BR112015008824B1

BR112015008824B1 - Processo de melhoria de biomassa e teor de lipídios de microalgas

Info

Publication number: BR112015008824B1
Application number: BR112015008824-4A
Authority: BR
Inventors: Manoj Kumar; Mahendra Pratap Singh; Dheer SINGH; Anju Chopra; Deepak Kumar Tuli; Ravinder Kumar Malhotra
Original assignee: Indian Oil Corporation Limited
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2013-10-17
Publication date: 2022-11-29
Also published as: BR112015008824A2; WO2014060973A1

Abstract

LINHAGENS MELHORADAS DE MICROALGAS, E PROCESSO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se a linhagens melhoradas de microalgas, processo para as mesmas e uso destas.

Description

CAMPO DE INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a linhagens melhoradas de microalgas, processo para as mesmas e seu respectivo uso.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002] As microalgas são organismos unicelulares com a capacidade de se adaptar a várias condições ambientais. Microalgas são consideradas como uma fonte promissora de biocombustíveis devido ao seu potencial de atingir altos rendimentos por área unitária sem afetar o padrão de uso da terra para culturas alimentares.

[003] Em relação a matérias-primas para biocombustíveis terrestres, as microalgas podem converter energia solar em lipídios em eficiências fotossintéticas mais elevadas. Microalgas podem ser cultivadas durante todo o ano e fixar CO2 eficientemente a partir de diferentes fontes, incluindo os gases de exaustão industrial e podem crescer em correntes de águas residuais. Elas também têm o potencial para a produção de vários biocombustíveis tais como biodiesel, bio-óleo, bio-gás de síntese, bio-metano, bio-etanol e bio-hidrogênio. Mas para viabilidade comercial, são necessárias modificações de certas características.

[004] Múltiplos ciclos de fusão de protoplastos e rearranjo de genoma são uma técnica conhecida para melhorar as características ou adquirir uma propriedade desejada.

[005] A Patente EP1707641A2 fornece métodos que empregam ciclos iterativos de recombinação e seleção/exame para a evolução de todas células e organismos em direção à aquisição de propriedades desejadas. Exemplos de tais propriedades incluem recombinogenicidade melhorada, número de cópia do genoma, e a capacidade de expressão e/ou secreção de proteínas e metabólitos secundários.

[006] A técnica de rearranjo de genoma combina a vantagem de cruzamento multiparental permitido pelo rearranjo de DNA juntamente com a recombinação de genomas inteiros normalmente associados com reprodução convencional, ou através da fusão de protoplastos que aumenta o processo de recombinação.

[007] A Patente US6531646 refere-se ao método de modificação genética e o melhoramento de espécies de Porphyra utilizando a fusão de protoplastos é divulgado. O método da invenção apresenta o uso de conchoporangial do ramo conchocelis por pelo menos uma das fontes de protoplastos para a fusão de protoplasto. O método de fusão de protoplastos envolve um agente de fusão química como polietileno glicol (PEG) ou eletrofusão.

[008] A Patente US20100162620 fornece sistemas e processos para otimizar cada tipo de produção de bioprodutos baseada em algas (como óleo) separadamente e independente, melhorando portanto a produção total de óleo, lipídios e outros produtos úteis. Este processo é vantajoso porque permite a otimização das etapas individuais e as fases de crescimento na produção de óleo a partir de biomassa. Isto também permite o uso de diferentes matérias-primas e condições de crescimento para as diferentes etapas de processo.

[009] A Patente US20120028338 refere-se a composições mistas de algas capazes de proliferar em águas residuais industriais, e métodos de obter uma biomassa de algas de tais culturas para uso na geração de biocombustível. A invenção engloba ainda métodos de cultivo de populações mistas de algas de água doce e do mar compreendendo uma pluralidade de gêneros e espécies para fornecer uma biomassa da qual podem ser extraído lipídios, ou ser convertida em biodiesel por tais procedimentos como pirólise.

[0010] Deng et al. (2011), African J. Agri.Res. Vol.6(16), pp. 3768-3774 é uma publicação científica que diz respeito aos efeitos de meio seletivo em acumulação de lipídios de chlorellas e seleção de mutantes de lipídios elevados através de mutagênese de ultravioleta.

[0011] Bhatnagar et al. (2011), Applied Energy, Vol.88, Edição 10, pp. 3425-3431 refere-se ao potencial de crescimento mixotrófico de microalgas nativas ou seja Chlamydomonas globosa, Chlorella minutissima e Scenedesmus bijuga isolada após enriquecimentos a longo prazo de efluentes industriais e cultivada em meio suplementado com diferentes substratos de carbono orgânico e águas residuais. O crescimento mixotrófico destas microalgas resultou na produção de biomassa 3 - 10 vezes maior em relação a fototrofia.

[0012] Vigeolas et al. (2012), J. of Biotech. Vol.162, Edição 1, pp.3-12 é uma publicação científica que refere-se ao isolamento e caracterização parcial da biomassa de mutantes de alto triacilglicerol (TAG) de Chlorella sorokiniana e Scenedesmus obliquus, duas espécies de algas consideradas como uma fonte potencial de biodiesel.

[0013] Pittman J.K et al. (2010), Bioresour. Tech. Vol.102, Edição 1, pp-17-25 é outra publicação científica, que se refere ao potencial das microalgas como uma fonte de energia renovável para a produção de biocombustíveis de microalgas. Águas residuais derivadas de atividades municipais, agrícolas e industriais fornecem potencialmente meios com eficiência em custo e sustentáveis de crescimento de algas para biocombustíveis.

[0014] Luiz Gustavo Mohan et al. (2011), Bioresour. Tech. Vol.102, Edição 2, pp-1109-1117 também é uma publicação científica que fornece uma visão geral sobre a possibilidade de utilizar microalgas mistas existentes em corpos de água ecológicos para aproveitamento de biodiesel. Culturas de microalgas de cinco corpos de água são cultivadas em águas residuais domésticas em lagoas abertas e a biomassa de algas colhida foi processada através de transesterificação catalisada por ácido.

