WO2009086812A2 - Clostridium sporosphaeroides zur erzeugung von biogas - Google Patents

Clostridium sporosphaeroides zur erzeugung von biogas Download PDF

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    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Definitions

  • the invention relates to a method for producing biogas from biomass using a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides.
  • Biogas plants produce methane through a microbial decomposition process of organic substances.
  • the biogas is produced in a multi-stage process of fermentation or digestion by the activity of anaerobic microorganisms, i. in the absence of air.
  • the present invention provides a method for producing biogas from biomass in a fermentation reactor.
  • the biomass is added to a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides.
  • the addition of a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides causes an increase in the volume load of a fermenter by more than 50%, without any instability of the fermentation process would occur. Parallel to the increased volume of space, the amount of biogas produced is more than doubled.
  • the specific yield of biogas increases, since significantly more of the organic dry matter is degraded than in the absence of addition of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides. Due to the increased degree of degradation, a significantly increased specific gas yield can be achieved with improved substrate utilization.
  • the residence time of the fermentation substrate in the fermenter can be significantly shortened with constant gas yield, which makes it possible to increase the volume load.
  • the use of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides therefore leads to a dramatic improvement in the efficiency and efficiency of biogas plants.
  • Fermentation for the purposes of the present invention includes both anaerobic and aerobic material conversions by the action of microorganisms that lead to the production of biogas. This explanation of the term “fermentation” is under the keyword “fermentation in Römpp Chemistry Lexicon in the 9th, extended edition, published by Georg Thieme Verlag on page 1306, indicated, to which reference is hereby incorporated by reference.
  • Clostridium sporosphaeroides can be carried out in the form of a culture suspension, in the form of dry, freeze-dried or moist cell pellets or also in the form of spore suspensions, spore preparations or dry, freeze-dried or moist spore pellets. Since the already mentioned various positive effects on the fermentation process are associated with the microorganism species Clostridium sporosphaeroides, this type of microorganisms should be present in the added culture in a quantity exceeding the natural abundance. Of course, mixed cultures of any composition can be used for the addition. The only requirement is that the species Clostridium sporosphaeroides is present in an amount which is enriched in relation to the natural occurrence.
  • the proportion of microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides in the culture can be stated as a percentage.
  • Microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides are in a mixed culture then the predominant species of microorganisms, when they have the highest percentage of the various species of microorganisms present in the mixed culture.
  • a pure culture of a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is added.
  • the pure culture of a microorganism comprises the progeny of a single cell, which is isolated by a multi-step process from a mixture of different microorganisms. This multi-step mechanism begins with the separation of a single cell from a cell population and requires that the colony resulting from the cell through growth and cell division also remain separate from other single cells or colonies. By careful separation of a colony, resuspension in liquid and repeated spreading, pure cultures of microorganisms can be selectively obtained.
  • the isolation of a pure culture can also be carried out in liquid nutrient media, provided that the desired organism outnumbered in the starting material.
  • By serial dilution of the suspension in the nutrient solution it can finally be achieved that only one cell remains in the last dilution stage.
  • This cell then represents the basis for a pure culture.
  • a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is added as a component of at least one immobilized culture of microorganisms.
  • this type of microorganism should be present in the added immobilized culture in an amount enriched in comparison to the natural occurrence.
  • immobilized mixed cultures of any composition can be used for the addition. The only requirement is that microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides are present in an amount that exceeds their natural occurrence.
  • the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides at least 10 "4% of the total number of the added to the fermentation substrate immobilized culture microorganisms present.
  • the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides at least 10" 2% of the total number of In microorganisms present in the immobilized culture, and particularly preferably, the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides constitutes at least 1% of the total number of microorganisms present in the immobilized culture.
  • the polymer material can also be crosslinked using conventional crosslinkers such as glutaraldehyde, urea / formaldehyde resins or tannin compounds.
  • Alginates as Immobilisate prove to be particularly advantageous because they do not have a negative impact on the activity of the microorganism Clostridium sporosphaeroides and because they are slowly degraded by other microorganisms. Due to the slow degradation of the alginate immobilizates, the trapped microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides are gradually released.
  • the said period may also extend to several hours to one or more days.
  • the space load in the fermentation reactor can be continuously increased or kept approximately constant by continuous addition of new substrate, the fermentation at all room loads, preferably at a space load of ⁇ 0.5 kg of organic dry matter per m 3 and day [kg oTS / m 3 d ], more preferably at a volume load of ⁇ 4.0 kg oTS / m 3 d and particularly preferably at a volume load of ⁇ 8.0 kg oTS / m 3 d can be performed, which in comparison to the current state of the art of increasing the space load by more than twice as much.
  • the fermentation substrate used can in particular also have a high proportion of solid constituents.
  • a hydrolytically active, fermentative microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides these solid constituents are at least partially liquefied.
  • Clostridium sporosphaeroides thickening of the fermenter material can be prevented and targeted counteracted.
  • Another liquid entry into the fermentation substrate in the form of water or manure during fermentation can be avoided.
  • Another advantage is the thus obtained obtaining the stirring and pumpability of the substrate. As a result, agitators and pumps are spared and significantly less energy is required for the stirring process.
  • the constant mixing of the fermentation substrate also leads to a uniform heat distribution in the fermentation reactor.
  • Measurements of the temperature in the fermentation reactor which were also carried out continuously at periodic intervals, however, revealed that the fermentation substrate is fermented efficiently in a temperature range from 20 0 C to 80 0 C, preferably at about 40 ° C to 50 0 C. These temperature ranges are therefore preferred in the context of the present invention.
