CN104611227A - 一种耐受高ph的斜生栅藻及其选育方法 - Google Patents

一种耐受高ph的斜生栅藻及其选育方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种耐受高PH的斜生栅藻及其选育方法。本发明通过紫外诱变和逐级提高PH驯化筛选的方法选育斜生栅藻，获得耐受高PH的斜生栅藻突变株（Scenedesmusobliqnus），命名为FSH-Y2，于2012年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCCNo.6551。本发明选育的斜生栅藻在高PH值下能够更好的吸收利用二氧化碳，快速生长繁殖，解决了现有斜生栅藻只能在中性PH下生长，而中性PH条件下存在二氧化碳溶解度小、固定二氧化碳效率低的问题。

Description

一种耐受高PH的斜生栅藻及其选育方法
技术领域
本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种耐受高PH的斜生栅藻及其选育方法。
背景技术
随着人类社会资源短缺和环境问题的日益突出，全世界正面临着能源匮乏和生态环境破坏的危机，因此，寻求一种绿色的可再生的新能源成为世界各国科学家普遍关注的科学问题。在诸多的生物中，微藻具有资源丰富，种类繁多，光合利用效率高，生长速度快、适应力强，自身合成油含量高的特点，近年来备受各国研究者关注。
栅藻又称栅列藻，绿藻门绿球藻目栅藻科的一属，是淡水中常见的浮游藻类，极喜在营养丰富的静水中繁殖，根据形态划分好多种，如斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)、尖细栅藻(S. acuminatus)、弯曲栅藻(S. arcuatus)、被甲栅藻(S. armatus)和四尾栅藻 (S. quadricauda)等。栅藻在水体自净和污水净化中有一定作用，是有机污水氧化塘生物相中的优势种类。它可与细菌同时附着在水中有机物碎片和其他水生植物体上，形成胶质层，吸附有机物。栅藻进行光合作用时，一方面产生氧气供细菌分解有机质的需要，另一方面还可直接利用有机质作为碳源和氮源，使水中有机物迅速降解，从而净化水体。栅藻细胞内含有丰富的蛋白质和维生素，是鱼类很好的饲料，如利用有机污水氧化塘养鱼，可获高产。大量繁殖的藻体也可作家禽的饲料。斜生栅藻等又极易进行大量人工培养，故栅藻又是研究水体污染的一种很好的实验材料。近年来利用栅藻生产石油替代品也日益受到重视，具有潜在的应用价值。
栅藻生长受诸多因素的影响，包括碳源、氮源、磷源、温度、PH等。其中PH对栅藻生长有显著的影响，一般在中性PH值下生长最好，能获得最大的生物量，在碱性PH值范围内生长缓慢，在PH值到10以上时，生长缓慢甚至不生长。
CN201010577813.9公开了一种栅藻属微藻突变株，其是由野生型栅藻属微藻0301A通过紫外诱变而获得的生长速度更快、产油量更高和/或虾青素产量更高的突变株。本发明还涉及野生型栅藻属微藻0301A及其突变株在生产生物柴油、处理污水、生产虾青素、生产鱼虾饵料或家禽家畜饲料和固定CO2中的应用。该藻株虽然生长速度更快、产油量更高和/或虾青素产量更高，但是其生长环境并未变化，不具备耐受高PH的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐受高PH的斜生栅藻及其选育方法。本发明选育的斜生栅藻在高PH值下能够更好的吸收利用二氧化碳，快速的生长繁殖，解决了现有斜生栅藻只能在中性PH下生长，而中性PH条件下存在二氧化碳溶解度小、固定二氧化碳效率低的问题。 
本发明耐受高PH的斜生栅藻，为斜生栅藻突变株（Scenedesmus obliqnus），命名为FSH-Y2，于2012年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6551。
本发明FSH-Y2藻株可以耐受的PH值为10～12，在此PH值条件下的生长速率比原始斜生栅藻快3～6倍。
本发明FSH-Y2藻株的特征为：在显微镜下藻细胞呈纺锤形，丛生，有细胞壁膜包裹，颜色为深绿色；单个藻细胞直径约为6～10μm，较原始藻株较大，原始藻株的藻细胞直径为2～3μm。
本发明FSH-Y2藻株的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，本发明FSH-Y2藻株与已公布的栅藻藻株18S rDNA数据存在差异。
本发明的FSH-Y2藻株，在高PH生长时能增加二氧化碳的溶解度，增加栅藻光合作用中对二氧化碳的固定，对二氧化碳的减排有显著作用。斜生栅藻的生长需要吸收二氧化碳，一般来说，二氧化碳的溶解性与溶液的酸碱性有一定的关系，二氧化碳在碱性溶液中溶解度显著升高。因此，所获得斜生栅藻FSH-Y2可耐受高PH值的环境，而在高PH值环境下可以溶解更多的二氧化碳，提高了藻株对二氧化碳的固定效率，对控制二氧化碳污染的温室效应具有重要意义。
本发明耐受高PH的斜生栅藻的选育方法，包括以下内容：
（1）配制斜生栅藻生长的BG11培养基；
（2）接种原始斜生栅藻，经光照和黑暗周期诱导，对原始斜生栅藻进行活化；
