vertreter dieser beiden Gattungen das Genom bereits vollständig sequenziert wurde und inzwischen gut erforscht ist. Noch bevorzugter werden Zellen des Stamms Synechocystis sp. PCC 6714 mutiert, da die Erfinder mit damit ausgezeichnete Ergebnisse erzielt haben. Aufgrund weitgehender Homologien des PST-Systems unter den Cyanobakterien soll die vorliegende Erfindung jedoch nicht auf diese beiden Gattungen und schon gar nicht auf den in den Beispielen eingesetzten Stamm eingeschränkt sein, zumal anzunehmen ist, dass das erfindungsgemäße Verfahren mit im Wesentlichen allen Cyanobakterien durchführbar sein wird, deren Phosphataufnahme über das PST-System gesteuert wird und die daher ein pstA- oder ein dazu homologes Gen aufweisen. Weiters ist davon auszugehen, dass die Erfindung auch mit solchen Cyanobakterien durchführbar ist, deren Expressionsprodukt nicht - oder nicht nur - PHB, sondern (auch) ein anderes Polyhydroxyalkanoat, wie z.B. Polyhydroxyvalerat oder -propionat, oder ein Copolymer mehrerer Hydroxyalkansäure-Monomere ist und deren Produktivität auf analoge Weise durch Manipulation des pstA- oder eines dazu homologen Gens gesteigert werden kann. Auch solche Cyanobakterien sollen im Schutzumfang der Erfindung liegen.

Das Screening kann gemäß vorliegender Erfindung auf jede bekannte Weise erfolgen, z.B. mittels Infrarot- oder Ramanspektroskopie, vorzugsweise allerdings mittels Hochdurchsatz-Screening, wie zuvor erwähnt, und noch bevorzugter mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie nach Einfärbung des PHBs.

In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine spezifische, durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugte Synechocystis-Mutante, nämlich den gemäß dem Budapester Vertrag bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institut Pasteur unter der Zugriffsnummer No. I-5255 hinterlegten mutierten Synechocystis sp. PCC 6714-Stamm.

-910/29 • · • · • · · • · · • · · • 9 9

Und in einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines durch das erfindungsgemäße Verfahren manipulierten Cyanobakteriums, vorzugsweise von Zellen des obigen, unter der Zugriffsnummer No. 1-5255 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institut Pasteur hinterlegten mutierten Synechocystis sp. PCC 6714-Stamms, zur Produktion von Polyhydroxybutyrat, PHB, durch anfängliche Vermehrung des Mikroorganismus, anschließende Kultivierung des vermehrten Mikroorganismus unter für die PHB-Produktion geeigneten Bedingungen, vorzugsweise stickstofflimitierten Bedingungen, und darauf folgende Gewinnung des PHB aus den Zellen.

In manchen Ausführungsformen der Erfindung können auch zusätzlich zu oder anstelle von PHB-Homopolymeren Copolymere produziert werden, indem während der Kultivierung des vermehrten Mikroorganismus unter für die PHB-Produktion geeigneten Bedingungen gezielt verwertbare Comonomere, wie z.B. Valeriansäure, zugesetzt werden, wodurch das mutierte Cyanobakterium zur Produktion verschiedener Biopolymere genutzt werden kann.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher beschrieben, die Folgendes zeigen.

Fig. 1 zeigt jene zufallsmutierten Kolonien des Cyanobacterienstamms Synechocystis sp. PCC 6714, die einen gegenüber dem Wildtypstamm einen höheren PHB-Gehalt zeigten. Die Kolonien wurden nach 4 d Stickstoff- und Phosphorlimitierung unter Verwendung von CO2 als Kohlenstoffquelle auf den PHB-Gehalt gescreent.

Fig. 2a und 2b: Fig. 2a stellt die Wachstumskurven für zweistufige Kultivierungen der drei zufallsmutierten Kolonien MT_a15, MT_a16, MT_a24 und des Wildtyp-Stamms Synechocystis sp. PCC 6714, kultiviert in Eppendorf 250 ml Dasbox Mini-BioreaktorSystemen unter kontrollierten Bedingungen und mit CO2 als Kohlenstoffquelle dar. Die zufallsmutierten Kolonien MT_a24 und MT_a15 zeigen im Vergleich zum WildtypStamm ein gesteigertes Biomassewachstum. (Die vertikale Linie zeigt den Beginn der

-1011/29 ···♦ ·· · • · · ·

Limitierungsphase.) Fig. 2b zeigt die PHB-Akkumulation in den drei zufallsmutierten Kolonien und im Wildtyp-Stamm unter Stickstoff- und Phosphorlimitierung. Die beiden Kolonien MT_a24 und MT_a15 zeigen eine gegemüber dem Wildtyp gesteigerte PHBProduktion. Die Mutante MT_a16 zeigt hingegen eine niedrigere PHB-Produktion als der Wildtyp-Stamm.