  • the last stage of the fermentation process namely the formation of methane by methanogenic microorganisms, particularly efficient at elevated temperatures.
  • Preference is therefore given to the production of biogas from biomass at a temperature of 20 0 C to 80 0 C and particularly preferably at a temperature of 40 ° C to 50 0 C.
  • fermentation substrate and a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides are added continuously.
  • the continuous operation of a fermentation reactor should result in a stable microbial biocenosis to a continuous production of biogas, the exposure of the substrate addition to the fermentation should be reduced as a result of a process disturbance.
  • the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is added to the fermentation substrate in an amount such that, after addition, the proportion of the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is between 10 -8 % and 50% of the total number of micro-organisms present in the fermentation substrate.
  • the proportion of the microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides is between 10 -8 % and 50% of the total number of micro-organisms present in the fermentation substrate.

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse in einem Fermentierungsreaktor, wobei der Biomasse ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt wird.

Description

Clostridium sporosphaeroides zur Erzeugung von Biogas
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse unter Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides.
Stand der Technik
Biogasanlagen erzeugen Methan durch einen mikrobiellen Abbauprozess von organischen Substanzen. Das Biogas entsteht dabei in einem mehrstufigen Prozess der Vergärung oder Faulung durch die Aktivität von anaeroben Mikroorganismen, d.h. unter Ausschluss von Luft.
Das als Gärsubstrat verwendete organische Material besitzt aus chemischer Sicht einen hochmolekularen Aufbau, der in den einzelnen Verfahrensschritten einer Biogasanlage durch Stoffwechseltätigkeit der Mikroorganismen zu niedermolekularen Bausteinen abgebaut wird. Die bei der Fermentierung des organischen Gärsubstrats aktiven Populationen von Mikroorganismen sind bislang aber nur unzureichend charakterisiert.
Nach heutigem Kenntnisstand können vier nacheinander, aber auch parallel ablaufende und ineinander greifende biochemische Einzelprozesse unterschieden werden, die den Abbau von organischen Gärsubstraten zu den Endprodukten Methan und Kohlendioxid ermöglichen: Hydrolyse, Acidogenese, Acetogenese und Methanogenese.
In der Hydrolyse werden hochmolekulare, oft partikulär vorliegende, organische Verbindungen durch Exoenzyme (z.B. Cellulasen, Amylasen, Proteasen, Lipasen) fermentativer Bakterien in lösliche Spaltprodukte überführt. Dabei werden beispielsweise Fette in Fettsäuren, Kohlenhydrate, wie z.B. Polysaccharide, in Oligo- und Monosaccharide sowie Proteine in Oligopeptide beziehungsweise Aminosäuren zerlegt. Die daneben gebildeten gasförmigen Produkte bestehen überwiegend aus Kohlendioxid.
Fakultativ und obligat anaerob lebende Bakterien, oftmals identisch mit den hydrolysierenden Bakterien, verstoffwechseln in der Acidogenese die Hydrolyseprodukte (z.B. Mono-, Disaccharide, Di-, Oligopeptide, Aminosäuren, Glycerin, langkettige Fettsäuren) intrazellulär zu kurzkettigen Fett- oder Carbonsäuren, wie beispielsweise Butter-, Propion- und Essigsäure, zu kurzkettigen Alkoholen wie zum Beispiel Ethanol und zu den gasförmigen Produkten Wasserstoff und Kohlendioxid.
In der sich anschließenden Acetogenese werden die in der Acidogenese gebildeten kurzkettigen Fett- und Carbonsäuren sowie die kurzkettigen Alkohole von acetogenen Bakterien aufgenommen und nach ß-Oxidation als Essigsäure wieder ausgeschieden. Nebenprodukte der Acetogenese sind CO2 und molekularer Wasserstoff (H2).
Die Produkte der Acetogenese wie Essigsäure aber auch andere Substrate wie Methanol und Formiat werden durch Methan-bildende Organismen in der obligat anaerob verlaufenden Methanogenese zu Methan und CO2 umgesetzt. Das hier entstehende CO2 und auch das während der übrigen Prozessschritte, wie z.B. der Hydrolyse, gebildete CO2 kann wiederum durch Mikroorganismen mit dem angefallenen H2 ebenfalls zu Methan umgesetzt werden.
Die Erhöhung der Ausbeute an Endprodukten aus einer gegebenen Menge an Edukten stellt wie bei jeder chemischen Umsetzung auch im Fall der Herstellung von Biogas ein vordringliches Ziel der Prozessführung dar. Für die Erzeugung von Biogas aus Biomasse bedeutet dies, dass aus einer gegebenen Menge an organischem Gärsubstrat eine möglichst große Menge an Methan gebildet werden soll. Daneben soll eine möglichst hohe Raumbelastung der Fermenter erreicht werden. Unter der Raumbelastung eines Fermenters versteht man die Menge an dem Fermenter zugeführten Substrat, die in Kilogramm organischer Trockensubstanz pro Kubikmeter Fermentervolumen und pro Tag angegeben wird. Die Menge an erzeugtem Biogas hängt stark von der Raumbelastung des Fermenters ab, wobei mit steigender Raumbelastung eine zunehmend größere Menge an Biogas erzeugt wird. Eine hohe Raumbelastung macht den Prozess der Biogaserzeugung also zunehmend ökonomisch rentabler, führt andererseits aber zu einer zunehmenden Destabilisierung der biologischen Prozesse der Fermentierung.
Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an Verfahren zur Erzeugung von Biogas, die eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte Raumbelastung ermöglichen.
Darstellung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Erzeugung von Biogas bereitzustellen, das eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte Raumbelastung des Fermentierungsreaktors ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren zur Erzeugung von Biogas gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung und den Beispielen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse in einem Fermentierungsreaktor zur Verfügung. Der Biomasse wird ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass durch die Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides zum Gärsubstrat sowohl die Raumbelastung des Fermenters gesteigert werden kann als auch die Menge an gebildetem Biogas deutlich erhöht wird. Wie in experimentellen Untersuchungen - A -
gezeigt werden konnte, bewirkt die Zugabe eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides eine Steigerung der Raumbelastung eines Fermenters um mehr als 50%, ohne dass eine Instabilität des Fermentationsprozesses eintreten würde. Parallel zu der erhöhten Raumbelastung wird die Menge an gebildetem Biogas mehr als verdoppelt. Zudem steigt die spezifische Ausbeute an Biogas an, da deutlich mehr der organischen Trockensubstanz abgebaut wird als bei fehlender Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides. Durch den erhöhten Abbaugrad kann eine deutlich erhöhte spezifische Gasausbeute bei einer verbesserten Substratausnutzung erzielt werden. Durch die Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides kann die Verweilzeit des Gärsubstrats im Fermenter bei konstanter Gasausbeute deutlich verkürzt werden, wodurch die Erhöhung der Raumbelastung möglich wird. Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides führt daher zu einer dramatischen Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Biogasanlagen.
Fermentierung im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst sowohl anaerobe, wie auch aerobe Stoffumwandlungen durch die Einwirkung von Mikroorganismen, die zur Erzeugung von Biogas führen. Diese Erläuterung des Begriffs „Fermentierung" ist unter dem Stichwort „Fermentation im Römpp-Chemielexikon in der 9., erweiterten Auflage, erschienen im Georg Thieme Verlag auf der Seite 1306, angegeben, auf das hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Die spezifische Ausbeute an erzeugtem Biogas berechnet sich aus der Menge an erzeugtem Biogas dividiert durch die Menge an organischer Trockensubstanz. Die Frage, ob die Erzeugung von Biogas in einem bestimmten Fermenter unter bestimmten Bedingungen in einer befriedigenden Güte abläuft, lässt sich nicht alleine anhand der Menge an erzeugtem Biogas beurteilen. Selbstverständlich hängt die Menge an erzeugtem Biogas stark von der Menge an zugeführtem Substrat ab, also von der Menge an organischer Trockensubstanz, die in Kilogramm organischer Trockensubstanz angegeben wird. Treten Instabilitäten des Fermentierungsprozesses auf, so nimmt die spezifische Gasausbeute ab. Bei erfindungsgemäßem Zusatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides kann die Raumbelastung sogar über das übliche Maß hinaus erhöht werden, wodurch eine deutlich gesteigerte Gasmenge erzeugt wird. Durch den erhöhten Abbaugrad kann eine deutlich erhöhte spezifische Gasausbeute bei einer verbesserten Substratausnutzung erzielt werden.
Unter der Bezeichnung „Art von Mikroorganismen" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die entsprechende grundlegende Kategorie der biologischen Taxonomie verstanden. Arten von Mikroorganismen werden anhand ihrer DNA- Sequenzen identifiziert und unterschieden. Unter eine bestimmte Art fallen dabei nicht nur Mikroorganismen mit einer ganz bestimmten DNA-Sequenz, sondern auch bis zu einem gewissen Umfang deren genetische Varianten. Dem einschlägigen Fachmann ist bekannt, welche Stämme von Mikroorganismen unter den Begriff „Art Clostridium sporosphaeroides" fallen. Im Zusammenhang mit der Herstellung von Biogas durch Fermentation organischer Substrate sind Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides nicht bekannt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in Form einer Kultur von Mikroorganismen zugesetzt, die überwiegend aus einem Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides besteht. In Gärsubstraten von Biogasanlagen konnten Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides nur in geringsten Spuren von weniger als 10"4% Anteil an der gesamten Anzahl von anwesenden Mikroorgansimen nachgewiesen werden. Da für die Zugabe der Mikroorganismen die Menge an aus ihrem natürlichen Vorkommen isolierten Mikroorganismen nicht ausreicht, wird üblicherweise eine Vermehrung in Form einer Kultur vorgenommen. In der Praxis zeigt sich, dass die Zugabe der Mikroorganismen zu dem Gärsubstrat eines Fermenters am einfachsten direkt in Form einer Kultur von Mikroorganismen vorgenommen wird.
Die Zugabe der Kultur von Clostridium sporosphaeroides kann in Form einer Kultursuspension, in Form trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Zellpellets oder auch in Form von Sporensuspensionen, Sporenpräparaten oder trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Sporenpellets vorgenommen werden. Da die bereits angesprochenen verschiedenen positiven Effekte auf den Gärprozess mit der Mikroorganismenart Clostridium sporosphaeroides verbunden sind, sollte diese Art von Mikroorganismen in der zugegebenen Kultur in einer das natürliche Vorkommen übersteigenden Menge anwesend sein. Selbstverständlich können Mischkulturen in beliebiger Zusammensetzung für die Zugabe verwendet werden. Voraussetzung ist lediglich, dass die Art Clostridium sporosphaeroides in einer gegenüber dem natürlichen Vorkommen angereicherten Menge anwesend ist.
