CZ306149B6

CZ306149B6 - Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsob produkce kyseliny dokosahexaenové

Info

Publication number: CZ306149B6
Application number: CZ2014-662A
Authority: CZ
Inventors: Petr Kaštánek; Dana Savická; Kateřina Demnerová
Original assignee: Ecofuel Laboratories S.R.O.; Vysoká škola chemicko - technologická v Praze
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2016-08-24
Also published as: CZ2014662A3

Abstract

Vynález se týká produkčního kmene Japonochytrium sp. AN4-10, produkujícího oleje s vysokým obsahem polynenasycených mastných kyselin, uloženého ve Sbírce mikroorganismů ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT (DBM), vedené Vysokou školou chemicko-technologickou, Ústavem biochemie a mikrobiologie, Technická 5, 166 28 Praha 6, pod přírůstkovým číslem DBM 509. Používá se pro výrobu kyseliny dokosahexaenové. Způsob její výroby spočívá v tom, že produkční kmen podle nároku 1 se kultivuje v kapalném médiu obsahujícím organický uhlík, načež po kultivaci se oddělí biomasa a/nebo lipidy obsahující kyselinu dokosahexaenovou a/nebo volná kyselina dokosahexaenová.

Description

Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsob produkce kyseliny dokosahexaenové

Oblast techniky

Vynález se týká produkčního kmene Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsobu produkce kyseliny dokosahexaenové.

Dosavadní stav techniky

Z nutričního hlediska jsou vysoce ceněné nenasycené mastné kyseliny s dlouhými řetězci (s obsahem C > 18), které nejsou vyšší rostliny schopné syntetizovat, jako jsou kyseliny ARA (struktura 20:4 omega 6,9,12,15), DHA (struktura 22:6 omega 3,6,9,12,15,18) a EPA (struktura 22:5 omega 3,6,9,12,15), které jsou nepostradatelné jako korektory vývoje mozku a očí u dětí, resp. jako doplňky pro kardiovaskulární péči u dospělých. Klinické studie potvrzují též účinky při léčbě aterosklerózy, rakoviny, revmatoidní artritidy a degenerativních onemocnění spojených s věkem, jako makulámí degenerace či Alzheimerovy choroby (Simopoulos, A. P., R. R. Kifer, R. E. Martin, and S. M. Barlaw (eds.), Health Effects of ω -3 Polyunsaturated Fatty Acids, S. Karger AG, Basel, Switzerland, 1991; Nettleton, A.J. (ed.), Omega-3 Fatty Acids and Health, Chapman and Hall, New York, 1995; Drevon, C. A., I. Baksaas, and Η. E. Krokan (eds.), Omega-3 Fatty Acids: Metabolism and Biological Effects, Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland, 1993).

Průmyslově využívaným zdrojem omega-3 mastných kyselin je rybí olej, obsahující až 30% EPA a DHA (Galii, C, and A. P. Simopoulos (eds.), Dietary ω3 and ω6 Fatty Acids: Biological Effects and Nutritional Essentiality, Plenum Press, New York. 1989). Využití rybího oleje je však spojeno s řadou problémů, zejména nepříjemnou chutí a vůni, problémy se stabilitou produktu, vysokými náklady na izolaci ze směsi s jinými mastnými kyselinami. V neposlední řadě hrají významnou roli faktory environmentální, riziko kontaminace rybích tuků toxickými látkami, např. PCB a snižování stavu populací mořských ryb.

Tyto faktory, spolu s faktem, že ryby získávají nenasycené mastné kyseliny konzumací primárních producentů - zooplanktonu - vedly k intenzivnímu výzkumu možností produkce nenasycených mastných kyselin pomocí mořských mikroorganismů, zejména jednobuněčných řas (Yongmanitchai, W., and O. P. Ward, Omega-3 Fatty Acids: Alternativě Sources of Production, Process Biochem. 24:117-125 (1989). US 6 582 941 popisuje způsob přípravy olejů s vysokým obsahem DHA a DPA a nízkým obsahem (nejvýše 2 % hmotn.) EPA kultivací kmene Schizochytrium sp. SR21(FERM BP-5034) v médiu obsahujícím zdroj uhlíku a dusíku. Způsob zvyšování obsahu olejů/tuků v mikrořasách metodami mutageneze tj. ozařováním v exponenciální fázi růstu za specifických podmínek popisuje CN 103952394.

