CN102703321A

CN102703321A - 一种筛选功能菌群的方法

Info

Publication number: CN102703321A
Application number: CN2012101774829A
Authority: CN
Inventors: 崔宗均; 王小芬
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明公开了一种筛选功能菌群的方法。该方法由如下步骤组成：1）选取含有功能菌群的基质；2）将所述基质接种于限制性培养基中进行培养，再传代培养；3）建立评价所述功能菌群功能的指标；在每代培养过程中检测所述指标和检测所述功能菌群中菌种组成是否稳定；4）若在某代培养过程中，所述指标符合对所述功能菌群的功能要求，且所述菌种组成稳定，则所述某代培养过程中得到所述功能菌群。本发明方法得到的功能菌群能够继续保持各种菌间的协同作用，组成稳定，功能强大，不会因为从自然界的分离而削弱作用力；另外，本发明方法操作简单、成本低廉，省时省力。因此，本发明方法在功能菌的筛选领域将会有广阔的应用前景。

Description

一种筛选功能菌群的方法

技术领域

本发明涉及一种筛选功能菌群的方法。

背景技术

目前菌种的筛选方法一般有如下两种：单一菌的纯化筛选和自然发酵物菌剂的筛选制备。单一菌的纯化筛选是根据所需的功能要求从自然界中分离、纯化，得到目的单一菌；自然发酵物菌剂筛选是将自然材料按一定比例混合堆积，使其在自然条件下缓慢发酵，得到自然发酵菌剂。但是上述两种菌筛选方法均有不足，影响其实际应用价值。单一菌在纯化过程中，一方面失去了与自然条件下长期处于协同关系的其它菌共存的机会，导致该单一菌功能大大降低；另一方面，单一菌的纯化使其对生长条件的适应范围越来越狭窄，对发酵条件要求高，发酵成本昂贵；再者，单一菌孤立生长，容易受到其它菌的污染和抑制，难以生长和发挥功能。自然发酵物菌剂中所含的菌种是在自然的被动发酵过程中无序地集合而成的多菌联合体，无法掌握其菌种组成，缺乏科学性，使用效果难以控制；而且自然发酵物菌剂的发酵过程遵循被动的自然循环规律，其分解效率低，效果不稳定。因此，为了提高生产效率，需要建立一种高效的菌筛选方法，使得到的菌保留原来功能、应用成本低且效果可控。

发明内容

本发明的发明人经过长期的研究，发现当微生物从原来栖息的生境中分离、纯化培养时许多功能被削弱或丧失。因此，多数微生物是形成一种特殊群体，依靠群体内部各成员的协同作用才充分发挥应有的功能的。由此，本发明发明人发明了如下保留协同作用菌群的菌分离方法。以微生物群的功能为核心，在不破坏功能群体的协同关系的前提下，采用各种限制性手段逐渐排除与功能无关的微生物种类，保留核心功能群体，定向驯化成高效而稳定的协同群体。其中的稳定包括微生物功能的稳定和菌种组成的稳定。功能稳定表现在经过多次的继代，菌种功能不退化并且抗逆性强（更广的pH适用范围、更广的适用温度等），菌种稳定性表现在经过多代的继代培养，菌种组成不发生变化。