[0015] A técnica anterior divulga mutagênese aleatória da variação de algas para produtividade de lipídios e biomassa. Ainda, a grande desvantagem nas microalgas para uso em biocombustível é a indisponibilidade de linhagens adequadas e método eficiente em custos para cultivo e colheita. Portanto, existe a necessidade de desenvolver métodos mais baratos para cultivo e rápido crescimento de linhagens com tolerância a condições ambientais adversas e a capacidade de utilizar altas concentrações de CO2 e produtividade de lipídios com composição adequada para produzir combustíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] Consequentemente, a principal aplicação da presente invenção fornece linhagens de microalgas pertencentes a algas verdes e algas azuis verdes, selecionadas a partir do grupo composto de Nannochloropsis, Chlorella, Scenedesmus e Synechococcus.

[0017] Outra aplicação da presente invenção fornece as linhagens que são Nannochloropsis IOC-105, Chlorella vulgaris IOC-106, Chlorella protothecoides IOC-107, Chlorella emersonii IOC-108, Chlorella pyrenoidosa IOC- 109, Scenedesmus sp. IOC-110, Synechococcus sp-IOC-111.

[0018] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo de preparação de linhagens de microalgas, o dito método compreendendo as etapas de: a) isolar as microalgas de águas de baixa qualidade; b) cultivar as microalgas em meio de cultura de algas (AIM); c) adaptar as micro algas pelo cultivo em meio composto por meio de isolamento das algas, água de baixa qualidade contendo metais pesados na faixa de 100-1000 ppm, hidrocarbonetos na faixa de 0,001-2% e alta concentração de sal de até 3%; d) cultivar as microalgas em meio de cultura para doze ciclos; e) tratar as microalgas com agentes mutagenizantes; f) obter microalgas mutagenizadas; g) isolar os protoplastos de microalgas mutagenizadas da etapa (c); h) rearranjar os protoplastos obtidos na etapa (d) para fusão usando 60% de PEG-6000; i) cultivar as microalgas do protoplasto fundido em meio AIM contendo 0,5 M de agente osmótico; j) realizar as etapas (d) até (f) para seis ciclos ou gerações sob condições rigorosas de crescimento; e k) obter as linhagens de novas microalgas.

[0019] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo de melhoria da biomassa e teor de lípidos de microalgas, o dito processo compreendendo as etapas de: a) Cultivar as microalgas em um meio compreendido do meio de cultura de algas; b) Adicionar auxinas e citocininas na faixa de 0,25-10 ppm durante a fase de retardo da cultura de microalgas; c) Expor as microalgas da etapa (b) aos raios UV por 2 horas em fase logarítmica; d) Adição de tiossulfato de sódio na faixa de 0,05-2% na fase logarítmica tardia para microalgas do etapa (c) e) Incubar as microalgas da etapa (d) a 10°C por 6 horas; f) Adicionar água quente ao extrato de diferentes plantas de microalgas da etapa (e); e g) Obter microalgas com alto teor de lipídios e biomassa.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0020] Enquanto a invenção é suscetível a várias modificações e/ou processos alternativos e/ou composições, aplicação específica da mesma tem sido demonstrada por meio de exemplo nos desenhos e tabelas e será descrita em detalhes abaixo. Deve ser entendido, entretanto que não se pretende limitar a invenção à processos particulares e/ou composições divulgadas, mas pelo contrário, a invenção destina-se a abranger todas as modificações, equivalentes e alternativas dentro do espírito e o escopo da invenção conforme definido pelas reivindicações anexas.

[0021] Os gráficos, tabelas, fórmulas, protocolos foram representados onde adequado por representações convencionais nos desenhos, mostrando apenas aqueles detalhes específicos que são pertinentes para a compreensão das aplicações da presente invenção de modo a não obscurecer a divulgação com detalhes que serão rapidamente aparentes para os técnicos possuindo o benefício da descrição aqui neste documento.

[0022] A seguinte descrição é de aplicações exemplares apenas e não se destina a limitar o escopo, aplicabilidade ou configuração da invenção de maneira alguma. Em vez disso, a seguinte descrição fornece uma ilustração conveniente para implementação das aplicações de exemplo da invenção. Várias alterações nas aplicações descritas podem ser feitas na função e arranjo dos elementos descritos sem afastar-se do escopo da invenção.

[0023] Os termos "compreende", "compreendendo", ou quaisquer outras variações dos mesmos, destinam-se a abranger uma inclusão não- exclusiva, de modo que um ou mais processos ou composições ou sistemas ou métodos precedidos por "compreende... um" não impede, sem mais restrições, a existência de outros processos, subprocessos, composição, sub composições, composições maiores ou menores ou outros elementos ou outras estruturas ou processos adicionais ou composições ou elementos adicionais ou aspectos adicionais ou características adicionais ou atributos adicionais.

DEFINIÇÃO

[0024] Para os propósitos desta invenção, os seguintes termos terão o significado como aqui especificado.

[0025] Como aqui usado, os termos "Água de Baixa Qualidade" ou "Água de Má Qualidade" ou "Água contendo metais pesados", quando usados no contexto da presente invenção referem-se à água que não pode ser usada diretamente para beber, agricultura, consumo humano ou animal ou outro propósito. Tal água é um resíduo de efluentes industriais contendo metais pesados, hidrocarbonetos, água com alta salinidade, água de esgoto, água de descarte da planta de osmose reversa (RO), água de rio, com a DQO e BOD mais elevados, água com agente de coloração e outros efluentes da indústria de água, etc. Ainda no contexto da presente invenção o "Água de baixa qualidade" ou "Água de má qualidade" também inclui a água, que é ou é encontrada como indesejável e prejudicial ao ser humano, vida animal ou aquática para beber, viver ou para qualquer outro propósito relacionado a sobrevivência ou necessidade do organismo.