Fig. 3 zeigt die volumetrische Kohlenstoff- (CO2-) Aufnahmerate während der Kultivierung von drei zufällig mutierten Kolonien und des Wildtypstamms unter kontrollierten Bedingungen in Eppendorf 250-ml-Dasbox Mini-Bioreaktor-Systemen während des Wachstums auf kompletten BG-11-Medien und CO2 als Kohlenstoffquelle und unter Stickstoff- und Phosphor-Limitierung.

Fig. 4 zeigt die spezifische PHB-Produktionsrate für die Mutanten MT_a16, MT_a15 und MT_a24 und den Wildtypstamm. Die Mutanten MT_a24 und MT_a15 zeigen eine gesteigerte spezifische PHB-Produktivität.

Fig. 5 zeigt die Stabilität der Mutante MT_a24 in einer Vierfach-Kultivierung. Der PHBGehalt erreichte nach 450 h Kultivierung etwa 40 % DCW.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand konkreter Ausführungsbeispiele detaillierter beschrieben, das jedoch nur zur Illustration dient und nicht als Einschränkung zu verstehen ist.

Erste Runde von Zufallsmutagenese, Kultivierung, PHB-Produktion, Screening Erzeugung erster Mutanten

Eine axenische Kultur des Wildtypstamms Synechocystis sp. PCC 6714 wurde von der Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria (Institut Pasteur, Paris, Frankreich) bezogen. Wenn nicht anders angegeben wurde Synechocystis sp. PCC 6714 in BG-11Medium (Rippka et al., J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979)), ergänzt mit 10 mM HEPES-Puffer, pH 8,2, unter Zugabe von 15 g/l Kobe-Plattenagar und 5 mM NaHCCh

-11 12/29 ·· ·· · ···· ·♦ · ······ ···· • ♦ · · · · · · · · • · · · · · ··· ···· ··♦· · · · · · ♦· ♦♦ ♦·· ·· ·· · als Kohlenstoffquelle vor der Inokulation gezüchtet. Um Stickstoffmangel zu induzieren, wurden Zellen in BG-11-Medium ohne Nitrat und Ammoniak kultiviert. Ammoniumeisen(lll)-citrat und Co(NÖ3)2-6H2Ö wurden durch in Bezug auf den Eisen- und Cobaltgehalt äquimolare Konzentrationen von Eisen(lIl)-citrat und CoCb-ßhhO in ersetzt. Zur Phosphorlimitierung wurde KH2PO4 durch eine in Bezug auf den Kaliumgehalt äquimolare Konzentration von KCl ersetzt (Panda et al., Bioresource Technol. 97, 12961301 (2006)).

Etwa 10000 Zellen aus der späten logarithmischen Phase wurden auf Agarplatten ausplattiert und bei 28 ± 2 °C unter kontinuierlicher Beleuchtung mit 50 ± 5 pmol Photonen /m²/s in photosynthetisch aktiver Strahlung (PAR) in einem Inkubator (Infors, Schweiz) inkubiert. Sobald Kolonien sichtbar waren, wurden die Platten monochromatischem UV-Licht mit einer Wellenlänge von 254 nm bei Raumtemperatur ausgesetzt. Die Dauer und Entfernung des UV-Lichts wurde in Bezug auf die Lebensfähigkeit optimiert. Nach der Bestrahlung wurden die Platten mindestens 72 h lang im Dunkeln gelagert, um lichtinduzierte Reparaturmechanismen zu reduzieren. Anschließend wurden die Platten weitere 120 h lang unter kontinuierlicher Beleuchtung inkubiert. Die mutierten Kolonien wurden aus den Platten entfernt und in flüssigen Medien auf 6-Well-Platten von Greiner CELLSTAR® (Merck, Österreich) kultiviert. Nach 96 h Inkubation wurden die Kolonien, die im Vergleich zum Wildtyp gesteigertes Wachstum zeigten, durch Messen der OD750 unter Verwendung eines Infinite-200-Mikroplattenlesers (TECAN, Schweiz) gescreent. Die Zellen wurden durch Zentrifugation mit 5000 g bei Raumtemperatur geerntet und in Medien ohne Stickstoff und Phosphor resuspendiert. Der PHBGehalt wurde nach 4 und 7 d der Limitierung bestimmt.