本发明的一个目的是提供一种筛选功能菌群的方法。

本发明所提供的筛选功能菌群的方法，由如下步骤组成：

1）选取含有功能菌群的基质；

2）将所述基质接种于限制性培养基中进行培养，再传代培养；

3）建立评价所述功能菌群功能的指标；在每代培养过程中检测所述指标和检测所述功能菌群中菌种组成是否稳定；

4）若在某代培养过程中，所述指标符合对所述功能菌群的功能要求，且所述菌种组成稳定，则所述某代培养过程中得到所述功能菌群；

所述限制性培养基为所述功能菌群在其中生长而非所述功能菌群不在其中生长的培养基。

上述过程中，所述培养的条件与所述功能菌群在所述基质中生存的条件相同。所述培养的条件为温度、光照、厌氧或好氧等。

上述过程中，所述功能菌群具体可为分解木质纤维素的菌群。

上述筛选分解木质纤维素的菌群的过程中，所述基质可为秸秆柴垛腐烂的垛底、常年堆积的秸秆及树叶。

上述筛选分解木质纤维素的菌群的过程中，所述限制性培养基由终浓度为5g/L的蛋白胨、终浓度为1g/L的酵母提取物、终浓度为5g/L的NaCl、终浓度为1g/L的K₂HPO₄、终浓度为0.35g/L的MgSO₄·7H₂O、终浓度为3g/L的CaCO₃和终浓度为0.1g/L（作为底物）的秸秆组成；所述终浓度为各物质在所述限制性培养基中的浓度。

上述筛选分解木质纤维素的菌群的过程中，所述评价所述功能菌群功能的指标为秸秆分解率；所述指标符合对所述功能菌群的功能要求为秸秆分解率在所述传代培养的各代间稳定。

上述过程中，所述功能菌群还可为用于制备秸秆发酵饲料的菌群。

上述筛选用于制备秸秆发酵饲料的菌群的过程中，所述基质为农作物秸秆、农作物赖以生长的土壤或农作物秸秆与农作物赖以生长的土壤的混合物；所述培养基为R-MRS培养基。

上述筛选用于制备秸秆发酵饲料的菌群的过程中，所述评价所述功能菌群功能的指标为乳酸产率和pH值下降速度；所述指标符合对所述功能菌群的功能要求为：所述乳酸产率在所述传代培养的各代间稳定，和所述pH值下降速度12小时可将pH从6.4降至3.8。

上述任一所述过程中，所述检测所述功能菌群中菌种组成是否稳定的方法为在所述传代培养过程中，PCR扩增每代培养中的所述功能菌群的16S rDNA基因，得到各代的PCR扩增产物，比较各代的PCR扩增产物的图谱，若图谱稳定不变，则所述功能菌群中菌种组成稳定。

上述方法中，所述基质具体可以为根据所需要的功能从自然界中或其它环境中选择的具有所需功能菌群的基质，如菌群附着的材料（如枯枝烂叶、土壤、植物材料等）。上述方法中，是用适宜优势菌生长的限制性培养基进行选择培养来逐步淘汰功能弱、适应性弱的其它杂菌的，并且在培养基中添加1％--5％的秸秆、植物材料或待降解物作为底物；选择培养的条件需模拟所需功能菌群在基质中生存时的条件。上述方法中，所述指标，具体可以根据筛选目的而定，简便、直观更好。

实际应用中，本领域技术人员事先知道要筛选什么类型的功能菌群，如分解纤维素的菌群，通过现有技术也知道所要筛选的功能菌群适合什么培养基及适合什么培养条件。

本发明方法得到的功能菌群能够继续保持各种菌间的协同作用，组成稳定，功能强大，不会因为从自然界的分离而削弱作用力；另外，本发明方法操作简单、成本低廉，省时省力。因此，本发明方法在功能菌的筛选领域将会有广阔的应用前景。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、筛选分解木质纤维素的复合菌群

一、复合菌群的筛选

1、菌源

将秸秆柴垛的腐烂垛底作为菌源。

因为秸秆柴垛中的秸秆的主要成分是木质纤维素，柴垛腐烂表明是秸秆腐烂，进而说明是木质纤维素被降解，木质纤维素被降解一定是由于分解木质纤维素的菌群所致，由此可断定腐烂的秸秆中一定含有分解木质纤维素的菌群，则腐烂垛底中一定含有分解木质纤维素的菌群，所以将腐烂垛底作为菌源；腐烂垛底为分解木质纤维素的菌群的栖息基质，其中含有腐烂秸秆、土壤、分解木质纤维素的菌群等。