[0026] Como aqui usado, o termo "Produtos de alto valor" quando usado no contexto da presente invenção refere-se a vitaminas, pigmentos, antioxidantes, ácidos graxos poliinsaturados de ômega-3 & ômega-6, DHA ou EPA.

[0027] Como aqui usado, o termo "Agentes mutagenizantes ou Agentes mutagênicos ou Genes de Mutação", quando usado no contexto da presente invenção refere-se aos agentes químicos, luz ultravioleta ou um elemento radioativo, que pode induzir ou aumentar a frequência de mutação em um organismo.

[0028] Como aqui usado o termo "linhagens ou Novas linhagens", quando usado no contexto da presente invenção refere-se a novas variantes/linhagens das microalgas produzidas ou desenvolvidas pelo processo da presente invenção. Essas variantes são geneticamente diferentes na sua forma de controle ou origem ou formas originais. Essas variantes são artificialmente desenvolvidas e sobrevivem e desempenham melhor em condições ambientais extremas.

[0029] Como aqui usado o termo "Demanda química de oxigênio ou COD", quando usado no contexto da presente invenção refere-se ao teste normalmente usado para medir indiretamente a quantidade de compostos orgânicos na água. Este determina a quantidade de oxigênio necessário para oxidar um composto orgânico em dióxido de carbono, amônia e água.

[0030] Como aqui usado o termo "Demanda biológica de oxigênio ou BOD", quando usado no contexto da presente invenção refere-se a quantidade de dissolvido necessário pelo organismo biológico aeróbio em um corpo de água para decompor o material orgânico presente em uma dada amostra de água em certa temperatura durante um período específico.

[0031] Como aqui usado o termo "Biocombustíveis", quando usado no contexto da presente invenção refere-se a um combustível que utiliza energia a partir de uma fixação de carbono produzida a partir de microalgas. Esses combustíveis são fabricados de uma conversão de biomassa de microalgas.

[0032] Como aqui usado o termo "Mutagênese ou mutagenizado", quando usado no contexto da presente invenção refere-se a um processo pelo qual a informação genética de um organismo é alterada de maneira estável, resultando em uma mutação. No contexto da presente invenção isto é obtido usando experimentalmente procedimentos laboratoriais ao expor as microalgas a vários agentes mutagênicos.

[0033] Como aqui usado o termo "Fusão de protoplastos ou fusão somática", quando usado no contexto da presente invenção refere-se a modificação genética de microalgas da mesma espécie pela fusão de seus protoplastos (para, por exemplo, em amostras combinadas de C. vulgaris fundida com outras amostras combinadas de C. vulgaris) para formar uma nova planta híbrida com as características de ambas, um híbrido somático.

[0034] Como aqui usado o termo "linhagens Mutantes", quando usado no contexto da presente invenção refere-se a microalgas modificadas por um gene de mutação e fusão de e protoplasto, em que a fusão foi realizada em microalgas da mesma espécie ou conjunto de microalgas da mesma espécie. As linhagens mutantes da presente invenção não representam de maneira alguma ou pretendem se referir a mutantes transgênicos ou microalgas transgênicas ou transgênicos ou material transgênico. Na presente invenção as linhagens não compreendem genes de quaisquer formas de vida mais elevadas ou organismos não- relacionados ou microorganismos não-relacionados. Na presente invenção mesmo as microalgas de diferente gênero não foram cruzadas nem qualquer material genético de diferente gênero de microalgas.

[0035] A presente invenção refere-se a linhagens melhoradas de microalgas. A espécies de microalga na presente invenção foram coletadas de vários locais na Índia. As espécies de algas utilizadas para desenvolver as linhagens da presente invenção incluem microalgas verdes de água doce como Nannochloropsis spp., Chlorella espécies como Chlorella vulgaris, Chlorella salina , Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii , Chlorella minutissima, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiniana, Chroomonas slaina; Cyclotella SP., Dunaliella SP., Botryococcus SP., Haematococcus SP., Nannochloris SP., Neochloris, Onoraphidium SP., Scenedesmus SP., Spirulina platensis, Chlamydomonas SP., ficobilinas, Synechococcus, ou Synechococcus sp...

[0036] Nannochloropsis SP. e Scenedesmus SP. foram coletadas da refinaria IOCL em Panipat, Haryana, Índia. Chlorella vulgaris, Chlorella pyrenoidosa e Synechococcus sp. foram coletadas do solo da IOCL do Centro de R&D, em Faridabad, Haryana, Índia. Chlorella protothecoides e Chlorella emersonii foram coletadas do leito do rio Yamuna, em Nova Deli, Índia.

[0037] Na presente invenção as linhagens preferenciais de microalgas que foram desenvolvidas são: Nannochloropsis sp. (referida neste documento como IOC-105) que foi depositada com Coleta de Cultura de Algas de Protozoários(CCAP), UK sob Tratado de Budapeste, em 26 de novembro de 2013 e dado número de acesso CCAP 849/15; Chlorella vulgaris (referida neste documento como IOC-106) que foi depositada com Coleta de Cultura de Algas de Protozoários(CCAP), UK sob Tratado de Budapeste, em 26 de novembro de 2013 e dado número de acesso CCAP 211/123; Chlorella protothecoides (referida neste documento como IOC-107) que foi depositada com Coleta de Cultura de Algas de Protozoários(CCAP), UK sob Tratado de Budapeste, em 26 de novembro de 2013 e dado número de acesso CCAP 211/126; Chlorella emersonii (referida neste documento como IOC-108) que foi depositada com Coleta de Cultura de Algas de Protozoários(CCAP), UK sob Tratado de Budapeste, em 26 de novembro 2013 e dado número de acesso CCAP 211/125; Chlorella pyrenoidosa (referida neste documento como IOC-109) que foi depositada com Coleta de Cultura de Algas de Protozoários(CCAP), UK sob Tratado de Budapeste em 26 de novembro de 2013 e dado número de acesso CCAP 211/126; Scenedesmus sp. (referida neste documento como IOC-110) que foi depositada com Coleta de Cultura de Algas de Protozoários(CCAP), UK sob Tratado de Budapeste, em 26 de novembro 2013 e dado número de acesso CCAP 276/76 e Synechococcus sp. (referida neste documento como IOC-111) que foi depositada com Coleta de Cultura de Algas de Protozoários(CCAP), UK sob Tratado de Budapeste, em 26 de novembro 2013, e dado número de acesso CCAP 1479/15.