Při kultivaci mikroorganismů jsou užívány zejména techniky heterotrofní kultivace na glukóze jako zdroji uhlíku, např. v procesu firmy Martek Biosciences využívající fermentaci mikroorganismu Crypthecodinium cohnii (Radmer, R. J., and T. C. Fisher, Large Scale Production of Docosahexaenoic Acid (DHA), in Proceedings of Seventh International Conference, Opportunities from Micro- and Macro-algae, International Association of Applied Algology, Knysna, South Africa, 1996, p. 60). Mezi další průmyslově využitelné procesy a organismy patří např. heterotrofní kultivace mikroorganismu Schizochytrium sp., kmene Ulkenia sp. (např. proces výroby DHActive společnosti Lonza) či Odontella aurita. Pro produkci ARA bylo realizováno několik technologií využívající zejména kultivaci plísně Mortierella alpíne. WO 2014/060973 popisuje nové kmeny řas, připravené kultivací v médiu a následnou mutagenezí, izolací, fúzí protoplastů a následnou kultivací. Tyto kmeny lze rovněž využívat pro výrobu PUFA (DHA).

- 1 CZ 306149 B6

Podstata vynálezu

Úlohou vynálezu je odstranit shora popsané nevýhody při produkci nenasycených mastných kyselin DHA.

Tento úkol se vyřeší s pomocí produkčního kmene Japonochytrium sp. AN4-10, produkujícího oleje s vysokým obsahem polynenasycených mastných kyselin, uloženého ve Sbírce mikroorganismů ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT (DBM), vedené Vysokou školou chemickotechnologickou, Ústavem biochemie a mikrobiologie, Technická 5, 166 28 Praha 6., pod přírůst10 kovým číslem DBM 509. Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10 si dlouhodobě udržuje produktivitu biomasy a nenasycených mastných kyselin až o 87 % vyšší, nežli má původní mikroorganismus. Je tolerantní k velkému rozmezí kultivačních teplot v rozsahu cca 15 až 35 °C, nárazově až 38 °C.

Produkční kmen podle vynálezu se s výhodou používá pro výrobu kyseliny dokosahexaenové. Způsob produkce kyseliny dokosahexaenové přitom spočívá v tom, že produkční kmen podle vynálezu se kultivuje v kapalném médiu obsahujícím organický uhlík, načež po kultivaci se oddělí biomasa a/nebo lipidy obsahující kyselinu dokosahexaenovou a/nebo volná kyselina dokosahexaenová. Kultivace kultury Japonochytrium sp. AN4-10 se přitom může provádět ve 20 fermentorech na uhlíkatém substrátu. Jako zdroj organického uhlíku kapalné médium u způsobu podle vynálezu může obsahovat alespoň jednu látku ze skupiny obsahující glukózu, glycerol, surový glycerol z výroby biopaliv, kyselinu octovou či její estery nebo etanol. Vypěstovanou biomasu je možno využít přímo vlhkou (např. jako krmné aditivum pro ryby, drůbež či hospodářská zvířata), popř. po odvodnění (např. vysušením na sprejové sušárně). Suchou biomasu je 25 možno s výhodou použít jako zdroj DHA pro výrobu nutraceutik a doplňků stravy i krmiv.

Výroba kyseliny dokosahexaenové podle vynálezu dále může pokračovat separací lipidů obsahují jících DHA či volné DHA z kultivačního média nebo vlhké či suché biomasy pomocí fyzikálněchemických separačních metod, jako je lisování, extrakce rozpouštědly, suprakritická extrakce >3θ CO₂, působení ultrazvuku a/nebo mikrovlnného záření, extrakce spojená s chemickou reakcí atd.

