CN103642830B - 用反向载体法构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程蓝藻 - Google Patents

Abstract

本发明构建的工程鱼腥藻，用基因操作调控蓝藻中pepc基因的表达包括目的基因的钓出和载体的构建，蓝藻的转化和转化子筛选，工程蓝藻的培养和检测，总脂及脂肪酸含量测定。结果证明，与野生型相比，pepc基因反向表达的鱼腥藻含脂率提高了93%，总脂从野生型的11.5%提高到22.2%，脂产率增加了一倍，已达到真核藻的平均含脂水平。因此，本发明构建的pepc基因反向表达的鱼腥藻可作为制备生物柴油和必需脂肪酸较理想的原料。

Description

用反向载体法构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程蓝藻

技术领域

本发明涉及生物技术和微藻能源领域，具体为构建一种工程蓝藻为生产生物柴油和必需脂肪酸提供原料。

背景技术

用哪种微藻制备生物柴油，已成国内外开发生物能源的关键之一。从1978年美国能源部启动“水生物种计划（Aquatic Species Program，ASP）”以来35年中，各国学者在开发微藻能源上取得了许多进展。近6年Chisti(2007)和Hu等（2008）对微藻特性的进一步阐明，全球掀起了用微藻制备生物柴油的热潮。微藻这个群体，可分为真核藻和原核藻。真核微藻含脂率较高，一直受到大家的关注；然而蓝藻（又名蓝细菌）是原核微藻，除了含脂率较低，有许多优点值得注意，可以利用。例如丝状体鱼腥藻7120(Anabaena sp PCC 7120)能固氮，可生长在无氮营养液中，不易受其它藻类和植物干扰；不通气或不搅拌，易沉淀便于采收；较耐高温，30～35℃是最适生长温度；基因水平操作较成熟；基因组序列测定已经完成。

长期以来提高藻类含脂率的主要方法是缺N（用于绿藻）、缺Si（用于硅藻）、处于休眠（用于葡球藻）等方法来降低生长率。这些方法实际上不能最终提高脂产率。为了提高其含脂率，我们用鱼腥藻7120作材料，在基因水平上调控磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的表达。PEPC主要在四碳光合固碳途径中起重要作用。有趣的是近20多年来证明它在进行非四碳光合的40多种蓝藻中存在；用油脂植物还证明它在调控油脂和蛋白的合成中起关键作用。

发明内容

本发明的目的是用基因操作构建一种工程蓝藻作为微藻生物柴油和生产必需脂肪酸较理想的原料。

技术方案为，用基因操作调控蓝藻中pepc基因的表达，具体用反向载体法调控pepc基因在丝状体鱼腥藻7120(Anabaena sp PCC 7120)的表达。作为生物柴油和生产必需脂肪酸的原料，我们的工程蓝藻是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶pepc基因反向表达的转基因蓝藻，所述蓝藻为鱼腥藻。通过构建pepc基因反向表达载体，并用三亲结合法转化鱼腥藻，抑制pepc基因表达，在不降低生长速率的前提下，提高含脂率。

这种丝状体工程蓝藻的构建方法步骤如下：

（a）基于鱼腥藻7120的pepc基因序列，设计和合成引物；

所用的引物序列为：

上游5’-GATGGGCAAGCCACAAAAGACC-3’；

下游5’-AGGATCCGCGGGACGAGAAC-3’

以鱼腥藻7120的基因组为模板，钓取pepc基因；用PCR法扩增获得pepc基因；

钓出的pepc编码基因连接到pMD-18-T载体上，测序鉴定；与在GenBank中的pepc基因（编号为NP_488901）比对序列的准确率；

（b）选用在蓝藻和大肠杆菌中都可扩增和表达的质粒载体pRL-489，将pepc基因与pRL-489质粒连接，构建反向穿梭表达载体并转入大肠杆菌；优选的，所述大肠杆菌为DH5α或Tp107；鉴定反向穿梭表达载体的方法为：将所连接的载体用XbaI酶切后电泳，出现4个电泳条带的为反向穿梭表达载体。