[0038] As linhagens melhoradas assim desenvolvidas pelo processo da presente invenção são úteis para o cultivo em várias águas de baixa qualidade para obter biocombustível e outros produtos de valor agregado.

[0039] De acordo com a presente invenção é fornecido um processo para isolar, selecionar e adotar a mesma para obter linhagens de microalgas, em que a mesma possui a capacidade de crescer em condições extremas de cultivo.

[0040] A presente invenção refere-se também a um processo para melhorar as linhagens mutantes de microalgas obtidas pela adaptação mutagênica e/ou mediada por quimiostato. De acordo com a invenção, as linhagens de microalgas foram melhoradas por mutagênese recursiva e fusão de protoplastos.As microalgas foram mutagenizadas pelos químicos e radiação aplicada aos genes de mutação.

[0041] A população mutante combinada é rearranjada por recombinação homóloga usando a fusão de protoplastos seguida pela seleção de progênies melhoradas e submetendo a mesma para a próxima rodada de seleção. Este processo foi realizado para seis ciclos

[0042] De acordo com a presente invenção as microalgas foram mutagenizadas pelos compostos químicos (EMS, mitomicina C, N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina, benzo(a)pireno e 4-nitroquinolina 1-óxido) e radiação para genes de mutação (UV, raios gama) ou sua combinação. A população mutante combinada é rearranjada pela recombinação homóloga usando a fusão de protoplastos seguida pela seleção de progênies melhoradas e ao submeter a mesma para a próxima rodada de seleção. Este processo foi realizado para seis ciclos. Isto acelera a evolução dirigida através de recombinação recursiva de progênie melhorada, aumentando portanto as características múltiplas. linhagens com maior crescimento, produtividade de lipídios, tolerância ao sal, pH e metais pesados e com capacidade de crescer sob condições autotróficas, foram obtidas.

[0043] Isto acelera a evolução dirigida através de recombinação recursiva de progênie melhorada, aumentando portanto as múltipla características como maior crescimento e produtividade de lipídios, capacidade de utilização de dióxido de carbono, composição de lipídios desejada na biomassa, tolerância ao sal, pH, temperatura e metais pesados. A composição de lipídios obtida de linhagens modificadas foi adequada para a produção de biodiesel.

[0044] As linhagens de microalgas assim desenvolvidas pelo processo da invenção tem a habilidade de crescer na presença de sal com até 3%, em uma faixa de temperatura de 10-45°C, alta intensidade de luz, pH 4,5-10 e metal pesado com até 100-1000 ppm ou mais (TABELA-1). As linhagens assim desenvolvidas possuim composição de lipídios adequada para biocombustível (TABELA 2).

[0045] As linhagens de algas mutantes foram ainda cultivadas em vários fatores bio-químico-físicos como hormônios de crescimento, bactérias específicas, síntese de proteínas que inibem compostos de tiosulfato de sódio, raios ultravioleta; temperatura alta e baixa para melhorar a biomassa, teor de lipídios e/ou sua composição (TABELA 3).

[0046] De acordo com a presente invenção, várias águas de baixa qualidade como águas com contaminação de hidrocarbonetos, águas da planta de efluentes de refinaria de óleo, água de descarte da planta de osmose reversa, água do rio com COD e BOD mais elevados, água com agente corante e outros efluentes de indústria tem sido utilizadas para o cultivo de algas.

[0047] De acordo com a invenção, as linhagens de microalgas da presente invenção são usadas para sequestrar dióxido de carbono de várias fontes como gás de combustão, exaustão de planta de biogás e outras fontes de CO2 concentrado contendo CO2 na faixa de 0,05-50%, auxiliando portanto na redução da poluição (TABELA 4).Tabela 4: Crescimento em água de baixa qualidade e concentração alta/baixa de CO2

[0048] Consequentemente, a principal aplicação da presente invenção fornece linhagens de microalgas pertencentes a algas verdes e algas azuis verdes selecionadas do gênero composto de Nannochloropsis, Chlorella, Scenedesmus e Synechococcus.

[0049] Outra aplicação da presente invenção fornece as linhagens que são Nannochloropsis IOC-105, Chlorella vulgaris IOC-106, Chlorella protothecoides IOC-107, Chlorella emersonii IOC-108, Chlorella pyrenoidosa IOC- 109, Scenedesmus sp. IOC-110, Synechococcus sp-IOC-111.

[0050] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece linhagens contendo alto teor de lipídios, maior taxa de crescimento, capacidade de utilização de CO2 e composição de lipídios desejada na biomassa.

[0051] Outra aplicação da presente invenção fornece linhagens em que as linhagens são úteis como biocombustíveis e para produtos de valor agregado selecionados do grupo composto por vitaminas, pigmentos, antioxidantes, ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e ômega-6, ácido docosahexaenóico (DHA) e ácido eicosapentaenóico (EPA).

[0052] Outra aplicação da presente invenção fornece linhagens em que as linhagens toleram altas salinidade, pH, contaminação por metais pesados, temperatura e intensidade de luz.

[0053] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece linhagens em que as linhagens possuem a capacidade de crescer sob condições de salinidade na faixa de 0,5-3%.

[0054] Mais uma aplicação da presente invenção fornece linhagens, em que as linhagens podem crescer na faixa de temperatura de 10-45°C.

[0055] Outra aplicação da presente invenção fornece linhagens, em que as linhagens podem crescer em ampla faixa de pH de 6,5-10.

[0056] Outra aplicação da presente invenção fornece as linhagens as quais podem ter tolerância à metais pesados na faixa de 100-1000 ppm.

[0057] Outra aplicação da presente invenção fornece linhagens de microalgas, em que a linhagem de microalgas possui saturados na faixa de 2685%.