Takto extrahované lipidy či frakce lipidů mohou být dále rafinovány s cílem oddělení jiných mastných kyselin a získání DHA o vyšší čistotě. Takovýto produkt pak může být s výhodou využit jako surovina ve speciálních potravinářských, farmaceutických a kosmetických aplikacích.

Po extrakci lipidů z biomasy může být zbytek biomasy po částečném či úplném odstranění lipidů s výhodou využit jako doplněk krmivá pro zvířata, neboť obsahuje vysoké množství proteinů a dále významné obsahy pigmentů s antioxidačními účinky, zejména karotenoidů.

Objasnění výkresů

Vynález je dále blíže objasněn na příkladech svého provedení pomocí výkresů, kde znázorňuje:

Obr. 1 klastr buněk Japonochytrium sp. AN-4 obarvených Nile red se zářícími globulemi lipidů v UV mikroskopii,

Obr. 2 uvolňující se zoospory Japonochytrium sp. AN^J, obarveno Nile red, UV mikroskopie,

Obr. 3 růstové křivky kmenů AN 1-5 (vyjádřené jako OD₄₅₀) v mikrotitrační destičce,

Obr. 4 vliv počáteční koncentrace substrátu (glukosy) na koncentraci buněk v suspenzi (vyjádřené jako OD₄₅₀) po 3 dnech kultivace kmene AN4 v 250ml Erlenmayerových baňkách na třepačce,

-2CZ 306149 B6

Obr. 5 srovnání růstových charakteristik původního kmene AN4 a dvaceti vybraných mutantů,

Obr. 6 profil mastných kyselin obsažených v biomase kmenů Japonochytrium sp. AN4, AN410aAN4-20,

Obr. 7 srovnání růstové křivky původního kmene AN4 a produkčního kmene AN4-10,

Obr. 8 složení mastných kyselin obsažených v biomase produkčního kmene Japonochytrium sp. AN4-10.

Příklady uskutečnění vynálezu

Výroba kyseliny dokosahexaenové podle vynálezu dále může pokračovat separací lipidů obsahu15 jících DHA či volné DHA z kultivačního média nebo vlhké či suché biomasy pomocí fyzikálně— chemických separačních metod, jako je lisování, extrakce rozpouštědly, suprakritická extrakce CO₂, působení ultrazvuku a/nebo mikrovlnného záření, extrakce spojená s chemickou reakcí atd. Takto extrahované lipidy či frakce lipidů mohou být dále rafinovány s cílem oddělení jiných mastných kyselin a získání DHA o vyšší čistotě. Takovýto produkt pak může být s výhodou 20 využit jako surovina ve speciálních potravinářských, farmaceutických a kosmetických aplikacích.

Po extrakci lipidů z biomasy může být zbytek biomasy po částečném či úplném odstranění lipidů s výhodou využit jako doplněk krmivá pro zvířata, neboť obsahuje vysoké množství proteinů a 25 dále významné obsahy pigmentů s antioxidačními účinky, zejména karotenoidů.