（c）将含有辅助质粒和结合质粒的大肠杆菌、步骤（b）获得的带有反向穿梭表达载体的大肠杆菌及纯化后的野生型蓝藻培养到对数生长中期，按照4.5～5.5:4.5～5.5:1的细胞数量比混合，通过三亲接合转移法用带pepc基因的载体转化蓝藻；优选的，含有辅助质粒和结合质粒的大肠杆菌、步骤（b）获得的带有反向穿梭表达载体的大肠杆菌及纯化后的野生型蓝藻细胞数量比为5:5:1；

（d）用含抗生素的无氮BG11培养基或培养液筛选蓝藻转化子，用接种针把平板上的单藻落挑出，接种到液体培养液中生长，逐步提高抗生素浓度，能成活的就是转化子；所述的抗生素为卡那霉素或硫酸新霉素。具体为：

（1）将混合后的细胞均匀涂在滤膜上，在无抗生素的BG11培养基上培养6～8天直至蓝藻生长；

（2）然后在含抗生素浓度为15～30μg/mL的BG11培养基上培养18～24天筛选出对抗生素有抗性的蓝藻单藻落；

（3）挑选生长较好的鱼腥藻7120单藻落，置于抗生素浓度20～50μg/mL的培养液中培养5～8天；

（4）再经过2～4次逐级提高抗生素浓度的筛选培养，每次培养时间为5～8天，直至抗生素浓度提高到280～300μg/mL；

（5）用PCR技术检测工程蓝藻中的pepc基因，并用RT-qPCR法检测蓝藻中pepc基因表达。

上述方法所制备的丝状体工程蓝藻可应用于生产脂肪酸或生物柴油。工艺包括：

（1）培养上述丝状体工程蓝藻；

（2）收集丝状体工程蓝藻并洗涤、冷冻干燥得到干藻粉，并从干藻粉中抽提脂类物质。

步骤（1）所述培养条件为：

培养液：无氮的BG11培养液或培养基，pH=8.3～8.6，优选的，pH=8.5；

温度30±1℃，以白光或者白光与蓝光和红光混合作为光源，搅拌条件下培养5～8天；光照强度为50-80μmol·m^-2·s^-1；

搅拌的方式为振荡培养或通气培养；振荡培养的转速为120～150rpm；通气培养为通入含1%～2%体积比CO₂的空气。

转基因工程蓝藻的培养和检测。在液体BG11中筛选转基因蓝藻时，体积从2mL（试管中）扩展到30mL（在50mL锥形瓶中），再扩大到150mL（在250mL锥形瓶中）。在250mL锥形瓶中培养时可开始作分子检测：用RT-qPCR法检测pepc基因的表达。还可作生理检测，即用氧电极测定不同光强、不同温度、不同pH、不同盐度等环境因子对转基因蓝藻细胞净光合的影响。从而，可推断转基因藻的最适生长条件。这些生理学参数，可作为进一步用光反应器规模培养转基因藻的依据。

本发明构建高油脂及高含量必需脂肪酸的丝状体蓝藻，其主要优点有：（1）高光合作用效率；（2）高油脂产率；（3）容易收获；（4）适应胁迫环境能力强；（5）能生长在无氮的培养液里，避免需结合态氮植物污染；（6）能适应各种碳源（如自养、异养和混合养）；（7）基因组序列已测序；（8）基因操作成熟；（9）无毒；（10）既可生产生物燃料，又可生产高附加值产品。

本发明提供了一种既能提高含脂率，又不降低生长的途径来生成生物柴油或脂肪酸。用反向载体法(Reverse Vector Method,RVM)构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体蓝藻。

本发明所用的丝状体蓝藻是鱼腥藻7120(Anabaena sp PCC 7120)，它能固氮，可生长在无氮营养液中，不易受其它藻类和植物干扰；不通气或不搅拌，易沉淀便于采收；较耐高温，30～35℃是最适生长温度；基因水平操作较成熟，基因组序列测定已完成。选的基因是编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的基因pepc。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）除了在C4途径中能浓缩CO₂外，还证明它还有非光合功能，本发明以鱼腥藻7120(Anabaena spPCC 7120)作材料，构建了含磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）编码基因（pepc）（包含2段保守序列，Fa和Fb）的正向和反向两种表达载体，后用三亲接合法转化鱼腥藻7120并进行分子检测、生化检测和生理检测。