Die Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen in Mischkulturen stellt für den Fachmann kein Problem dar. So kann beispielsweise mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten Oligosonden spezifisch der Anteil von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Mischung identifiziert werden. Wie bereits erwähnt, werden Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides bevorzugt in Form von Kulturen von Mikroorganismen dem Gärsubstrat zugesetzt, wobei die Kulturen von Mikroorganismen überwiegend aus Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides bestehen. Wird neben der Bestimmung der Anzahl an Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides auch die Gesamtzahl an Mikroorganismen bestimmt, so kann der Anteil an Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides in der Kultur in Prozent angegeben werden. Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides sind in einer Mischkultur dann die überwiegend anwesende Art von Mikroorganismen, wenn sie den höchsten prozentualen Anteil der verschiedenen in der Mischkultur anwesenden Arten von Mikroorganismen aufweisen.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest '\ 0~4% der Gesamtzahl an in der zu dem Gärsubstrat zugegebenen Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"2% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus und insbesondere bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 1 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus, besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 50% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus und insbesondere bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 90% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen wird eine Reinkultur eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt. Die Reinkultur eines Mikroorganismus umfasst die Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle, die durch einen mehrschrittigen Prozess aus einem Gemisch verschiedener Mikroorganismen isoliert wird. Dieser mehrschrittige Mechanismus beginnt mit der Abtrennung einer einzelnen Zelle aus einer Zellpopulation und erfordert, dass auch die aus der Zelle durch Wachstum und Zellteilung hervorgehende Kolonie von anderen Einzelzellen oder Kolonien getrennt bleibt. Durch eine sorgfältige Abtrennung einer Kolonie, erneutes Suspendieren in Flüssigkeit und wiederholtes Ausstreichen können gezielt Reinkulturen von Mikroorganismen gewonnen werden.
Die Isolierung einer Reinkultur kann jedoch auch in flüssigen Nährmedien erfolgen, sofern der gewünschte Organismus im Ausgangsmaterial zahlenmäßig überwiegt. Durch serienmäßige Verdünnung der Suspension in der Nährlösung lässt es sich schließlich erreichen, dass sich in der letzten Verdünnungsstufe nur noch eine Zelle befindet. Diese Zelle stellt dann die Basis für eine Reinkultur dar. Diese Erläuterung des Begriffs „Reinkultur" und mögliche Verfahren zur Erzeugung dieser Reinkultur sind unter dem Stichwort „Reinkultur" im Werk „Allgemeine Mikrobiologie" von Hans G. Schlegel in der 7. überarbeiteten Auflage von 1992, erschienen im Georg Thieme Verlag auf der Seite 205 aufgeführt, auf das hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Die so erhaltene Reinkultur ist darüber hinaus auch biochemisch durch spezifische Stoffwechsel prozesse und -aktivitäten, sowie durch spezielle Wachstumsbedingungen gekennzeichnet. Aufgrund der spezifischen Stoffwechsel prozesse und -aktivitäten kann die Zugabe einer Reinkultur eines fermentativen Mikroorganismus in besonderem Maße zu einer verbesserten Kontrolle des komplexen Biogaserzeugungsprozesses beitragen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides als Bestandteil zumindest einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen zugesetzt. Da für die
Zugabe der Mikroorganismen die Menge an aus ihrem natürlichen Vorkommen isolierten Mikroorganismen nicht ausreicht, wird üblicherweise eine Vermehrung in
Form einer Kultur vorgenommen. In der Praxis zeigt sich, dass die Zugabe der Mikroorganismen zu dem Gärsubstrat eines Fermenters am einfachsten in Form einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen vorgenommen wird.
Da die bereits angesprochenen verschiedenen positiven Effekte auf den Gärprozess mit der Mikroorganismenart Clostridium sporosphaeroides verbunden sind, sollte diese Art von Mikroorganismen in der zugegebenen immobilisierten Kultur in einer im Vergleich zum natürlichen Vorkommen angereicherten Menge anwesend sein. Selbstverständlich können immobilisierte Mischkulturen in beliebiger Zusammensetzung für die Zugabe verwendet werden. Voraussetzung ist lediglich, dass Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge enthalten sind, die deren natürliches Vorkommen übersteigt.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"4% der Gesamtzahl an in der zu dem Gärsubstrat zugegebenen immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"2% der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus und insbesondere bevorzugt macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 1 % der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10% der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus, besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 50% der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus und insbesondere bevorzugt macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 90% der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen wird zumindest eine immobilisierte Reinkultur eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt.
Als Trägermaterialien, auf denen der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides immobilisiert wird, können natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt werden. Bevorzugt werden gelbildende Polymere verwendet. Diese haben den Vorteil, dass Bakterien innerhalb der Gelstruktur aufgenommen bzw. eingelagert werden können. Bevorzugt werden solche Materialien eingesetzt, die sich in Wasser langsam auflösen bzw. abgebaut werden, so dass die Freisetzung des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides über einen längeren Zeitraum hinweg erfolgt.