[0058] Outra aplicação da presente invenção fornece linhagem de microalgas, em que a linhagem de microalgas contém saturados na faixa de 3270%.

[0059] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece linhagem de microalgas, em que a linhagem de microalgas contém teor de lipídios na faixa de 20-35%.

[0060] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece linhagem de microalgas, em que a linhagem de microalgas possui um teor de lipídios na faixa de 26-33%

[0061] Mais uma aplicação da presente invenção fornece uma linhagem de microalgas em que a linhagem de microalgas possui biomassa na faixa de 2-7g/l.

[0062] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece linhagem de microalgas em que a linhagem de microalgas possui biomassa na faixa de 2 a 6g/l.

[0063] Outra aplicação da presente invenção fornece linhagem de microalgas, em que a linhagem de microalgas possui biomassa na faixa de 2,825,1 g/l.

[0064] Outra aplicação da presente invenção fornece linhagem de microalgas, em que a linhagem de microalgas possui saturados na faixa de 2670%.

[0065] Outra aplicação da presente invenção fornece linhagem de microalgas, em que a linhagem de microalgas possui teor de lipídios na faixa de 30,45-21,4%.

[0066] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo de preparação de linhagens de microalgas, o dito método compreendendo as etapas de: a) isolar as microalgas de águas de baixa qualidade; b) cultivar microalgas em meio de cultura de algas (AIM); c) adaptar as microalgas pelo cultivo em meio composto por meio de isolamento de algas, água de baixa qualidade contendo metais pesados na faixa de 100-1000 ppm, hidrocarbonetos na faixa de 0,001% - 2% e alta concentração de sal de até 3%; d) cultivar microalgas em meio de cultura por doze ciclos; e) tratar as microalgas com agentes mutagenizantes; f) obter microalgas mutagenizadas; g) isolar os protoplastos de microalgas mutagenizada da etapa (c); h) rearranjar o protoplasto obtido na etapa (d) para fusão usando 60% de PEG-6000; i) cultivar as microalgas do protoplasto fundido em meio AIM contendo 0,5 M de agente osmótico; j) realizar as etapas (d) até (f) por seis ciclos ou gerações sob condições rigorosas de crescimento; e k) obter as novas linhagens de microalgas.

[0067] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo, em que as microalgas são selecionadas a partir do grupo composto de algas verdes e algas azuis-verdes.

[0068] Mais uma aplicação da presente invenção fornece um processo, em que as microalgas pertencem ao gênero selecionado a partir do grupo composto de Nannochloropsis, Chlorella, Scenedesmus e Synechococcus.

[0069] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo, em que as novas linhagens compreendem Nannochloropsis IOC-105, Chlorella vulgaris IOC-106, Chlorella protothecoides IOC-107, Chlorella emersonii IOC-108, Chlorella pyrenoidosa IOC-109, Scenedesmus sp. IOC-110, Synechococcus sp-IOC-111.

[0070] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo, em que os agentes mutagenizantes na etapa (e) são selecionados a partir do grupo composto por EMS, mitomicina C, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, benzo(9)pireno e 4-nitroquinolina 1-óxido, raios UV, raios gama ou a combinação dos mesmos, preferencialmente EMS.

[0071] Uma aplicação da presente invenção fornece um processo, em que, o agente osmótico na etapa (i) é a sacarose.

[0072] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo, em que as microalgas são úteis para a produção de biocombustíveis e produtos de valor agregado selecionados do grupo composto por vitaminas, pigmentos, antioxidantes, ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e ômega-6, DHA ou EPA.

[0073] Mais uma aplicação da presente invenção fornece um processo, em que as microalgas possuim alta tolerância a salinidade de até 3%, tolerância de pH na faixa de 4,5-10, tolerância à contaminação por metais pesados na faixa de 100-1000ppm, tolerância à temperatura na faixa de 10-45°C e tolerância à intensidade da luz.

[0074] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo, em que as microalgas possuim uma taxa de crescimento, produtividade de lipídios, capacidade de utilização de CO2 mais elevadas e composição de lipídios na biomassa desejada.

[0075] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo em que a linhagem de microalgas possui saturados na faixa de 26-85%.

[0076] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo em que a linhagem de microalgas possui saturados na faixa de 32 até 70%.

[0077] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo em que a linhagem de microalgas possui teor de lipídios na faixa de 2035%.

[0078] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo em que a linhagem de microalgas possui teor de lipídios na faixa de 2633%

[0079] Mais uma aplicação da presente invenção fornece um processo em que a linhagem de microalgas possui biomassa na faixa de 2-7g/l.

[0080] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo em que a linhagem de microalgas possui biomassa na faixa de 2 até 6g/l.

[0081] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo em que a linhagem de microalgas possui biomassa na faixa de 2,82-5,1 g/l.

[0082] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo em que a linhagem de microalgas tem saturados na faixa de 26-70%.

[0083] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo em que a linhagem de microalgas possui teor de lipídios na faixa de 21,430,45%.

[0084] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para o teor de biomassa e lipídios das microalgas, o dito processo compreendendo as etapas de: a) Cultivar microalgas em um meio constituído de meio de cultura de algas; b) Adição de auxinas e citocininas na faixa de 0,25-10 ppm durante a fase de retardo da cultura de microalgas; c) Expor as microalgas da etapa (b) aos raios UV por 2 horas em fase logarítmica; d) Adicionar tiossulfato de sódio na faixa de 0,05-2% na fase de retardo do registro para microalgas da etapa (c); e) Incubar as microalgas da etapa (d) a 10°C por 6 horas; f) Adicionar extrato de diferentes plantas em água quente às microalgas da etapa (e); e g) Obter microalgas com alto teor de lipídios e biomassa.

[0085] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que as microalgas são algas verdes ou azuis-verdes.

[0086] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que as microalgas pertencem ao gênero selecionado a partir do grupo composto de Nannochloropsis, Chlorella, Scenedesmus e Synechococcus.