Ergebnisse:

Durch die UV-Bestrahlung waren über 2000 Mutanten erzeugt worden, die alle mit dem Wildtyp-Stamm Synechocystis sp. PCC 6714 als Referenz auf Wachstum gescreent wurden. 850 Mutanten mit gegenüber dem Wildtyp gesteigerter Biomassekonzentration wurden auf ihre Akkumulation von PHB näher untersucht. Insgesamt zeigten 14 Mutanten einen signifikanten PHB-Gehalt und wurden für weitere Studien ausgewählt.

-1213/29

• ·	• ·	• ····	99	9
• ·	• ·	·· ·	9 9	9
• ·	! ·	• ·	• 9	9 9
• ·		• ·	999	9999
• ·	9 ·	• · ·	9	9
··	99	•99 99	99	9

Wie in Fig. 1 gezeigt, zeigten die Mutanten MT_a16 und MT_a37 einen bis zu 5-fachen Anstieg des PHB-Gehalts im Vergleich zu dem Wildtyp Synechocystis sp. PCC 6714, basierend auf dem Trockenzellgewicht (dry cell weight, DCW). Die Mutanten MT_a24, MT_a15, MT_c25 und MT_b34 zeigten im Vergleich zum Wildtyp auch einen 4-mal höheren PHB-Gehalt. Darüber hinaus zeigten Schüttelkolben-Kultivierungen dieser sechs Mutanten das Potential der drei Mutanten MT_a24, MT_a15 und MT_a16 für die PHB-Produktion, die für anschließende Bioreaktor-Kultivierungen ausgewählt wurden.

Charakterisierung und Verfizierung der Mutanten

a) Kultivierung im Multi-Bioreaktorsystem

Jene Kolonien, die nach 4 d Limitierung einen maximalen PHB-Gehalt zeigten, wurden für weitere Studien in Photobioreaktoren ausgewählt. Bioreaktor-Experimente wurden unter sterilen Bedingungen in einem DASbox Mini Bioreaktor-System (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) mit einem maximalen Arbeitsvolumen von 250 ml durchgeführt. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 0,5 M HCl oder NaOH zu den Reaktoren mit einem DASGIP MP Multi-Pump-Modul (Eppendorf AG, Deutschland) bei 8,5 gehalten. Das Rühren erfolgte mit 300 U/min, und durch die Reaktoren wurde ein Gemisch aus sterilfiltrierter Luft und 2 % CO2 mit einer Durchflussrate von 6 l/h hindurchperlen gelassen. Die Beleuchtung erfolgte mit LED-Streifen, die um die Reaktorgefäße gewickelt waren und eine Lichtintensität von 60 pmol/m²/s Photonen an PAR lieferten. Die fünf M18-Ports wurden mit einem pH-DO120-Sensor (Hamilton, Reno, NV, USA), einem OD-Sensor (Eppendorf DASGIP OD4-Modul, 880 nm), Gaseinlass und Gasauslass versehen. Die Abluft wurde mit einem DASGIP GA4 Gassensor-Modul (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) mit einem ZrO2-Sensor für O2- und InfrarotCO2-Sensortechnologie analysiert. Alle Fermentationsparameter und variablen PumpSollwerte wurden mit dem DASware Kontrollsystem (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) kontrolliert.

Ergebnisse:

Zur Untersuchung der Wachstumskinetik und PHB-Produktivität der drei besten Mutanten MT_a15, MT_a16, MT_a24 und des Wildtypstamms Synechocystis sp. erfolgte -1314 / 29 ·· ·· • ·· • ·* • ·· • ·· ·♦·· ·♦ · ♦ · · ·