Beispiele für geeignete Polymere sind Polyanillin, Polypyrrol, Polyvinylpyrolidon, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyvinylalkohol, Polyethylen, Polypropylen, Epoxidharze, Polyethylenimine, Polysaccharide wie Agarose, Alginat oder Cellulose, Ethylcellulose, Methylcellulose, Carboxymethylethylcellulose, Celluloseacetate, Alkali-Cellulosesulfat, Copolymere aus Polystyrol und Maleinsäureanhydrid, Copolymere aus Styrol und Methylmethacrylat, Polystyrolsulfonat, Polyacrylate und Polymethacrylate, Polycarbonate, Polyester, Silikone, Cellulosephthalat, Proteine wie Gelatine, Gummi arabicum, Albumin oder Fibrinogen, Gemische aus Gelatine und Wasserglas, Gelatine und Polyphosphat, Gelatine und Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Methylvinylether, Celluloseacetatbutyrat, Chitosan, Polydialkyldimethylammonium-chlorid, Mischungen aus Polyacrylsäuren und Polydiallyldimethylammoniumchlorid sowie deren Gemische. Das Polymermaterial kann auch mit Hilfe üblicher Vernetzer wie Glutaraldehyd, Harnstoff/Formaldehydharzen oder Taninverbindungen vernetzt werden. Alginate als Immobilisate erweisen sich als besonders vorteilhaft, da sie zum einen keinen negativen Einfluss auf die Aktivität des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides nehmen und da sie zum anderen durch Mikroorganismen langsam abgebaut werden. Durch den langsamen Abbau der Alginat-Immobilisate werden nach und nach die eingeschlossenen Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides freigesetzt.
Für die Immoblisation werden die Mikroorganismen mit einem Polymergel vermengt und dann in einer geeigneten Härterlösung gehärtet. Dazu werden sie zunächst mit einer Gellösung vermischt und anschließend in eine Härterlösung aus geeigneter Höhe getropft. Die genauen Vorgehensweisen zur Immobilisation sind dem Fachmann bekannt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird zeitnah zur Zugabe eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zusätzliche Biomasse in den
Fermentierungsreaktor gegeben. Dabei bezieht sich „zeitnah" auf die Zeitspanne, die zwischen einer sich an die Zugabe der Mikroorganismen anschließende Zugabe von neuem Substrat vergeht. Diese Zeitspanne soll möglichst kurz gehalten werden, weshalb der Begriff „zeitnah" auch eine parallele Zugabe des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides und des neuen Substrats umfasst.
Die genannte Zeitspanne kann sich jedoch auch auf mehrere Stunden bis hin zu einem oder mehreren Tagen ausdehnen. Dabei kann die Raumbelastung im Fermentationsreaktor durch kontinuierliche Zugabe von neuem Substrat kontinuierlich gesteigert oder in etwa konstant gehalten werden, wobei die Fermentierung bei allen Raumbelastungen, bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥ 0.5 kg organischer Trockensubstanz pro m3 und Tag [kg oTS/m3d], weiter bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥4.0 kg oTS/m3d und besonders bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥8.0 kg oTS/m3d durchgeführt werden kann, was im Vergleich zum gegenwärtigen Stand der Technik einer Erhöhung der Raumbelastung um mehr als das Doppelte entspricht.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird daher die Raumbelastung im Fermentierungsreaktor durch kontinuierliche Zugabe von Biomasse kontinuierlich gesteigert. Besonders bevorzugt erfolgt die Erzeugung von Biogas aus Biomasse bei einer Raumbelastung von ≥ 0,5 kg oTS/m3d, insbesondere bevorzugt ≥ 4,0 kg oTS/m3d und ganz besonders bevorzugt ≥ 8,0 kg oTS/m3d.
Das verwendete Gärsubstrat kann insbesondere auch einen hohen Anteil an festen Bestandteilen aufweisen. Durch die Zugabe eines hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides werden diese festen Bestandteile zumindest teilweise verflüssigt. Durch die erzielte Verflüssigung des Gärsubstrats aufgrund der Zugabe des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides kann einem Eindicken des Fermentermaterials vorgebeugt und gezielt entgegengewirkt werden. Ein weiterer Flüssigkeitseintrag in das Gärsubstrat in Form von Wasser oder Gülle während der Fermentierung kann vermieden werden. Somit besteht ein weiterer Vorteil in der Schonung der Ressource Süßwasser. Ebenfalls von Vorteil ist der so erzielte Erhalt der Rühr- und Pumpfähigkeit des Substrats. Dadurch werden Rührwerke und Pumpen geschont und für den Rührvorgang ist deutlich weniger Energie erforderlich.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Erzeugung von Biogas aus Biomasse unter konstanter Durchmischung des Gärsubstrats. Durch die konstante Durchmischung des Gärsubstrats können die Kulturen von Clostridium sporosphaeroides besser im Gärsubstrat verteilt werden. Außerdem kann das gebildete Biogas besser aus dem Fermentationsprozess abgeführt werden.
Die konstante Durchmischung des Gärsubstrats führt zudem zu einer gleichmäßigen Wärmeverteilung im Fermentationsreaktor. Messungen der Temperatur im Fermentationsreaktor, die in periodischen Abständen, aber auch kontinuierlich durchgeführt wurden, ergaben, dass das Gärsubstrat in einem Temperaturbereich von 200C bis 800C, bevorzugt bei etwa 40°C bis 500C effizient fermentiert wird. Diese Temperaturbereiche werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung daher bevorzugt. Neben der Hydrolyse erfolgt insbesondere die letzte Stufe des Fermentationsprozesses, nämlich die Bildung von Methan durch methanogene Mikroorganismen, besonders effizient bei erhöhten Temperaturen. Bevorzugt erfolgt daher die Erzeugung von Biogas aus Biomasse bei einer Temperatur von 200C bis 800C und besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 40°C bis 500C.
Sämtliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind selbstverständlich nicht auf einstufige Verfahren zur Herstellung von Biogas beschränkt. Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides kann auch in zwei- oder mehrstufigen Verfahren erfolgen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Gärsubstrat und ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides kontinuierlich zugegeben. Der kontinuierliche Betrieb eines Fermentationsreaktors soll bei einer stabilen mikrobiellen Biozönose zu einer kontinuierlichen Produktion von Biogas führen, wobei das Aussetzen der Substratzugabe zur Fermentation infolge einer Prozessstörung vermindert werden soll.