Příklad I

V mangrovníkové oblasti poloostrova Ancon, Kuba byl proveden sběr spadaného mengrovníkového listí z mořské vody z hloubky cca 10 až 100 cm pod hladinou. Z listů byly sterilně odebrány sekce o rozměrech cca 10 x 25 mm, 3 x promyty 15% sterilní mořskou vodou doplněnou 0,3 g/1 penicilinu a 0,3 g/1 streptomycinu pro potlačení bakteriálního růstu. Poté byly umístěny na agar, obsahující kvasničný extrakt, pepton, mořskou sůl a antibiotika. Byly izolovány morfo35 logicky odlišné kmeny, označované jako AN-1, AN-2, AN-3, AN-4, AN-5, AN-6. Metodou 18sRNA byly kmeny identifikovány jako Japonochytrium sp., řád Traustochytriales. Tyto organismy se primárně vyskytují v mořských biotopech, na povrchu řas či rostlin a v organickém detritu. Trofickou fázi tvoří nepohyblivé, pouze po substrátu se pohybující vegetativní buňky, většinou kulovité ale i vejčité či elipsoidní, viz obr. 1. Dochází k vytváření tzv. ektoplazmatic40 kých výběžků, které se spojují v síťovité útvary, označované u tohoto řádu (ve starší literatuře) jako rhizoidy. Jsou produkovány pomocí botrozomů, které se nachází na povrchu buněk. Pomocí těchto výběžků jsou ukotveny k substrátu. Vegetativní buňky se dělí, čímž vzniká útvar, který se zde označuje jako sporangium (jedná se o shluk, sorus buněk), viz obr. 2. Zástupci tohoto řádu netvoří typické kolonie, ale jejich růst se projevuje zvětšováním buňky a následnou přeměnou ve sporangia. Sporangium je obaleno vícevrstvou stěnou, složenou ze šupinek. Uvnitř dochází k dělení a vznikají poměrně malé zoospory (jedná se o mitospory) se 2 bičíky. Po čase přisednou k substrátu, ztratí bičíky a dorůstají.

Příklad 2

Předběžná kultivace všech kmenů prokázala dobrý růst na glukose a glycerolu jako substrátu, a to při počátečních koncentracích substrátu v širokém rozmezí 5 až 170 g/1. Koncentrace substrátu > 100 g/1 vykazují již zpomalení růstu, či delší lag-fázi (viz obr. 4). V souladu s literárními 55 údaji vykazují horší růst na disacharidech (laktosa), nežli monosacharidech (glukosa). Růstová

-3CZ 306149 B6 rychlost na glycerolu odpovídá glukose. Stacionární fáze dosahují za cca 3 až 4 dny růstu. Optimální salinita se jeví kolem 9 až 18 g/1. Obsah DHA se pohybuje až kolem 12 až 16 % v sušině, resp. 46 až 56 % podílu mastných kyselin, což odpovídá nejlepším literárním údajům a z kmenů činí kandidáty na průmyslovou kultivaci. Z kultivačních testů na médiu o složení 20 g/1 glukosa, 5 10 g/1 kvasniční extrakt, 18 g/1 NaCl při pH média 7 a teplotě 28 °C plyne, že vysokou růstovou rychlostí a obsahem DHA vyniká kmen, označený pracovně jako Japonochytrium sp. AN-4 (viz obr. 3). Proto byl zvolen pro následnou mutagenezi.

i o Příklad 3

K vyvolání mutací buněk bylo použito UV záření. Buňky v suspenzi o koncentraci 5,8 x 10⁴ b/ml byly vystavovány záření o vlnové délce 360 nm na vzdálenost 18,5 cm po dobu 10 s, kdy docházelo k přežívání 1,5 x 10² b/ml. Byl sledován vliv osvitu na růst buněk a fenotypové 15 vlastnosti kolonií. Mutageneze byla provedena ve tmě, naředění, vyočkování a následná kultivace rovněž. Po 48 h byly nejrychleji rostoucí kolonie vyočkovány. Mutagenezi byla získána řada fenotypově odlišných klonů, které se lišily od původních kmenů vzhledem kolonií a rychlostí růstu. U 20 mutantů (současně s původním kmenem AN 4) byla sledována rychlost růstu měřením OD ve zkumavkách (Obr. 5). Je zřejmé, že kmeny AN4-10, AN4-16 a AN4-20 vykazovali 20 o cca 30 % vyšší výtěžek biomasy. U kmenů AN4, AN4-10 a AN4-20 byla sušina analyzována na obsah PUFA. Z výsledků analýz (Obr. 6) plyne, že vysoký podíl DHA v profilu mastných kyselin vykazuje kmen AN4-10, a to 48,65 % mastných kyselin. Z analýzy také plyne, že u tohoto kmene došlo ke snížení obsahu z nutričního hlediska nežádoucí nasycené mastné kyseliny palmitové, a to z 30 na 16 % oproti obsahu v původním kmenu AN4. U kmene AN-20 naproti 25 tomu obsah nasycených kyselin mírně vzrostl a obsah DHA se mírně snížil. Jako produkční byl proto zvolen kmen AN4-10, vyznačující se výrazně zvýšenou produktivitou biomasy i DHA. Tato mutace je dlouhodobě stabilní.