eine zweistufige Kultivierung von PCC 6714 (Stufe 1: Wachstum in vollständigen Medien, Stufe 2: Stickstoff- und Phosphor-Limitierung) wurde unter den kontrollierten Bedingungen eines Multi-Bioreaktorsystems durchgeführt. Die in Fig. 2a dargestellten Ergebnisse zeigen, verglichen mit dem Wildtyp, gesteigertes Biomassewachstum für zwei Mutanten, nämlich MT_a24 und MT_a15, sowohl unter normalen als auch unter limitierenden Wachstumsbedingungen. Die Mutante MT_a16 zeigte eine geringere Biomassekonzentration als der Wildtypstamm und die beiden Mutanten MT_a24 und Mt_a15. Die maximale volumetrische Biomasseproduktion für MT_a24 betrug 3,6 g/l nach 283 h Kultivierung und 3,8 g/l für MT_a15. Der Wildtyp erreichte eine Biomassekonzentration von 2,4 g/l und MT_a16 mit 2 g/l zeigte minimales Biomassewachstum. Der maximale PHB-Gehalt für MT_a24 von 25 % (DCW), wie in Fig. 2b gezeigt, wurde nach 500 h erreicht, und MT_a15 erreichte 17 % nach etwa 470 h, wobei der Wildtyp nach 405 h Kultivierung nur 14 % PHB erreichte. Die maximale volumetrische PHBProduktivität, die für die Mutante MT_a24 erhalten wurde, betrug 735 mg/l nach 426h, für Mutante MT_a15 530 mg/l und für den Wildtyp 297 mg/l. Die Mutante MT_a16 erreichte hier den niedrigsten PHB-Gehalt von 233 mg/l.

Die Analyse der erhaltenen Abluft-Signale aus den Bioreaktoren zeigte eine gesteigerte volumetrische CO2-Aufnahmeratefürdie beiden Mutanten MT_a24 und MT_a15. Wie in Fig. 3 und Fig. 4 gezeigt, wiesen MT_a16 und der Wildtyp eine geringere CO2Aufnahmerate und spezifische Produktionsrate von PHB als Produkt auf. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit den und sind eine Erklärung für die früheren Beobachtungen von gesteigertem PHB-Gehalt und Biomassewachstum für die zwei Mutanten MT_a24 und MT_a15, bei denen höhere CO2-Aufnahmeraten und spezifische Produktivitäten mittels UV-Mutationen erzielt wurden.

b) Mutantencharakterisierung

Der Phänotypisierungstest wurde für den Wildtyp und die unter Berücksichtigung aller bisherigen Ergebnisse beste Mutante MT_a24 unter Verwendung des HochdurchsatzPhänotypisierungs-Mikroarrays von Biolog OmniLog (Biolog, Hayward, CA, USA) durchgeführt. Der Zellmetabolismus wurde auf Biolog-96-Well-Mikrotiterplatten PM1

15/29 ···· • · ·· : :::

• · ·· ···» ···♦ • · ·· ·· · •· · • · ·· ··· ···· • · ·· · bzw. PM3B für Kohlenstoff- und Stickstoffquellen getestet und beruhte auf den erzeugten Wachstumskurven. Diese Mikrotiterplatten-Assays basieren auf der Verwendung einer 96-Well-Platte mittels vorgelegter Stickstoff- und Kohlenstoffsubstrate wie etwa Kohlenhydraten, Aminosäuren und Carboxylverbindungen. In dieser Studie wurden die Zellen in 1/10-BG-11-Medien mit einer Biomassekonzentration entsprechend OD750 = 0,1 suspendiert und 90 pl davon wurden in jeden Well gefüllt, und die Platten wurden bei 28 °C unter Rühren mit 150 U/min und kontinuierlicher Beleuchtung mit 30 pmol/m²/s in einem Schüttelinkubator (Infors, Schweiz) inkubiert. Das Wachstum wurde täglich überwacht, und Substrate, die das Wachstum verbesserten, wurden aus Dreifachansätzen ausgewählt.

Ergebnisse:

Allgemein zeigte die Mutante MT_a24 bei den meisten N- und C-Quellen ein gesteigertes Wachstum, was auf eine signifikant bessere Eignung zur Kultivierung hindeutet als der Wildtypstamm. Die signifikanten N- und C-Quellen, bei denen der Unterschied in der OD750 nach 144 h Kultivierung mehr als 0,15 und P < 0,05 betrug, waren Nitrat und Nitrit bzw. D-Psicose und Glycyl-L-glutaminsäure.

c) Genetische Untersuchung

Die Genexpressionsniveaus wurden durch genspezifische quantitative Echtzeit-PCR unter Verwendung von Luna Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs, USA) und 100 nM Primer im System bestimmt. Die Genomsequenzierung wurde von Microsynth Austria GmbH (Wien, Österreich) durchgeführt, und der Nachweis von starken Modifikationen im Genom erfolgte unter Verwendung des CLC Sequence Viewer 7 Workbench (Qiagen Bioinformatics, CA, USA).