Ebenfalls ist die Ausführung dieses Fermentationsverfahrens und der damit zusammenhängenden Prozesse auch in einem diskontinuierlichen Betrieb, beispielsweise „Batch"-Fermentierung denkbar. So kann dem Gärsubstrat gemäß einer weiteren Ausführungsform während der Fermentierung der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides beispielsweise in regelmäßigen Abständen zugegeben werden. Die Zugabe des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in regelmäßigen Abständen führt zu einer Steigerung der Lebendzellzahl und somit zu einem verbesserten Ablauf der fermentativen Prozesse, beispielsweise der Hydrolyse bei einer gleichzeitig verbesserten Ausnutzung des Gärsubstrats für die Fermentierung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, so dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"8% und 50% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Insbesondere in Abhängigkeit von der Fermentergröße und damit in Abhängigkeit von der Menge an Gärsubstrat kann zur Erzielung der gewünschten Wirkung eine Zugabe von sehr stark unterschiedlichen Mengen an Mikroorganismen notwendig werden.
Sowohl die Bestimmung der Gesamtzahl von Mikroorganismen in dem Gärsubstrat wie auch die Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen im Gärsubstrat stellt für den Fachmann kein Problem dar. So kann beispielsweise mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten Oligosonden spezifisch der Anteil verschiedener Mikroorganismen in dem Gärsubstrat identifiziert werden
Besonders bevorzugt wird ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"6% und 25% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Insbesondere bevorzugt wird der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10^% und 10% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Ganz besonders bevorzugt wird der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"3% und 1% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
Es soll nochmals darauf hingewiesen werden, dass der Zusatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides zu jedem beliebigen Zeitpunkt des Fermentationsprozesses erfolgen kann, insbesondere können Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides auch zum Animpfen von Gärsubstrat bei der erstmaligen Inbetriebnahme oder einer Wiederinbetriebnahme eines Fermenters verwendet werden.
Ebenso ist es möglich Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides bei Störungen des Fermentationsprozesses zur Stabilisierung der Fermentation zuzugeben. Solche Störungen können durch Überwachung bestimmter charakteristischer Parameter der Fermentierung frühzeitig erkannt werden. Charakteristische Parameter geben Auskunft über die Qualität eines ablaufenden Fermentierungsprozesses zur Herstellung von Biogas. Solche charakteristischen Parameter sind nicht nur die Menge an erzeugtem Biogas und der Methangehalt des erzeugten Biogases sondern beispielsweise auch der Wasserstoffgehalt des erzeugten Biogases, der pH-Wert des Gärsubstrats, das Redoxpotential des Gärsubstrats, der Carbonsäuregehalt des Gärsubstrats, die Anteile verschiedener Carbonsäuren im Gärsubstrat, der Wasserstoffgehalt des Gärsubstrats, der Anteil der Trockensubstanz am Gärsubstrat, der Anteil der organischen Trockensubstanz am Gärsubstrat, die Viskosität des Gärsubstrats und die Raumbelastung des Fermentierungsreaktors.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Bakterien der Art Clostridium sporosphaeroides können mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Methoden aus dem Gärsubstrat eines Fermenters isoliert werden. Dabei wird ein geeignetes Substrat aus einem Fermenter in ein Selektionsmedium eingebracht, über längere Zeit kultiviert und schließlich einzelne Kolonien von Mikroorganismen aus dem Selektionsmedium isoliert. Nach Vervielfältigung der daraus erhaltenen mikrobiellen DNA mittels PCR können auf der Basis der DNA Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides ausgewählt werden.
Bakterien Clostridium sporosphaeroides SBG3 wurden aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Dazu wurde durch ein flüssiges Selektionsmedium Stickstoff und Kohlendioxid durchgeleitet, anschließend Na2S zu dem Selektionsmedium zugegeben und autoklaviert (20 Min. bei 1210C). Dann wurde die aus dem Nachgärer gewonnene Biomasse in das Selektionsmedium eingebracht und für zumindest eine Woche bei einer Temperatur von mindestes 300C kultiviert. Eine aus dem flüssigen Selektionsmedium gewonnen Probe wurde auf ein festes Selektionsmedium aufgebracht und nachfolgend die auf dem festen Selektionsmedium gewachsenen Kolonien von Mikororganismen ausgewählt. Nach Vervielfältigung der erhaltenen mikrobiellen DNA mittels PCR konnte ein Vergleich mit bekannten DNA-Sequenz durchgeführt werden.
Nachdem die Bakterien Clostridium sporosphaeroides SBG3 erfolgreich aus dem Gärsubstrat des Nachgärers isoliert worden waren, wurden diese Mikroorganismen einer Sequenzanalyse unterzogen. Die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst 1409
Nukleotide. Als nächster Verwandter wurde der nicht kultivierte Clostridien Klon
1099982248072 identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergibt, dass insgesamt
19 Austausche von Nukleotiden oder Lücken vorliegen. Bei einer Länge der Sequenz von Clostridium sporosphaeroides SBG3 von 1409 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des FASTA-Algorithmus eine Übereinstimmung von 98%.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 98,1 % oder mehr als 98,2% oder mehr als 98,3% oder mehr als 98,4% oder mehr als 98,5% oder mehr als 98,6% oder mehr als 98,7% oder mehr als 98,8% oder mehr als 98,9% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst also auch alle Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 lediglich an einer Position einen Nukleotidaustausch aufweist. Ebenso umfasst sind alle Mikroorganismen, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 lediglich an drei Positionen einen Nukleotidaustausch aufweist. Daneben sind alle Mikroorganismen umfasst, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 lediglich an fünf Positionen einen Nukleotidaustausch aufweist.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch alle Mikroorganismen, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 Nukleotidaustausche an acht Positionen aufweist. Ebenso umfasst sind alle Mikroorganismen, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 an zehn Positionen Nukleotidaustausche aufweist. Daneben sind alle Mikroorganismen umfasst, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 an 13 Positionen Nukleotidaustausche aufweist.