结果证明，与野生型相比，pepc基因反向表达的鱼腥藻含脂率提高了93%，从野生型的11.5%提高到22.2%，已达到真核藻的平均含脂水平；但它的光合和生长，要比绝大多数真核藻高得多。与野生型的相比，反向突变体的生长还略快，脂产率（lipid productivity）高了一倍。GC-MS分析表明，反向鱼腥藻的脂肪酸成分主要包括：壬酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸，包括了5种生物柴油的重要组分，尤其是亚油酸和亚麻酸分别达到106.86mg/L和53.04mg/L，含量比野生型增加55.4%和75.6%。它们也是人体必需的脂肪酸，其中亚麻酸可作为治疗心血管病的药物。因此，pepc基因反向表达的鱼腥藻不仅具备作为生物柴油的原料，还可成为人类补充必需脂肪酸的重要来源。

附图说明

图1为构建反向穿梭表达载体（pRL-reve pepc）和正向穿梭表达载体pRL-forwpepc的示意图

图2为反向穿梭表达载体和正向穿梭表达载体的酶切鉴定电泳图谱，其中泳道1和2分别为正向和反向穿梭表达载体为模板的pepc PCR产物，3为DNA λHindⅢ Marker，4和5分别为正向和反向穿梭表达载体，6和7分别为正向和反向穿梭表达载体的Bam HI酶切产物，8和9为正向和反向穿梭表达载体的XbaI酶切产物。

图3为反向穿梭表达载体和正向穿梭表达载体分别用XBaI酶切鉴定电泳图谱，其中泳道1为DNA λHindⅢ Marker，2、3、4、5为反向穿梭表达载体的XbaI酶切产物，6、7、8为正向穿梭表达载体的XbaI酶切产物。

图4为野生型及反向pepc表达的鱼腥藻显微照片（a和b）和荧光照片（c和d）。

图5为野生型、突变pepc表达（正向、反向和空白表达载体）鱼腥藻的总脂含量。

具体实施方式

为了具体了解本发明实现的创新特征和技术手段，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。

实施例1 钓出目的基因和构建载体

（1）确定pepc基因序列，可在GenBank中查到，其编号为NP_488901；按这序列设计引物，用PCR技术钓pepc基因；引物序列为：

上游5’-GATGGGCAAGCCACAAAAGACC-3’，如SEQ ID No.2；

下游5’-AGGATCCGCGGGACGAGAAC-3’，如SEQ ID No.3；

纯培养鱼腥藻7120，从中提取基因组DNA作为钓pepc基因的模板，用PCR技术，利用上述引物获取目的基因，长度约为2300bp，如SEQ ID No.1序列。

（2）选pRL-489质粒与目的基因相连，构建正向和反向2种穿梭表达载体，正向载体按常规基因工程中基因过表达载体构建的操作进行，即把基因片段顺着表达调控方向连接到载体上；反向载体则是逆着表达调控方向连接目的基因。构建方法如图1所示。

通过以下方法鉴定和区分正向载体和反向载体：

将连接的载体用XbaI酶切并电泳鉴定，出现四个较大片段的是正向载体，出现三个片段的是反向载体。如图2所示和图3所示。

如图2，其中泳道1和2分别为以正向和反向穿梭表达载体为模板的pepc PCR产物（2300bp），3为DNA λHindⅢ Marker，4和5分别为正向和反向穿梭表达载体，6和7分别为正向和反向穿梭表达载体的Bam HI酶切产物，8和9为正向和反向穿梭表达载体的XbaI酶切产物。

图3中，泳道1为DNA λHindⅢ Marker，2、3、4、5为反向穿梭表达载体的XbaI酶切产物，6、7、8为正向穿梭表达载体的XbaI酶切产物。

由图2和图3可见，正向穿梭表达载体经XbaI酶切后出现3个片段，其中两个片段较大，分别为4361bp和5839bp，一个较小，约1100bp左右；反向穿梭表达载体经XbaI酶切后出现4个片段，其中三个片段较大，分别为4361bp、3519bp和2320bp；一个较小，约1100bp左右。