（3）取对数生长期的斜生栅藻进行紫外诱变，然后进行暗培养；
（4）将暗培养后的藻液用新鲜培养液稀释后涂布到固体培养基上进行光照培养；
（5）挑取生长迅速的单藻落接种到BG11培养液中进行初筛，培养液的PH为8.0～9.0；
（6）将步骤（5）初筛的藻液，接种到逐级提高PH的培养液中进行驯化培养，每次PH提高0.5～1.0，筛选获得耐受高PH的藻株。
在步骤（1）中，将配制好的BG11培养基分装在50～250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为20～100mL，用透气膜封口，包上牛皮纸。将上述培养基进行灭菌，在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20～30分钟。所述BG11培养基组成如表1、表2所示。
表1  BG11培养基
成分 Working solution(g/L)
NaNO3 1.5
K2HPO4 .3H2O 0.04
MgSO4 . 7H2O 0.075
CaCl2 . 2H2O 0.036
Citric acid 0.006
Ferric ammonium citrate 0.006
EDTA 0.001
Na2CO3 0.02
A5+Co solution* 1ml
Distilled water 919
*表2  表1中A5+Co solution的组成
成分 含量（g/L）
H3BO3 2.86
MnCl2·H2O 1.81
ZnSO4·7H2O 0.222
CuSO4·5H2O 0.079
Na2MoO4·2H2O 0.390
Co(NO3) ·6H2O 0.049
步骤（2）中，按接种液与培养液的体积比为1:10～1:5接种，操作在无菌间进行，接种后将培养液摇匀，用透气膜包好。所述的光照和黑暗周期诱导是在22～32℃的恒温光照反应摇床中进行，光暗反应周期为24h，光暗时间比为12:12；摇床转速为80～160rpm，培养4～7天，获得活化的原始斜生栅藻藻液。
步骤（3）中，取对数生长期的藻液5～10mL置于无菌培养皿中进行紫外诱变，藻液在培养皿底面铺一薄层，培养皿放在无菌的暗室中，打开皿盖。在磁力搅拌下，用30w的紫外灯照射诱变，照射时间为10～20min，紫外灯与培养皿的距离为15～25cm，照射致死率为60%～80%。照射后盖上皿盖，用不透光的纸包好培养皿进行暗培养，暗反应的培养温度为20～30℃，培养时间为24～72h。
步骤（4）中，将步骤（3）暗反应后的藻液用BG11新鲜培养基稀释10～10000倍，吸取0.1～0.3mL涂布到BG11固体琼脂平板（琼脂含量为1%～2%）上。在光照培养箱中进行培养，培养温度为20～30℃，光照强度为1000～3000Lux，光暗反应周期为24h，光暗时间比为12:12，培养时间为10～15d。挑选在平板上长得比较大、颜色比较深、生长迅速的单藻落进行筛选。
步骤（5）中，在恒温光照摇床中培养，摇床转速为60～180rpm，光照强度为1000～5000Lux，光暗反应周期为24h，培养温度为20～30℃，光暗时间比为12:12，培养时间为10d～15d天。培养结束后，测定藻液的OD680值，由于与生物量细胞干重具有很好的线性关系，根据OD680的大小来进行藻种的筛选，选出OD值比较大的耐受高PH的藻株，进行驯化筛选。
步骤（6）中，以1:10～1:5的比例将步骤（5）中挑选的藻落接种到培养基中。采用逐级提高PH值的方式进行驯化培养，初始PH为8.0～9.0，每次PH提高0.5～1.0，每提高一次在相同条件下培养24～96h，选择出OD值比较大的耐受高PH的藻液，获得耐受PH为11～12的藻株。
与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：
（1）通过紫外诱变和逐级提高PH驯化筛选的方法选育斜生栅藻，获得耐受高PH的斜生栅藻突变株。与原始斜生栅藻藻株相比，原始藻株在PH达到10以上时生长缓慢，或者停止生长甚至死亡，而本发明选育的斜生栅藻能够耐受的PH可达12，在PH值为10～12的条件下生长速率提高了3～6倍。
（2）本发明的斜生栅藻在高PH值下能够增加二氧化碳的溶解度，增加光合作用中对二氧化碳的固定，更好的吸收利用二氧化碳，对二氧化碳的减排有显著作用，解决了现有斜生栅藻只能在中性PH下生长，而中性PH条件下存在二氧化碳溶解度小、固定二氧化碳效率低的问题。同时，在高PH值培养栅藻时，可以有效抑制栅藻生长过程中杂菌的生长。
（3）本发明方法采用逐级提高PH值的方式驯化筛选耐受高PH的藻种，避免了一次提高PH筛选带来藻种的损伤，造成诱变筛选的失败，保证了逐级驯化的可靠性和提高了诱变藻株的遗传稳定性。以OD680值作为生物量和生长速率的衡量指标，具有直观便捷的特征，保证了在较短时间内较高的筛选量。
附图说明
图1是本发明方法选育的FSH-Y2藻株的形态特征图。
生物材料保藏说明
本发明提供的斜生栅藻FSH-Y2 (Scenedesmus obliquus) 藻株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 6551；保藏日期：2012年9月11日。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 突变株的分离和筛选