[0087] Uma aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que as linhagens de microalgas compreendem Nannochloropsis IOC-105, Chlorella vulgaris IOC-106, Chlorella protothecoides IOC-107, Chlorella emersonii IOC-108, Chlorella pyrenoidosa IOC-109, Scenedesmus sp. IOC-110, Synechococcus sp-IOC- 111.

[0088] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que as etapas (b) até (f) devem ser realizadas de uma dita maneira sequencial para obter as linhagens de microalgas com elevada biomassa e teor de lipídios.

[0089] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar a biomassa e o teor de lípidos das microalgas, em que as novas linhagens são úteis para a produção de biocombustíveis e produtos de valor agregado selecionados do grupo composto por vitaminas, pigmentos, antioxidantes, ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e ômega-6, DHA ou EPA.

[0090] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que as novas linhagens toleram alta salinidade de até 3%, pH na faixa de 4,5-10, contaminação por metais pesados na faixa de 100-1000 ppm, temperatura na faixa de 10-45°C e a intensidade da luz.

[0091] Mais uma aplicação da presente invenção para um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que as linhagens possuem maior taxa de crescimento, produtividade de lipídios, capacidade de utilização de CO2 e composição de lipídios na biomassa desejada.

[0092] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que a linhagem de microalgas possui saturados na faixa de 26-85%.

[0093] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que a linhagem de microalgas possui saturados na faixa de 32 até 70%.

[0094] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que a linhagem de microalgas possui teor de lipídios na faixa dos 20-35%.

[0095] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para aumentar a biomassa e lípidos de microalgas, em que a linhagem de microalgas tem teor de lipídios na faixa de 26-33%

[0096] Mais uma aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que a linhagem de microalgas possui biomassa na faixa de 2-7g/l.

[0097] Ainda outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lípidos das microalgas, em que a linhagem de microalgas possui biomassa na faixa de 2-6g/l.

[0098] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que a linhagem de microalgas possui biomassa na faixa de 2,82-5,1 g/l.

[0099] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas em que a linhagem de microalgas possui saturados na faixa de 26-70%.

[00100] Outra aplicação da presente invenção fornece um processo inovador para melhorar o teor de biomassa e lipídios das microalgas, em que a linhagem de microalgas tem teor de lipídios na faixa de 21,4-30,45%.

[00101] Além disto, componentes de meio com custo-benefício principalmente nitrogênio, fósforo e micronutrientes e sua concentração variando de 5 ppm até 5% para elevado crescimento e teor de lipídios tem sido usados. Essas fontes incluem fertilizantes, extrato de resíduo da planta de biogás, líquido precipitado de milho, estrato de esterco de vaca, extrato de plantas, extrato de esterco de aves, e assim por diante.

[00102] Além disso, de acordo com a presente invenção, compostos antibacterianos e/ou fungicidas de origem vegetal são adicionados para inibir o crescimento de bactérias/fungos em meios de cultivo de microalgas.

[00103] Em uma aplicação da invenção, durante o cultivo de algas, extrato da planta em água quente inibiu o crescimento de bactérias/fungos em meios de cultivo de algas. O extrato da planta de origem em água quente, não apenas inibe o crescimento de micróbios indesejados em lagoas abertas mas também melhora o crescimento das algas.

[00104] A presente invenção divulga ainda um método para o cultivo em lagoa aberta / foto-bioreator/bolsas de PE. De acordo com a invenção, a biomassa de algas cultivadas em lagoa aberta / foto-bioreator/bolsas de PE ou em outros meios de cultivo é colhida seguido pelo rompimento da célula pelo método mecânico, exposição química, alterações de salinidade ou mudanças de pH e subsequentemente extração do óleo usando a combinação de solventes polares e apolares em uma temperatura adequada, em que a temperatura pode variar entre 3080 graus C.

[00105] Os exemplos não limitantes a seguir ilustram aplicações específicas da presente invenção. Eles não são destinados a serem limitantes do escopo da presente invenção de forma alguma.

[00106] A invenção será agora explicada com a ajuda dos seguintes exemplos. Entretanto, o escopo da invenção não deve ser limitado a estes exemplos já que o técnico pode facilmente variar a proporção dos ingredientes e suas combinações.

EXEMPLOS Exemplo 1 Isolamento de algas

[00107] As algas foram isoladas de água diversa e amostras de solo coletadas de várias fontes. As amostras de água e solo coletadas foram inoculadas no meio, denominado como meio de isolamento das algas (AIM), contendo (g/L) Na2 CO3 (0,5-5), NaHCO3 (1-5) KH2PO4 (0,5-4,8), K2HPO4 (0,5-5), MgSO4 (0,01-1,0), (NH4)2tão4 (0,25-0,50), KNO3 (0,15-4,75), Uréia (0,15-4,75), Di- amônio fosfato (0,15-4,75), ZnSO4 (0,2-2,1), NaCl (0,2-10) Elemento Residual (2ml até 10 ml de solução). A solução do elemento residual (grama por litro) compreende ácido nitrilotriacético (0,1-1,0), FeSO4.7H2O (0,01-0,15), MnCl2.4H2O (0,001-0,005), CoCl2.6H2O (0,005-0,02), CaCl2.2H20 (0,01-0,5), ZnCl2 (0,01-0,15), CuCl2.H2O (0,01-0,03), H3BO3 (0,002-0,02), Na2MoO4 (0,001-0,02), Na2SeO3 (0,005-0,02), NiSO4 (0,01-0,03), SnCl2 (0,01-0,03). Cada 1000 ml do balão que continha 500 ml do meio acima foi esterilizado. Este foi inoculado com 5-10% do solo ou da amostra de água. Os frascos foram incubados a 45°C durante 2-10 dias na presença de luz e CO2 foi continuamente pulverizado. Após a conclusão da incubação, a cultura de 1 ml foi centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos. As células que estavam flutuando foram re-inoculadas no meio acima onde KNO3 foi omitido da AIM. Isso foi repetido por um total de doze ciclos. Depois do quinto ciclo o solvente utilizado para a preparação do meio foi água de baixa qualidade, ou seja, água contendo metais pesados (100-500 ppm), hidrocarbonetos (0,001% - 2%), e alta salinidade (3%). Para o ciclo nr. 8 e 9a temperatura de incubação foi mantida a 25 graus C e para os próximos três ciclos (ou seja, ciclos 10, 11 e 12) foi mantida a 45 graus C. Após a conclusão dos 12 ciclos de cultura, ela foi centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos e então inoculado com com diluição de séria em AIM + placa de agarose. O laminado foi incubado a 45 graus C em presença de luz. Colônias esverdeadas de crescimento rápido foram escolhidas e cuidadosamente transferidas para uma nova placa. As colônias purificadas são seletivamente coletadas e inoculadas em frascos contendo meio de crescimento, incluindo mas não limitado aos componentes do meio basal, para nova cultura.