Ergebnisse:

Die quantitative Echtzeit-PCR von mehr als zwanzig Genen für den Wildtyp und die Mutante MT_a24 zeigte eine Hochregulierung der folgenden Gene cmpB, cmpA und cmpC, die für den Bicarbonattransport in die Cyanobakterienzellen verantwortlich sind. Überraschenderweise zeigten die für die PHB-Biosynthese verantwortlichen Gene keinerlei Veränderung der Expressionsniveaus. Eine Überexpression des rbcL-Gens, das

-1516/29 ·· ·· · ···· ·· · • · · · ···· ·· • · · < ♦ · · · · · • · · · · ······· • · · · ··· ·φ ·· ·♦ ··· ·· «·φ für langkettigen Rubisco kodiert wurde für die Mutante MT_a24 ebenfalls beobachtet. Die Analyse der metabolischen Gene glgP, glgA, glgX und glgC zeigte eine Überexpression des glgP- (Glykogenphosphorylase-) Gens bei MT_a24. Glykogenphosphorylase ist ein Phosphorylaseenzym, das die Umsetzung von Glykogen zu Glucose1-phosphat katalysiert, wodurch die Verfügbarkeit von Pyruvat für die PHB-Synthese erhöht wird.

Der Mutantenstamm MT_a24 sowie der für die UV-Mutation verwendete Wildtypstamm wurden erneut sequenziert und (i) miteinander und (ii) mit der veröffentlichten Genomsequenz verglichen. Interessanterweise zeigte der Vergleich zwischen MT_a24 und dem Wildtyp und der veröffentlichten Genomsequenz keinen Unterschied für irgendein Gen, das mit der Carbonataufnahme oder der PHB-Bildung in Zusammenhang steht. Die einzige in einer kodierenden Sequenz festgestellte Nucleotidänderung, die zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz führte, war in der Sequenz für das Gen pstA, das für ein für die Phosphataufnahme in die Zelle verantwortliches Protein, PstA, kodiert.

Nichtsdestotrotz zeigt die Mutante MT_a24 eine gegenüber dem Wildtyp um mehr als das Vierfache erhöhte PHB-Produktion, was für den Fachmann durchaus überraschend war, da eher mit einer Mutation in einem mit der Carbonataufnahme oder der PHB-Produktion selbst in Verbindung stehenden Gen zu rechnen gewesen wäre.

Allerdings stimmt diese Beobachtung mit aus quantitativen PCR-Experimenten erhaltenen früheren Ergebnissen überein, die höhere Expressionslevel für Glykogenphosphorylase zeigen, da höhere Phosphataufnahme zu höherer intrazellulärer Phosphatverfügbarkeit führt und wiederum höhere Glykogenphosphorylase-Aktivität ermöglicht. Die PHB-Synthese in Cyanobakterien kann entweder über (i) Kohlenstoff aus CO2/ Carbonat im Calvin-Zyklus oder über (ii) intrazellulär gespeicherten Kohlenstoff aus Glykogen erfolgen. In beiden Fällen ist Acetyl-CoA der gemeinsame Vorläufer für die PHB-Synthese mit NAD(P)H als Co-Faktor.

-1617/29 ·· «· • · ·· · • · ·<

* fr ·· » · ·· ···· ··· • ·· · • ♦· · · • ··· ···· • · · ·

Glykogen wird hauptsächlich unter Stickstofflimitierung gespeichert und wird durch die Wirkung von Glykogensynthase oder Uridin-5'-diphosphoglucose synthetisiert. Glykogenphosphorylase ist ein Schlüsselenzym beim Glykogenabbau. Unter Nutzung von anorganischem Phosphat als Co-Substrat katalysiert es die Freisetzung von Glucose1-phosphat aus dem nicht-reduzierenden Ende des Polysaccharids (Diaz-Lobo et al., Selective photoregulierung ofthe activity of glycogen synthase andglycogen phosphorylase, two key enzymes in glycogen metabolism, Organic & Biomolecular Chemistry 13(26), 7282-7288 (2015)). Unter stickstofflimitierenden Bedingungen spaltet Glykogenphosphorylase Glykogen zu Glucose-1-phosphat, das anschließend bei der Glykolyse zu Pyruvat/Acetyl-CoA metabolisiert wird und somit für die PHB-Synthese zur Verfügung steht.

d) Kultivierung der Mutante MT_a24 unter optimierten Bedingungen

Wie in Fig. 5 gezeigt, lieferte die Kultivierung der Mutante MT_a24 in vierfacher Ausführung unter optimierten Bedingungen im Photobioreaktor 40 % DCW PHB, 50 % DCW Glykogen und eine Biomassekonzentration von 5 g/l.