2、限制性培养和筛选

实验组：取5.0g菌源样品接种到盛有150ml限制性培养基的500ml三角瓶中，三角瓶中含有已灭菌的0.15g水稻秸秆和1cm×6cm的滤纸条，在室温（34℃）、150rpm/min条件下震荡培养，至滤纸条颜色变为黄色（记作第0代培养），将三角瓶中的所有物质一起称作培养物；当滤纸条颜色变为黄色后，将培养物转接到新鲜的限制性培养基内，接种量为5％(体积百分比)，在与第0代相同的条件下进行培养，至滤纸条颜色变为黄色后，再进行转接传代，如此培养数代。

在上述传代培养过程中，每代都检测秸秆的分解率，检测时间为从接种开始计起第1天，从第5天开始检测分解率。在上述传代培养过程中，每代都检测培养物中菌群的16S rDNA组成是否稳定，从而检测培养物中菌种组成是否稳定，检测时间为从接种开始计起第1天（接种当天记作第1天），第5天检测16S rDNA。

上述培养及检测过程，均设对照组，对照组中除三角瓶中不添加任何秸秆外，其余均与实验组相同。对照组的目的在于：消除秸秆分解率计算时菌体及培养基的影响。

当秸秆分解率高且传代间稳定、传代间菌种组成稳定时，相应代的培养物中即含有所需分解木质纤维素的菌群。如果菌群稳定，降解率就会稳定。

限制性培养基为蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基，由终浓度为5g/L的蛋白胨、终浓度为1g/L的酵母提取物、终浓度为5g/L的NaCl、终浓度为1g/L的K₂HPO₄、终浓度为0.35g/L的MgSO₄·7H₂O和终浓度为3g/L的CaCO₃组成，所述终浓度为各物质在培养基中的浓度。

3、秸秆分解率的测量方法及菌种组成的检测方法：

（1）秸秆分解率的检测方法

分别称量分解前和分解后的秸秆重量，按照下述公式计算得到分解率：

分解率=（分解前的秸秆重量-分解后的秸秆重量）/分解前的秸秆重量。

分解前的秸秆重量为0.15g；

分解后的秸秆重量的计算及称量方法：将培养物用已知重量的滤纸过滤，将滤渣在105℃下烘干后称重；滤前滤纸的重量公式是：（秸秆分解前原始重量+滤纸重量）-（分解后秸秆+滤纸重量）。

（2）菌种组成的检测方法

原理：PCR扩增各代复合菌群的16S rDNA，再进行变性梯度凝胶电泳（DGGE），比较各代复合菌群的16S rDNA条带，分析各代间菌种组成的变化，当各代之间的PCR-DGGE条带趋于稳定时，证明复合菌群组成稳定。

1）用氯仿-苯酚抽提法提取各代复合菌群总DNA；

2）以总DNA为模板，用如下引物357F/517R进行PCR扩增：

357F：GC，GC clampb 5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’(GC-clamp序列为5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3’)；

517R：5’-GTGCCAGC(A/C)GCCGCGG-3’。

PCR反应条件为：首先，95℃预变性10min，然后，93℃变性1min，48℃退火1min30sec，72℃延伸1min，共30个循环，最后，72℃延伸1min，4℃维持。

3）将步骤2）得到的各代PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳（DGGE），比较各代PCR扩增产物的图谱（即PCR-DGGE条带），当各代之间的PCR-DGGE条带趋于稳定时，证明复合菌群组成稳定。

结果表明，从第0代培养开始，培养至30代，秸秆分解率趋于稳定且高，分解率为70%以上；培养至20代，复合菌群组成稳定；培养至20代，得到组成稳定、秸秆分解率高且稳定的复合菌群。