本发明原始斜生栅藻藻株是2011年10月从辽宁省抚顺市浑河水样中通过平板划线的方式分离出来的野生斜生栅藻藻株，编号为FSH-Y1。对原始斜生栅藻株FSH-Y1进行紫外诱变和驯化培养选育耐受高PH的斜生栅藻突变株。
具体步骤如下：
（1）配制BG11培养基，将配制好的BG11培养基分装在250mL摇瓶中，每瓶装液量为100mL，用透气膜封口，牛皮纸包好，置于121℃，0.1MPa下灭菌30分钟。
（2）在无菌条件下，吸取原始斜生栅藻液FSH-Y1约10mL接种到上述灭菌后的摇瓶中，将摇瓶置于恒温光照摇床中培养。摇床的转速设置为120rpm，温度为25℃，设置光暗培养周期为24h，光暗反应时间比为12:12，光照强度为3000Lux。
（3）在光照摇床中培养5天后，藻液进入对数生长期，此时吸取藻液10mL于灭菌后的培养皿中，使藻液在培养皿底部平铺一薄层，在磁力搅拌下放在紫外灯下进行照射，紫外灯功率为30w，照射距离为15cm，照射时间15min，照射完后盖上皿盖，用不透光的纸包好，在25℃下暗培养2天，致死率为79%。
（4）将暗反应培养的藻液用新鲜培养液稀释10000倍，吸取0.2ml涂布到PH为11的BG11琼脂固体平板（琼脂含量为1.5%）上进行培养，培养温度为25℃，光照强度为3000Lux，培养在光照培养箱中进行，光暗反应周期为24h，光暗时间比为12:12，培养时间15天。
（5）挑选平板上体积较大、颜色较绿的藻落进行筛选，将其单藻落接种于装有培养体积为20mL、PH值为9的BG11的培养基的50mL的摇瓶中进行培养。培养温度为25℃，摇床转速为120rpm，光照强度为3000Lux，光暗周期为24h，光暗时间比为12:12，培养10天后，测定摇瓶中藻液的OD680值，根据OD680的大小，选择出OD值比较大的耐受PH9的藻株进行驯化筛选。
（6）将筛选出的藻株按1:10的比例接入含有100mL的PH为10的BG11培养液的250mL的摇瓶中进行驯化培养，培养温度为25℃，摇床转速为120rpm，光照强度为3000Lux，光暗周期为24h，光暗时间比为12:12，培养10天后，剔出颜色发黄已经死了的藻液，测定剩余摇瓶中藻液的OD680值，根据OD680的大小，选择出OD值比较大的耐受PH10的藻株进一步驯化。将PH提高至10.5、11.0、11.5，在上述相同条件下进一步驯化，选择出OD值比较大的藻株，此藻株即耐受高PH的目标藻株FSH-Y2。
以上所述，仅是筛选耐受高PH的藻株的最佳实施例而已，并非对本发明作任何形式的限制，对以上实施例所作的任何形式的简单的修改，均属于本发明技术方案的范围内。
实施例2
原始藻株与诱变藻株在不同PH下生长速率的比较：将筛选的藻株FSH-Y2的对数生长期的藻液和原始藻种的对数生长期的藻液按一定的比例接入装有BG11培养基的摇瓶中，接种后初始OD680值相同，均为0.2，不同的PH值下培养15天，测定OD680值作为衡量生长速度的指标，所得的结果如表3所示。
表3 原始藻株与诱变藻株在不同PH值下的OD值比较
由表3可见，诱变藻株随着PH值的升高OD值变化不明显，而原始藻株OD值迅速下降，生长缓慢，甚至死亡。
SEQUENCE LISTING
<110>  中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院
<120>  一种耐受高PH的斜生栅藻及其选育方法
<130>  新专利申请
<160>  1
<170>  Patent In version 3.5
<210>  1
<211>  1418
<212>  DNA
<213>  Scenedesmus obliquus
<400>  1
gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgcttatac      60
tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttggtggta ccttactact      120
cggataaccg tagtaattct agagctaata cgtgcgtaaa tcccgacttc tggaagggac   180
gtatatatta gataaaaggc cgaccgagct ttgctcgacc cgcggtgaat catgatatct    240
tcacgaagcg catggccttg tgccggcgct gttccattca aatttctgcc ctatcaactt     300
tcgatggtag gatagaggcc taccatggtg gtaacgggtg acggaggatt agggttcgat  360
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gtggttactt tgagtaaatt agagtgttca aagcaggctt acgccagaat actttagcat     780