Daneben umfasst die vorliegende Erfindung auch alle Mikroorganismen, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 Nukleotidaustausche an 16 Positionen aufweist. Ebenso umfasst sind alle Mikroorganismen, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 an 18 Positionen Nukleotidaustausche aufweist.
Es versteht sich von selbst, dass die Austausche der Nukleotide an beliebigen Position der DNA-Sequenz vorliegen können. Insbesondere können die Austausche an beliebig weit voneinander entfernten Positionen vorliegen. Sind im Vergleich zur Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 beispielsweise sechs Nukleotide ausgetauscht, so können diese sechs ausgetauschten Nukleotide benachbart zueinander vorliegen. In diesem Fall wäre ein sechs Nukleotide langes Teilstück der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 verändert. Ebenso können die sechs ausgetauschten Nukleotide aber beispielsweise jeweils 100 Nukleotide weit voneinander entfernt sein. Die Austausche können also in beliebigen Kombinationen vorliegen.
Ebenso können die genannten Austausche auch in Form von Lücken vorliegen. Die vorliegende Erfindung umfasst also auch alle Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, in der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 lediglich an einer Position ein Nukleotid fehlt. Ebenso umfasst sind alle Mikroorganismen, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, in der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 lediglich an drei Positionen Nukleotide fehlen. Daneben sind alle Mikroorganismen umfasst, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, in der gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 lediglich an fünf Positionen Nukleotide fehlen.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch alle Mikroorganismen, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, in dem gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 Nukleotide an acht Positionen fehlen. Ebenso umfasst sind alle Mikroorganismen, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, in dem im Vergleich zu der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 an zehn Positionen Nukleotide fehlen. Daneben sind alle Mikroorganismen umfasst, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, in dem gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 an 13 Positionen Nukleotide fehlen.
Daneben umfasst die vorliegende Erfindung auch alle Mikroorganismen, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, in dem gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 Nukleotide an 16 Positionen fehlen. Ebenso umfasst sind alle Mikroorganismen, deren DNA-Sequenz zumindest einen Sequenzbereich aufweist, in dem gegenüber der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 an 18 Positionen Nukleotide fehlen.
Es versteht sich von selbst, dass die Nukleotide an beliebigen Position der DNA- Sequenz fehlen können. Insbesondere können die Lücken an beliebig weit voneinander entfernten Positionen vorliegen. Fehlen im Vergleich zur Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 beispielsweise sechs Nukleotide, so können diese sechs fehlenden Nukleotide in der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 benachbart zueinander vorliegen. In diesem Fall würde ein sechs Nukleotide langes Teilstück der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 fehlen. Ebenso können die sechs fehlenden Nukleotide in der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aber beispielsweise jeweils 100 Nukleotide weit voneinander entfernt sein. Die Lücken können also in beliebigen Kombinationen vorliegen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 98% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10"4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 98,1 % oder mehr als 98,2% oder mehr als 98,3% oder mehr als 98,4% oder mehr als 98,5% oder mehr als 98,6% oder mehr als 98,7% oder mehr als 98,8% oder mehr als 98,9% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"2%, bevorzugt zumindest 1% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10%, insbesondere bevorzugt zumindest 25% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Ganz besonders bevorzugt macht der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 50%, insbesondere zumindest 75% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Ebenfalls bevorzugt sind Ausführungsformen, gemäß denen der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 90% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Besonders bevorzugt handelt es sich um eine Reinkultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei es sich um eine Reinkultur des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides SBG3 wie er oben in Bezug auf seine Nukleotidsequenz charakterisiert wurde, handelt.
Besonders bevorzugt handelt es sich in den oben beschriebenen Fällen um eine immobilisierte Kultur von Mikroorganismen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine immobilisierte Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der immobilisierten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 98% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten immobilisierten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 98,1% oder mehr als 98,2% oder mehr als
98,3% oder mehr als 98,4% oder mehr als 98,5% oder mehr als 98,6% oder mehr als 98,7% oder mehr als 98,8% oder mehr als 98,9% Sequenzidentität mit der
Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Insbesondere bevorzugt enthält die
Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten immobilisierten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz die einen Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten immobilisierten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Bakterien der Art Clostridium sporosphaeroides SBG3 wurden erfolgreich aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Die Isolation der Mikroorganismen erfolgte mithilfe eines Selektionsmediums, das Carboxymethylcellulose als einzige Kohlenstoffquelle beinhaltete. Carboxymethylcellulose besitzt sehr große Ähnlichkeit mit der in Gärsubstraten von Biogasanlagen enthaltenen Cellulose und weist zudem durch die Verknüpfung der Hydroxylgruppen mit Carboxymethylgruppen (-CH2- COOH-) eine verbesserte Löslichkeit in wässrigem Medium auf. Das zur Selektion von Clostridium sporosphaeroides SBG3 eingesetzte Medium wurde mit N2 und CO2 begast, damit die Selektion unter anaeroben Bedingungen erfolgen konnte. Enthaltener Restsauerstoff wurde anschließend mit Hilfe von 0,5 g/l Na2S reduziert.