二、筛选的复合菌群对木质纤维素的降解

1、复合菌群降解水稻秸秆：

将第30代的培养物与水稻秸秆和培养基混合（培养物、水稻秸秆和培养基的配比为5ml培养物：1g水稻秸秆：50ml培养基），在室温（34℃）、150rpm/min条件下震荡培养条件下发酵6-15天。然后测秸秆中纤维素和半纤维素的含量。

发酵所用培养基为改良的PCS培养基，其组成为：蛋白胨5g,酵母提取物1g，NaCl5g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O 0.35g，CaCO₃3g，溶解在1L水中。

秸秆中纤维素和半纤维素的含量测定步骤：

（1）将分解前后的水稻秸秆样品分别称取1g（相同样品设置3个重复），装在醋酸纤维滤通中，安装在SOKURE玻璃萃取管内，用乙醇－乙醚(1∶1，体积比)混合液处理24小时，干燥后，得到残留固体，接着用水环流2小时，干燥后称得的重量为M1。

（2）将（1）得到的残留物用0.65mol/L HCl环流2小时，干燥后，称得的重量为M2。

（3）将（2）得到的残留物用15M H₂SO₄浸泡2小时后，用0.42M H₂SO₄环流5小时，干燥后称得的重量为M3。

（4）分解后秸秆重量称量方法：减重法。

计算公式：

半纤维素的重量=M1-M2；

纤维素的重量=M2-M3；

半纤维素分解率=（分解前半纤维素重量-分解后半纤维素重量）/（分解前秸秆重量-分解后秸秆重量）；

纤维素分解率=（分解前纤维素重量-分解后纤维素重量）/（分解前秸秆重量-分解后秸秆重量）。

实施例2、用于制备秸秆发酵饲料的复合菌群的筛选

一、复合菌群的筛选

1、菌源

取东北水稻产区的的秸秆作为菌源。

2、复合菌群的限制性培养和筛选

实验组：取0.5g菌源秸秆接入装有10ml限制性培养基的三角瓶中，厌氧培养于5℃冰箱中，培养10d（记作第0代培养），得到培养物（将三角瓶中的所有物质一起称作培养物）；然后取15μl培养物接入新鲜的限制性培养基中，5℃、厌氧培养4d（记作第1代培养）；再将培养物转接入新鲜的限制性培养基，在与第1代培养相同的条件下进行培养，依此连续传代培养数代。

在上述传代培养过程中，每代都检测培养物的pH值，。在上述传代培养过程中，每代都检测乳酸的产率，检测时间为从接种开始时计起培养48h。在上述传代培养过程中，每代都检测培养物中菌群的16S rDNA组成是否稳定，从而检测培养物中菌种组成是否稳定，检测时间为从接种开始计起第3天（接种当天记作第1天）。

当乳酸产率高且传代间稳定、传代间菌种组成稳定、pH下降迅速（即12小时可将pH从6.4降至3.8）时，相应代的培养物中即含有用于制备秸秆发酵饲料的菌群。

所用的限制性培养基为，R-MRS培养基，其组成如表1所示。R-MRS的意思就是加了稻草做底物的MRS培养基。

表1、MRS培养基的组成

MRS培养基是筛选乳酸杆菌的限制性培养基。

3、pH值测定方法、乳酸产率测定方法及菌种组成的检测方法

（1）pH的测定方法：取0.2ml培养物，滴于HORIBA微型pH计(model B-212,HORIBA,Japan)测定。

PH值下降速度：24小时从6.4降至3.8。

（2）乳酸产率的检测方法：

Ⅰ、乳酸定性检测

从接种时计起，培养48h后，取培养物200μl，过0.2μm的滤膜，收集滤液；将滤液用日本岛津公司产QP－5050型气质联机进行检测。

分析柱：CP-Chirasil-Dex CB(25m×0.25mm)毛细管柱；柱箱温度60℃(1min.)→100℃,1℃/min,→195℃(2min.),18℃/min，共15min（此处表述似乎不清楚，最好请将其完善）；进样口温度190℃；检测器温度230℃；载气He(60kPa)；流量34mL/min；分流比1/22；监测器电压1.5kv；进样量1μL。