（3）把上述2种载体分别转入大肠杆菌（DH5α品系，Top10品系等）为转化蓝藻作准备。

选用pRL-489质粒来连接pepc基因，这是由于pRL-489既能在大肠杆菌中复制和表达基因，又能在蓝藻中复制和表达基因。为了把由PCR得到的pepc基因与pRL-489连接，在设计引物时要按pRL-489上酶切位点加上连接位点。连接位点的序列为GGATCC。

实施例2 转化蓝藻和筛选转化子。

这个实施例中包括：

（1）纯化和保存所需的蓝藻野生型品系；（2）测定已选择的蓝藻的生长曲线，并把蓝藻培养到对数生长中期，用作三亲接合转移法转化的材料；（3）把带有上述穿梭表达载体的大肠杆菌突变体培养到对数生长中期（培养4～5小时），用作三亲接合转移；（4）把含有助手质粒（Helper质粒）和结合质粒（Conjugative质粒）的大肠杆菌培养到对数生长中期（培养约4～5小时），用于三亲接合转移法转化蓝藻；（5）通过三亲接合转移法用带pepc的载体转化蓝藻；（6）用含抗生素的培养基（液）筛选蓝藻的转化子。

这6步中的大部分操作，文献中已有些介绍，但是都没讲清楚，按其操作，难以成功。这里按我们经验建议3点注意事项：

（1）三亲接合转移法中的“三亲”，即纯化的蓝藻、带穿梭表达载体的大肠杆菌（E1）和带Helper质粒和Conjunctive质粒的大肠杆菌（E2）都要培养到生长周期中的对数生长期中期，进行三亲接合转移蓝藻的转化率较高。为此必须预先测定它们的生长曲线，确切弄清对数生长期中期在哪几天。

（2）这三亲要按比例混合。蓝藻：大肠杆菌E1：大肠杆菌E2=1:5:5。这是经验数值。根据这三亲的生理状态，还可以在1:4.5～5.5:4.5～5.5的范围内变化，如生长差的大肠杆菌数可适量增加，生长好的大肠杆菌可适量减少。

（3）三亲混合后均匀涂在滤膜上，开始几天放在无抗生素的固体BG-11培养基上。待滤膜上的蓝藻长起来后才移到有抗生素的固体BG-11培养基上。文献上介绍在无抗生素培养基上放置24小时即可，实际上不行。我们的经验是1周左右，才能移到有抗生素的培养基上。

实施例3 转基因工程蓝藻的培养和检测

这个实施例中包括（1）在平板上经抗生素筛选3周左右，可挑选藻落大、叶绿素浓的工程藻，取藻落的1/3，在小管中用BG-11培养液悬浮。取样鉴别是否为鱼腥藻；

（2）确定藻种后，把藻落取出在含2mL左右含有25μg/mL培养液的试管中无菌培养；1周后转入含30mL含有25～50μg/mL抗生素的BG-11培养液（50mL锥形瓶）中培养。一周后扩大到含150mL培养液的250mL锥形瓶中培养，并可逐步提高抗生素（卡那霉素或硫新霉素）的浓度，从25μg/mL经过50、75、100、150、200、250提高到300μg/mL；

（3）抗生素浓度提高到100μg/mL后，可进行分子检测，即用PCR技术检查工程蓝藻中目的基因的存在和表达；

（4）然后作生理检测，即用氧电极测定工程藻光合放氧速率随光强、温度、pH、盐度等环境因子的变化。由此可推测工程藻的最适生长条件；

（5）把工程藻培养在最适生长条件下，检测其生长曲线和生物量的变化。

这5步中大部分操作在文献中已有些介绍，但细节很少讲清楚。下面按我们的经验，提出两点建议：

（1）逐步提高抗生素浓度筛选转基因藻到高浓度（100μg/mL以上）时，藻细胞分裂较慢。为此在提高抗生素浓度前，先将工程藻转入低浓度（25～50μg/mL）下生长1周左右，然后再放入含高浓度抗生素的培养液中，这样才能有效地除去野生型细胞。如果不这样，即使提高抗生素浓度，筛选也会失效。