Aus diesen Ergebnissen unter Verwendung eines in Bezug auf die PHB-Produktion verbesserten Mikroorganismus unter optimierten Produktionsbedingungen kann geschlossen werden, dass für die Summe der Konzentrationen von PHB und Glykogen ein Maximum existiert, das bei etwa 90-95 % der Zelltrockenmasse liegen dürfte. Somit gilt es bei der Durchführung abzuwägen, ob eine weitere Runde von Mutation und Screening den zusätzlichen Aufwand lohnt, falls in der ersten Runde bereits eine Mutante erhalten wurde, mit der ein nahe diesem Wert liegendes Ergebnis erzielbar ist.

Zweite Runde von Zufallsmutagenese, Kultivierung, PHB-Produktion, Screening Zur Untersuchung, ob mit den nach nur einer Mutationsrunde erhaltenen Mutanten MT_a24 und MT_a15 weitere Steigerungen der PHB-Produktion möglich sind, wenn diese Mutanten neuerlich mutiert werden, wurden beide derselben Prozessen wie zuvor unter Erzeugung erster Mutanten beschrieben erneut unterzogen.

-1718/29

Insgesamt wurden dabei vier, nämlich jeweils zwei, Mutanten mit gesteigertem Wachstum und PHB-Gehalt erhalten. In Tabelle 1 ist der PHB-Gehalt angeführt, der nach der ersten bzw. zweiten Mutationsrunde erhalten wurde.

Tabelle 1

Name	Name	max. PHB-Gehalt	max. PHB-Gehalt	Steigerung
der 1.	der 2.	nach 1. Runde	nach 2. Runde	durch
Mutante	Mutante	Mutation/Screening	Mutation/Screening	2. Mutation
		(% DCW)	(% DCW)	(%)
MT_a15	MT_ab_1	38	51	34,2
MT_a15	MT_ab_2	38	56	47,3
MT_a24	MT_ac_1	40	50	25,0
MT_a24	MT_ac_2	40	49	22,5

Somit war durch eine zweite Mutation tatsächlich noch eine Steigerung der PHBProduktion erzielbar, nämlich im Bereich von etwa 25 % für die nach einer Mutation bessere Mutante MT_a24 bis sogar knapp 50 % für die davor etwas schlechtere Mutante MT_a15.

Weitere Untersuchungen bezüglich des kombinierten Gehalts an PHB und Glykogen (in % DCW), des zugehörigen Grenzwerts sowie Gensequenzierungen der Doppelmutanten stehen derzeit noch aus.

Am 2. November 2017 wurde die Mutante MT_a24 als mutierter Synechocystis sp. PCC 6714-Stamm bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institut Pasteur unter der Zugriffsnummer CNCM I-5255 hinterlegt.

-1819/29

• · · · · ·· · • * · · · • ······ • · 9

Somit führt die gemäß vorliegender Erfindung herbeigeführte Mutation im Gen pstA zu einer höchst unerwarteten, aber industriell wertvollen Steigerung der PHB-Produktion. Aufgrund der ebenfalls festgestellten höheren Robustheit und Stabilität der Mutanten eignen sich selbige besser für die Kultivierung in offenen Systemen wie etwa Teichen oder Open-raceway-pond-Reaktoren, wodurch Kultivierungen in enorm großen Maßstäben möglich werden. Diese könnten in der Zukunft mitunter dazu beitragen CO2 aus der Atmosphäre zu binden oder auch direkt aus einer eigenen CO2-Zuleitung von einer Punktquelle, wie z.B. dem Abgas aus einem kalorischen Kraftwerk, das darin enthaltene CO2 zu sequestrieren. Außerdem können zusätzlich oder anstelle von Polyhydroxyalkanoat- und vor allem Polyhydroxybutyrat-Homopolymeren auch Copolymere derselben produziert werden, indem der Fermentationsbrühe während der PHA- oder PHB-Produktionsphase gezielt in der Natur seltenere oder unübliche Comonomere, dabei vor allem andere Hydroxyalkansäuren, wie z.B. Valeriansäure, zugesetzt werden, wie zuvor erwähnt.