对测定的数据，利用NIST数据库进行定性分析。出峰物的定性分析结果表明所测滤液中是否主要为乳酸。

若结果表明主要成分为乳酸，则进行下一步的乳酸定量检测。

Ⅱ、乳酸定量检测

乳酸标准品购自北京市试剂公司。

（3）菌种组成的检测方法

1）用氯仿-苯酚抽提法提取各代复合菌群总DNA

2）以总DNA为模板，用如下引物357F/517R进行PCR扩增：

517R：5’-GTGCCAGC(A/C)GCCGCGG-3’。

结果表明，从第0代培养开始，培养至第10代，pH值下降速度快且各代间下降速度稳定，pH值下降速度24h可以降至3.8；得到组成稳定、乳酸产率高且稳定、pH值下降速度快的复合菌群。

二、复合菌群在发酵饲料中的应用

以水稻秸秆为饲料。

1、实验一得到的复合菌群在发酵饲料中的应用

将第10代的培养物与饲料混合（即接种），培养物与饲料的比例为1ml培养物：100g饲料，在厌氧条件下发酵20天。在发酵过程中的第2天、第5天、第10天、第20天检测发酵混合物的pH值（将接种当天记作第0天）；在发酵过程中的第20天检测发酵混合物中的乳酸的量（将接种当天记作第0天）；培养物、饲料及发酵代谢产物一起组成的混合物记作发酵混合物。

pH值的检测方法、乳酸产率的测定方法与实验一中所述相同。

结果如下：

pH值的下降速度：第2天降至4.0，第5天降至3.8

第20天乳酸产率为51g/kg。

本实施例中，用东北水稻产区的土壤、或该产区的秸秆与土壤的混合物作为菌源，也均得到了复合菌群，并且将其用于秸秆发酵饲料制备中的效果无显著差异。

Claims

1.一种筛选功能菌群的方法，由如下步骤组成：

1）选取含有功能菌群的基质；

所述限制性培养基为所述功能菌群在其中生长、且不属于所述功能菌群的菌不能在其中生长的培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养的条件与所述功能菌群在所述基质中生存的条件相同。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述功能菌群为分解木质纤维素的菌群。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基质为秸秆柴垛腐烂的垛底、常年堆积的秸秆或常年堆积的树叶。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述限制性培养基由终浓度为5g/L的蛋白胨、终浓度为1g/L的酵母提取物、终浓度为5g/L的NaCl、终浓度为1g/L的K₂HPO₄、终浓度为0.35g/L的MgSO₄·7H₂O、终浓度为3g/L的CaCO₃和终浓度为0.1g/L的秸秆组成；所述终浓度为各物质在所述限制性培养基中的浓度。

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：所述评价所述功能菌群功能的指标为秸秆分解率；所述指标符合对所述功能菌群的功能要求为秸秆分解率在所述传代培养的各代间稳定。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述功能菌群为用于制备秸秆发酵饲料的菌群。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述基质为农作物秸秆、农作物赖以生长的土壤或农作物秸秆与农作物赖以生长的土壤的混合物；所述培养基为R-MRS培养基。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述评价所述功能菌群功能的指标为乳酸产率和pH值下降速度；所述指标符合对所述功能菌群的功能要求为：所述乳酸产率在所述传代培养的各代间稳定，和所述pH值下降速度为12小时内pH从6.4降至3.8。

10.根据权利要求3-9中任一所述的方法，其特征在于：所述检测所述功能菌群中菌种组成是否稳定的方法为在所述传代培养过程中，PCR扩增每代培养中的所述功能菌群的16S rDNA基因，得到各代的PCR扩增产物，比较各代的PCR扩增产物的图谱，若图谱稳定不变，则所述功能菌群中菌种组成稳定。