（2）蓝藻的生理状态，对光强变化响应很快，不需适应；但对其他环境因子响应需要一段时间。在氧电极测定温度、pH、盐度等因素对工程藻光合影响时，每改变一个温度、pH或盐度时，都需让工程藻对新环境适应时间至少1小时。不然测得的数据不稳定，重复性差。

实施例4 工程蓝藻的制备与分析将实施例3筛选得到的转基因丝状体工程蓝藻的藻种逐步活化放大，在100L光反应器中进行培养。以白光为光源，或者白光与蓝光、红光混合作为光源（24小时连续光照），用BG-11（无N）培养液，pH为8.5、搅拌条件下、30±1℃下培养7天后收获，沉淀、离心，收集转基因蓝藻并洗涤、冷冻干燥和粉碎得到干藻粉。光照强度条件为80～150μmol·m^-2·s^-1。

搅拌的方式为振荡或通气，振荡的速度为135rpm；通气方式为：通入含1%～2%体积比CO₂的空气。

BG-11（无N）培养液的组成为：NaCl（-N）1.03g/L；K₂HPO₄·3H₂O 0.04g/L，Na₂CO₃0.02g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁铵0.006g/L，Na₂-EDTA 0.001g/L，CaCl₂·2H₂O0.036g/L，MgSO₄·7H₂O 0.075g/L，H₃BO₄ 2.86mg/L，MnCl₂·4H₂O 1.81mg/L，ZnSO₄·7H₂O0.222mg/L，NaMoO₄·2H₂O 0.39mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.079mg/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494mg/L，用Tris调节pH8.5。

BG-11培养液已普遍应用于微藻培养，但配制时易产生沉淀。我们改进了配法，而未改变任何化合物，可明显减少沉淀。主要做法是2方面：（1）按下表中化合物的组合制备母液；（2）按下表顺序取母液配成工作液。

表1.BG-11（－N）培养液的配制

规模培养工程藻是否顺利取决于（1）藻种的保存和活化；（2）光反应器的顺利运行和及时采收；（3）培养液的配制和调节。

藻种的保存和活化需有专门人员和专门的实验室。藻种分3级保存：A.-80℃保存（1～3年）；B.固相（平板）保存15-20℃（3～6个月）；C.液相25-30℃保存（1周～1月）。藻种活化也分3级：（1）从-80℃保存物或固相单藻落扩大到250mL锥形瓶；（2）从250mL锥形瓶到5升光反应器（种子罐）；（3）从5升光反应器到100升光反应器。

光反应器的基本要求：（1）光源内置，强度可调控而产热低。可选用LED作光源，以白色光为主，需部分红光或蓝光。（2）通气与搅拌结合。通入空气含1～2%（v/v）CO₂，气泡小、分布匀，空气需过滤除菌。（3）可监测温度和pH等参数。恒温装置既能升温又降温，用酸-碱调节pH。（4）进水和排水简易，减轻劳动强度，保证产品质量，提高运行效率。（5）结构安全抗爆防倒，减少事故；容易清洗消毒，减少污染。（6）有处理微藻“贴壁”（粘在光源或容器壁上）的装置。

检测工程蓝藻总脂，用2种方法：

（1）尼罗红染色法：收集对数期的藻细胞，用尼罗红染色：37℃孵育10min。在Zeiss荧光显微镜（Axio vert Al40）下观察。染色后藻的橙色越深，含脂越高；如图4所示。图4为野生型及反向pepc表达的鱼腥藻显微照片和荧光照片，a和b为野生型和反向pepc表达的鱼腥藻样品在明场下的观察；c和d为野生型和反向pepc表达的鱼腥藻样品在红色荧光下观察的图像。

（2）用氯仿-甲醇法抽提干藻粉，离心取上清用氮气吹干，前后2次称重差即为总脂量，结果如图5。

以上2种方法测定显示，同野生藻相比，反向pepc基因表达的鱼腥藻含油量都升高。

检测工程蓝藻的脂肪酸，用GC-MS分析表明反向pepc基因表达鱼腥藻的脂肪酸：壬酸（9:0）、肉豆蔻酸（14:0）棕榈酸（16:0）、棕榈油酸（16:1）、硬脂酸（18:0）、油酸（18:1）、亚油酸（18:2）、亚麻酸（18:3），这些都是生物柴油的重要组分。此外，同野生型相比，这些脂肪酸的含量都有增加，尤其是亚油酸和亚麻酸分别增加了55.4%和75.6%（表2），它们是人体必需的脂肪酸。其中，亚麻酸是治疗心脑血管病的药物。