Die vorliegende Erfindung stellt demnach durch die gezielte Mutation im pstA-Gen eine deutliche und wertvolle Verbesserung gegenüberden analogen, im Stand der Technik beschriebenen Versuchen dar.

Claims (15)

1. Verfahren zur Erhöhung der durch Photosynthese produzierten Menge eines Expressionsprodukts in einem Cyanobakterium durch Manipulation des Erbmaterials des Bakteriums, indem das Erbmaterial eines den Energiespeicherstoff Polyhydroxybutyrat, PHB, produzierenden Cyanobakteriums manipuliert wird, um die Menge an produziertem PHB zu erhöhen, dadurch gekennzeichnet, dass in einem das phosphatspezifische Transportsystem, PST, umfassenden Cyanobakterium eine Genmanipulation durch ortsspezifische Mutagenese oder Zufallsmutagenese in dem für ein PST-Protein kodierenden Gen pstA durchgeführt wird, um die Phosphataufnahmefähigkeit des Bakteriums und dadurch die PHB-Expression zu erhöhen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Manipulation mittels Zufallsmutagenese durchgeführt wird, indem

a) Bakterienzellen in Parallelansätzen mutagener UV-Strahlung ausgesetzt werden; und

b) die dadurch erhaltenen Mutanten Bedingungen ausgesetzt werden, die zur PHBExpression geeignet sind, und anschließend auf die dadurch produzierte Menge an PHB gescreent werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte a) und b) wiederholt und die Zellen somit mehreren Runden von Mutagenese, PHB-Produktion und anschließendem Screening unterzogen werden, wobei jeweils jene Mutante, die im Screening auf die Menge an PHB das beste Ergebnis zeigt, einerweiteren Runde unterzogen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte a) und b) wiederholt werden, bis die PHB-Produktion in Bezug auf die spezifische Produktleistung und/oder den PHB-Gehalt im Wesentlichen ein Maximum erreicht hat.

-21 21/29 «· ·· • · · ·

9 9 99 • 9 99

9999 ···· ·' 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutanten in Schritt b) zunächst unter vorbestimmten Bedingungen kultiviert werden, bis die Biomassekonzentration im Wesentlichen ein Maximum erreicht hat, bevor sie den Bedingungen zur PHB-Produktion ausgesetzt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zur PHB-Produktion geeigneten Bedingungen in Schritt b) nährstofflimitierte Bedingungen sind, die die Produktion von PHB als Energiespeichermolekül begünstigen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen der Gattung Synechococcus oder Synechocystis manipuliert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen der Gattung Synechocystis manipuliert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen des Stamms Synechocystis sp. PCC 6714 mutiert werden

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Screening mittels Hochdurchsatz-Screening erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Screening mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie nach Einfärbung des PHBs erfolgt.

12. Mutierter Synechocystis sp. PCC 6714-Stamm, hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institut Pasteur unter der Zugriffsnummer No. I-5255.

13. Verwendung eines durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 genmanipulierten Cyanobakteriums zur Produktion von Polyhydroxybutyrat, PHB, durch

22/29

·· ·· 9 9999 ·· • • · • 9 99 9 • · • • · • 9 9 • · • · • · • · 9 · ··· ···· • · • 9 • · · • • ·· 99 ··· ·· ·· •

anfängliche Vermehrung des Mikroorganismus, anschließende Kultivierung des vermehrten Mikroorganismus unter für die PHB-Produktion geeigneten Bedingungen und darauf folgende Gewinnung des PHB aus den Zellen.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen des mutierten Synechocystis sp. PCC 6714-Stamms nach Anspruch 12 als Mikroorganismus eingesetzt werden.

15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu oder anstelle von PHB-Homopolymeren Copolymere produziert werden, indem während der Kultivierung des vermehrten Mikroorganismus unter für die PHB-Produktion geeigneten Bedingungen gezielt ein oder mehrere verwertbare Comonomere, vorzugsweise andere Hydroxyalkansäure-Monomere, wie z.B. Valeriansäure, zugesetzt werden.