Příklad 4

Byla provedena ověřovací kultivace na glycerolu, kdy z Petriho misky byly buňky původního kmene Japonochytrium sp. AN4 a produkčního kmene Japonochytrium sp. AN4-10 asepticky převedeny do 100 ml sterilního komplexního media (KM) s pH 7, které obsahovalo: glycerol (20 35 g.l¹), kvasničný extrakt (10 g.F¹), chlorid sodný (18 g.l¹), mikroelementy (v mg Γ¹: 40 FeNaEDTA, 88 CaCl₂, 0.83 H₃BO₃, 0,95 CuSO₄.5H₂O, 3,3 MnCI₂.4H₂O, 0,17 (NH4)₆Mo₇O₂₄.4H₂O, 2,7 ZnSO₄.7H₂O, 0,6 CoSO₄.7H₂O, a 0,014 NH₄VO₃) a destilované vody. Kultury v Erlenmeyerově baňce byly umístěny do třepačky (130 rpm) při 23 °C a po dobu 120 h probíhala kultivace. Srovnáním růstových křivek, stanovených měřením optické hustoty suspenze (OD) bylo zjiště40 no, že Japonochytrium sp. AN4-10 dosáhlo o 87% vyššího nárůstu biomasy nežli původní kmen, konkrétně 5. den kultivace bylo u kmene Japonochytrium sp. AN4—10 dosaženo koncentrace sušiny 8,3 g.F¹. Analýza ukázala, že Japonochytrium sp. AN4-10 obsahovalo 344,58 g mastných kyselin na I kg suché váhy. Podíl DHA byl 163,19 g.kg ¹ sušiny (resp. 47 % obsahu mastných kyselin) a podíl EPA 1,35 g.kg ¹ sušiny. Profil mastných kyselin uvádí obr. 8.

Průmyslová využitelnost

Vynález je využitelný v biotechnologickém průmyslu. Způsob výroby podle vynálezu je možno 50 realizovat jak s využitím stávajících průmyslových fermentačních kapacit. Vyrobená biomasa mikroorganismů představuje cennou surovinu pro řadu žádaných produktů v oblasti potravinářského a farmaceutického průmyslu, v kosmetice, zejména jako součást funkčních potravin, potravinových doplňků a krmiv s obsahem nenasycených omega-3 mastných kyselin.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Produkční kmen Japonochy triům sp. AN4-10, produkující oleje s vysokým obsahem polynenasycených mastných kyselin, uložený ve Sbírce mikroorganismů ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT (DBM), vedené Vysokou školou chemicko-technologickou, Ústavem biochemie a mikrobiologie, Technická 5, 166 28 Praha 6, pod přírůstkovým číslem DBM 509.

2. Použití produkčního kmene podle nároku 1 pro výrobu kyseliny dokosahexaenové.

3. Způsob produkce kyseliny dokosahexaenové, vyznačující se tím, že produkční kmen podle nároku 1 se kultivuje v kapalném médiu obsahujícím organický uhlík, načež po kultivaci se oddělí biomasa a/nebo lipidy obsahující kyselinu dokosahexaenovou a/nebo volná kyselina dokosahexaenová.

4. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že kapalné médium obsahuje jako zdroj organického uhlíku alespoň jednu látku ze skupiny obsahující glukózu, glycerol, surový glycerol z výroby biopaliv, kyselinu octovou či její estery nebo etanol.