[00108] As linhagens selecionadas de algas foram caracterizadas de acordo com as suas sequências de genes 18S rRNA, usando os manuais e condições conhecidas na técnica anterior. As sequências de gene 18S rRNA resultantes foram alinhadas e comparadas com as sequências de nucleotídeos de algumas microalgas conhecidas no banco GenBank do "National Center for Biotechnology Information", usando a ferramenta de busca "Basic Local Alignment Search Tool (BLAST®)".

Exemplo 2 Preparação de linhagens Mutantes

[00109] EMS foi adicionado em 5 ml de cultura de fase logarítmica de Chlorella vulgaris IOC-106 em um tubo de centrífuga de 15 ml para uma concentração final de 0,42 gL-1 e a suspensão de cultura foi ainda incubada em um banho de água a 45°C durante 15 minutos. A diluição da cultura 20 vezes com pré-resfriados, frescos posteriormente encerrou o tratamento. As células mutantes foram centrifugadas e transferidas para o meio contendo a concentração de sal de 1%, concentração de metais pesados (200 ppm), pH (10). Após a incubação de 24h em 45°C sob condições de luz e na presença de CO2, o caldo de cultura foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos e as células que foram sedimentadas por centrifugação foram laminadas em placas de ágar contendo a concentração de sal de 1%, alta concentração de metais pesados (200 ppm), pH elevado (10). As placas foram incubadas a 45 °C por 48 horas em luz e presença de CO2. Protoplastos foram preparados de acordo com o método conhecido na técnica anterior. Para o rearranjo, protoplastos foram fundidos por suspensão na solução tampão (0,5 M de sacarose, 10mM de Tris-HCl, 20mM de MgCl2) contendo 15% de dimetil sulfóxido e 60% de PEG-6000. A suspensão resultante foi incubada a 25°C por 50 minutos. A preparação de protoplastos fundidos foi diluída com meio de regeneração (meio AIM contendo 0,5 M de sacarose) e protoplastos foram coletados por centrifugação a 3500 rpm por 10 minutos a 25°C. As células de protoplastos flutuantes foram coletadas e foram re-suspensas em meio de regeneração e agitadas a 200 rpm por 12 h antes de laminadas em placas de ágar com superior concentração de sal a 2%, concentração de metais pesados (250 ppm), pH (11). O laminado foram raspado para gerar uma coleção de fusão combinada. A formação de protoplastos, sua fusão e sua subsequente regeneração foi repetida seis vezes com células regeneradas combinadas a partir de uma fusão sendo o inóculo para a cultura de protoplastos subsequentes. Em cada ciclo as células foram selecionadas em condições rigorosas de crescimento em relação ao pH, salinidade, concentração de metais pesados. Controles não- rearranjados foram preparados pela formação recursiva e regeneração dos protoplastos sem exposição a PEG. Este processo foi realizado por seis ciclos. Isto acelera a evolução dirigida através de recombinação recursiva de progênie melhorada, aumentando portanto as características múltiplas.

[00110] As linhagens de microalgas assim desenvolvidas pelo processo da invenção possuim a capacidade de crescer em presença de sal de até 3%, em uma faixa de temperatura de 10-45 graus C, alta intensidade de luz, pH 4,5-10 e metal pesado a 100-1000 ppm (Tabela 1). As linhagens assim desenvolvidas possuim composição de lipídios adequada para biocombustíveis (Tabela 2).Tabela: 1. Crescimento e teor de lipídios em vários ciclos de melhoria (linhagem Chlorella vulgaris IOC-106)

* nenhuma melhoria foi vista após o sexto ciclo, portanto nenhuma mutagênese e fusão de protoplasto adicionais foram realizadas. Tabela 2 - Composição de lipídios da linhagem selvagem e melhorada (linhagem Chlorella vulgaris IOC-106) *. Crescimento sob luz e 50% ar misturado com CO2.

[00111] Os fatores acima dados são adicionados de forma sequencial em concentrações adequadas. A adição de hormônios de crescimento (auxinas & citocininas) em 0,25 ppm até 10 ppm no meio durante a inoculação, reduzem significativamente a fase logarítmica. A adição de tiossulfato de sódio na fase logarítmica tardia de crescimento de 0,05-2% melhorou o teor de lipídios. Observou-se que a exposição das células em UV por 2-5 minuto na fase logarítmica melhora o crescimento bem como o teor de lipídios e suas composições de ácidos graxos. Verificou-se que o crescimento das algas em temperaturas diferentes bem como variar a temperatura durante o crescimento das microalgas melhora o crescimento das algas bem como seu teor de ácidos graxos e composições. Além disso verificou-se que a adição de extratos de plantas e suas partes como neem, lantana, etc tem demonstrado melhora no crescimento das algas. A nova característica do processo refere-se à sequência em que os vários ingredientes da composição são adicionados durante o processo. Foi descoberto na presente invenção que a adição e/ou mistura das várias composições dos ingredientes da forma sequencial como aqui descrito, conforme a descrição da especificação e as reivindicações permite ou fornece um modo benéfico máximo para aumentar a biomassa, teores de lipídios e saturados das linhagens de algas. Verificou-se que este modo sequencial não é apenas útil para melhorar a biomassa, teores de lipídios e saturados do controle ou microalgas não modificadas mas também das novas linhagens.