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agagggacag tcgggggcat tcgtatttca ttgtcagagg tgaaattctt ggatttatga    900
aagacgaact actgcgaaag catttgccaa ggatgttttc attaatcaag aacgaaagtt    960
gggggctcga agacgattag ataccgtcgt agtctcaacc ataaacgatg ccgactaggg 1020
attggcgaat gtttttttaa tgacttcgcc agcaccttat gagaaatcaa agtttttggg     1080
ttccgggggg agtatggtcg caaggctgaa acttaaagga attgacggaa gggcaccacc 1140
aggcgtggag cctgcggctt aatttgactc aacacgggaa aacttaccag gtccagacat 1200
agtgaggatt gacagattga gagctctttc ttgattctat gggtggtggt gcatggccgt   1260
tcttagttgg tgggttgcct tgtcaggttg attccggtaa cgaacgagac ctcagcctgc   1320
taaatagtct cagttgcttt ttgcagctgg ctgacttctt agagggacta ttggcgttta     1380
gtcaatggaa gtatgaggca ataacaggtc tgtgatgc                     1418

Claims (10)

1.一种耐受高PH的斜生栅藻， 为斜生栅藻突变株（Scenedesmus obliqnus），命名为FSH-Y2，于2012年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC No. 6551。
2.按照权利要求1所述的藻株，其特征在于：FSH-Y2藻株可以耐受的PH值为10～12，在此PH值条件下的生长速率比原始斜生栅藻快2～6倍。
3.按照权利要求1所述的藻株，其特征在于：FSH-Y2藻株的特征为在显微镜下藻细胞呈纺锤形，丛生，有细胞壁膜包裹，颜色为深绿色；单个藻细胞直径约为6～10um。
4.按照权利要求1-3任一所述的斜生栅藻的选育方法，包括以下内容：
（1）配制斜生栅藻生长的BG11培养基；
（2）接种原始斜生栅藻，经光照和黑暗周期诱导，对原始斜生栅藻进行活化；
（3）取对数生长期的斜生栅藻进行紫外诱变，然后进行暗培养；
（4）将暗培养后的藻液用新鲜培养液稀释后涂布到固体培养基上进行光照培养；
（5）挑取生长迅速的单藻落接种到BG11培养液中进行初筛，培养液的PH为8.0～9.0；
（6）将步骤（5）初筛的藻液，接种到逐级提高PH的培养液中进行驯化培养，每次PH提高0.5～1.0，筛选获得耐受高PH的藻株。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于： 步骤（2）中，按接种液与培养液的体积比为1:10～1:5接种；所述的光照和黑暗周期诱导是在22～32℃的恒温光照反应摇床中进行，光暗反应周期为24h，光暗时间比为12:12；摇床转速为80～160rpm，培养4～7天。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，取对数生长期的藻液5～10mL置于无菌培养皿中进行紫外诱变；在磁力搅拌下，用30w的紫外灯照射诱变，照射时间为10～20min，紫外灯与培养皿的距离为15～25cm，照射致死率为60%～80%。
7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，紫外照射后进行暗培养，培养温度为20～30℃，培养时间为24～72h。
8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，将步骤（3）暗反应后的藻液用BG11新鲜培养基稀释10～10000倍，吸取0.1～0.3mL涂布到BG11固体琼脂平板上；在光照培养箱中进行培养，培养温度为20～30℃，光照强度为1000～3000Lux，光暗反应周期为24h，光暗时间比为12:12，培养时间为10d～15d。
9.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：在步骤（5）中，在恒温光照摇床中培养，摇床转速为60～180rpm，光照强度为1000～5000Lux，光暗反应周期为24h，培养温度为20～30℃，光暗时间比为12:12，培养时间为10d～15d天。
10.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：在步骤（6）中，以1:10～1:5的比例将步骤（5）中挑选的藻落接种到培养基中。
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