表2 野生型及突变体鱼腥藻的脂肪酸甲酯组分及含量。

Claims (6)

1.构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程鱼腥藻7120转化子的方法，其特征在于，用反向载体法调控pepc基因在丝状体鱼腥藻7120的表达，步骤包括：(a)以鱼腥藻7120的基因组为模板钓取pepc基因；用PCR法扩增获得pepc基因，所述的pepc基因序列如SEQ IDNo.1所示；

所用的引物序列为：

上游5’-GATGGGCAAGCCACAAAAGACC-3’；

下游5’-AGGATCCGCGGGACGAGAAC-3’；

(b)pepc基因与pRL-489质粒连接，构建反向穿梭表达载体并转入大肠杆菌；

(c)将含有辅助质粒和接合质粒的大肠杆菌、步骤(b)获得的带有反向穿梭表达载体的大肠杆菌及纯化后的野生型鱼腥藻7120培养到对数生长中期，按照4.5～5.5:4.5～5.5:1的细胞数量比混合，通过三亲接合转移法用带pepc基因的载体转化鱼腥藻7120；

(d)用含抗生素的无氮BG11培养基或培养液筛选鱼腥藻7120转化子；

所述抗生素为卡那霉素或硫酸新霉素，所述的筛选鱼腥藻7120转化子的方法为：

(1)将混合后的细胞均匀涂在滤膜上，在无抗生素的BG11培养基上培养6～8天直至能看到藻株生长；

(2)然后在含抗生素浓度为15～30μg/mL的BG11培养基上培养18～24天筛选出对抗生素有抗性的鱼腥藻7120转化子单藻落；

(3)挑选生长较好的鱼腥藻7120转化子单藻落，置于抗生素浓度20～50μg/mL的培养液中培养5-8天；

(4)再经过2～4次逐级提高抗生素浓度的筛选培养，每次培养时间为5～8天，直至抗生素浓度提高到280～300μg/mL；

(5)用PCR技术检测工程鱼腥藻7120转化子中的pepc基因，并用RT-qPCR法检测鱼腥藻7120转化子中pepc基因表达。

2.权利要求1所述构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程鱼腥藻7120转化子的方法，其特征在于，步骤(c)中，含有辅助质粒和接合质粒的大肠杆菌、步骤(b)获得的带有反向穿梭表达载体的大肠杆菌及纯化后的野生型鱼腥藻7120细胞数量比为5:5:1。

3.权利要求1所述构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程鱼腥藻7120转化子的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述大肠杆菌为DH5α或Top10。

4.权利要求1所述构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程鱼腥藻7120转化子的方法，其特征在于，步骤(b)中，鉴定反向穿梭表达载体的方法为：将所连接的载体用XbaI酶切后电泳，出现4个电泳条带的为反向穿梭表达载体。

5.权利要求1～4中任一权利要求所述的方法构建的丝状体工程鱼腥藻7120转化子在生产脂肪酸或生物柴油方面的应用，所述的脂肪酸包括壬酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、十六碳二烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸或亚麻酸。

6.生产脂肪酸或生物柴油的方法，其特征在于，步骤包括：

(1)培养权利要求1～4中任一权利要求所述的方法构建的丝状体工程鱼腥藻7120转化子；

所述培养条件为：

无氮的BG11培养液或培养基，pH＝8.3～8.6；

温度30±1℃，以白光或者白光与蓝光和红光混合作为光源，搅拌条件下培养5～8天；光照强度为50-80μmol·m^-2·s^-1；

搅拌的方式为振荡培养或通气培养；振荡培养的转速为120～150rpm；通气培养为通入含1％～2％体积比CO₂的空气；

(2)收集丝状体工程鱼腥藻7120转化子并洗涤、冷冻干燥得到干藻粉，并从干藻粉中抽提脂类物质；

所述的脂肪酸包括壬酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸或亚麻酸。