[00112] Tabela 3 - Modulação das condições de crescimento, levando a uma biomassa melhorada da linhagem melhorada (linhagem: Chlorella vulgaris IOC-106). A sequência de adição, tempo e concentração e vários fatores bio-físico-químicos como hormônios de crescimento, bactérias específicas, compostos químicos de tiosulfato de sódio para inibição de síntese de proteínas, raios ultravioleta; alta e baixa temperatura são usados para melhorar a biomassa, teor de lipídios e/ou sua composição. Tabela 3: Meio para modulação das condições de crescimento levando a uma biomassa melhorada da linhagem melhora.

Meio-1: Meio normal do Exemplo-1 + auxinas e citocininas, (2,5 ppm cada) durante a fase logarítmica, seguida de exposição aos raios UV por 2 minutos em fase logarítmica, seguido por 0,5% de tiossulfato de sódio de fase logarítmica, seguido de incubação a 45 graus C por 6 horas. Meio-2: Meio normal do exemplo-1 + auxinas e citocininas, (2,5 ppm cada) durante a fase logarítmica, seguida de exposição aos raios UV por 2 minutos em fase logarítmica, seguida por 0,5% de tiossulfato de sódio em fase logarítmica, seguida de incubação a 10 graus C por 6 horas. Meio-3: Meio normal do Exemplo-1 + (Novo Meio 1 ou Novo Meio-2). Adição do extrato em água quente do extrato de Neem

Exemplo 4 Preparação do extrato da planta

[00113] A composição da invenção inclui extrato de diferentes partes das plantas como a lantana, tabaco, neem, mahendi, vegetais ou material de plantas frutíferas e/ou as misturas destas. Material de plantas inclui o caule, folhas e frutos da planta e qualquer parte da planta. Em um aspecto particularmente importante, o material da planta é seco, pulverizado e extraído com água, sequencialmente ou simultaneamente em diferentes temperaturas, pressões para remover os compostos contendo capacidade para inibir o crescimento de bactérias indesejáveis e estimular o crescimento de algas. As temperatura variam de 40-100 °C, preferencialmente de 55-80 °C e a pressão varia de pressão atmosférica até 15 libras. O material extraído foi ainda purificado usando a técnica conhecida como cromatografia em coluna e cada fração foi avaliada por sua capacidade de inibir o crescimento de bactérias indesejáveis e estimular o crescimento de algas. O extrato da planta foi eficaz na concentração que varia de 1-10% (v/v) no meio.

Claims

1. PROCESSO DE MELHORIA DA BIOMASSA E TEOR DE LIPÍDIOS DE MICROALGAS, caracterizado pelo fato de o dito processo compreender as etapas de: a) preparar linhagens de microalgas possuindo saturados na faixa de 26-85%, em que a dita preparação compreende as etapas de: (i) isolar as microalgas de águas de baixa qualidade; (ii) cultivar as microalgas isoladas em meio de cultura de algas; (iii) adaptar as microalgas cultivadas através de cultivo por doze ciclos em um meio compreendendo um meio de isolamento de algas, água de baixa qualidade contendo metais pesados na faixa de 100-1000 ppm, hidrocarbonetos na faixa de 0,001% - 2% e alta concentração de sal de até 3%; (iv) tratar as microalgas adaptadas com agentes mutagenizantes selecionados a partir do grupo consistindo de: Metano Sulfonato de Etila (EMS), mitomicina C, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, benzo(9)pireno e 4-nitroquinolina 1-óxido, raios UV, raios gama e a combinação destes; (v) obter microalgas mutagenizadas; (vi) isolar protoplastos das microalgas mutagenizadas; (vii) rearranjar os protoplastos para fusão usando 60% de PEG-6000; (viii) cultivar as microalgas do protoplasto fundido em meio de cultura de alga contendo 0,5 M de agente osmótico; e (ix) realizar as etapas (iv) até (vi) para seis ciclos ou gerações sob condições rigorosas de crescimento; b) cultivar as microalgas obtidas na etapa (a) em um meio compreendendo um meio de cultura de algas; c) adicionar auxinas e citocininas na faixa de 0,25-10 ppm durante a fase logarítmica de cultura de microalgas; d) expor as microalgas da etapa (c) aos raios UV por 2 horas em fase logarítmica; e) adicionar tiossulfato de sódio na faixa de 0,05-2% na fase logarítmica tardia às microalgas da etapa (d); f) incubar as microalgas da etapa (e) a 10°C por 6 horas; g) adicionar o extrato em água quente de plantas às microalgas de etapa (f), sendo que as plantas são escolhidas entre lantana, tabaco, neem, mahendi, material de plantas frutíferas e/ou misturas destas, sendo que o extrato adicionado é obtido da seguinte forma: secar e pulverizar o material da planta e extrair com água, sequencialmente ou simultaneamente em temperaturas que variam de 40-100°C, preferencialmente de 55-80°C e na pressão que varia de pressão atmosférica até 15 libras; purificar o material extraído por cromatografia em coluna e avaliar cada fração por sua capacidade de inibir o crescimento de bactérias e estimular o crescimento de algas; e h) obter as microalgas com alto teor de lipídios e biomassa melhorada, sendo que as microalgas pertencem a um gênero selecionado a partir do grupo compreendendo Nannochloropsis, Chlorella, Scenedesmus e Synechococcus.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as etapas (c) até (g) serem realizadas de uma maneira sequencial para obter as microalgas com alto teor de lipídios e biomassa melhorada, tolerância à salinidade de até 3%, tolerância de pH na faixa de 4,5-10, tolerância à contaminação por metais pesados na faixa de 100-1000 ppm, tolerância à temperatura na faixa de 10-45°C, tolerância à intensidade de luz e capacidade de utilização de CO2.

3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de o agente osmótico ser sacarose.