Das Selektionsmedium wurde anschließend mit dem Überstand von Material aus einem Nachgärer beimpft. Nach einer einwöchigen Kultivierung bei 400C zeigten sich bei mikroskopischer Analyse einzelne Stäbchen. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte durch den Ausstrich auf anaeroben Carboxymethylcellulose- Platten. Das Zellmaterial der gewachsenen Kolonien diente zur Vervielfältigung der mikrobiellen DNA mittels der Colony-PCR Methode nach einem Standard- Programm. Nach der Sequenzanalyse der Kolonien erbrachte der phylogenetische Vergleich der daraus generierten Sequenzdaten mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov, dass die erhaltene Sequenz dem Organismus Clostridium sporosphaeroides als nächstem Verwandten zugeordnet werden kann.
Versuche mit einer Reinkultur des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides SBG3 zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums führt.
Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 I unter realistischen Anlagenbedingungen wurden über einen
Zeitraum von mehreren Monaten der zeitliche Verlauf der Raumbelastung des
Fermenters in Kilogramm organischer Trockensubstanz je Kubikmeter je Tag (kg oTS/m3d) und der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter
(Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Daneben wurde der zeitliche Verlauf der theoretischen Gasproduktion in [Nl/d] berechnet.
Das Kuratorium für Technik und Bauwesen in der Landwirtschaft (KTBL) aber auch die Landesanstalt für Landwirtschaft haben Richtwerte herausgegeben, die in etwa angeben, welche Mengen an Biogas in Abhängigkeit vom eingesetzten Substrat bei einer stabilen Fermentierung zu erwarten sind. Diese theoretischen Richtwerte können somit die Menge an theoretisch erzeugbarem Biogas widerspiegeln. Alternativ können auch von anderen Instituten in anderen Ländern herausgegebene Richtwerte verwendet werden. Der zeitliche Verlauf der theoretischen Gasproduktion in [Nl/d] wurde nach solchen Richtwerten berechnet.
Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe von Mikroorganismen Clostridium sporosphaeroides SBG3.
Ohne Zugabe von Mikroorganismen Clostridium sporosphaeroides SBG3 läuft über mehrere Wochen ein kontinuierlicher und stabiler Fermentationsprozess ab, der durch einen Anstieg der Raumbelastung auf etwa 6,5 kg oTS/m3d sowie durch eine mit der Raumbelastung kontinuierliche zunehmende Bildung von Biogas gekennzeichnet ist. Wegen einer unkontrolliert hohen Säurekonzentration im Gärsubstrat wurde die Raumbelastung durch ein Aussetzen der Steigerung der Substratzufuhr ab einem bestimmten Zeitpunkt für mehrere Tage nicht weiter gesteigert. Da die Säurekonzentrationen jedoch weiterhin unkontrollierbar blieben, wurde anschließend die Substratzufuhr vollständig ausgesetzt. Es zeigte sich, dass eine maximale Raumbelastung von 5,5 kg oTS/msd erreicht werden konnte. Bei einer höheren Raumbelastung ist aufgrund des Zusammenbruchs des Fermentationsprozesses kein stabiler Betrieb mehr möglich.
Der oben beschriebene Fermentationsprozess wurde unter ansonsten identischen Bedingungen unter Zugabe des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zum Gärsubstrat durchgeführt. Zugegeben wurde zunächst die Zellmasse aus 11 einer Vorkultur von Clostridium sporosphaeroides SBG3, die 5 Tage bei einer Temperatur von etwa 400C inkubiert worden war. Die Zellzahl dieser Vorkultur besaß eine Zelldichte von ca. 2,0 x 108 Zellen/ml mit einem Anteil lebender Zellen von über 90%. Während die Zugabe zunächst im 11-Maßstab zweimal wöchentlich erfolgte, wurde die Zugabemenge zu einem späteren Zeitpunkt verdoppelt, sodass zweimal wöchentlich eine Zugabe der Zellmasse aus 21 einer Vorkultur von Clostridium sporosphaeroides SBG3 erfolgte. Schließlich wurde dreimal wöchentlich Zellmasse aus 21 einer Vorkultur von Clostridium sporosphaeroides SBG3 zugegeben. Zudem wurde die Inkubationsdauer der Vorkultur auf mindestens 7 Taggee aauusscgedehnt, wodurch die Zelldichte auf durchschnittlich 1 x 109 Zellen/ml anstieg.
Durch die Zugabe der Reinkulturen von Clostridium sporosphaeroides SBG3 konnte ddiiee RRaauumbelastung bis auf einen Maximalwert von etwa 8,5 kg oTS/m3d gesteigert werden.
Parallel zur steigenden Raumbelastung konnte eine Steigerung des Biogasertrages beobachtet werden. Dabei war eine Übereinstimmung der erzeugten Biogasmenge in Normliter/Tag [Nl/d] mit der theoretischen Gasproduktion in Normliter/Tag [Nl/d] zu beobachten.
Zum Zeitpunkt der ersten Zugabe einer Reinkultur von Clostridium sporosphaeroides SBG3 wurde der Fermenter mit einer Raumbelastung von etwa
4.5 kg organischer Trockensubstanz/m3 und Tag betrieben. Die Raumbelastung der
Anlage konnte infolge der Zugabe von Clostridium sporosphaeroides SBG3 weiter gesteigert werden. Dabei blieb der prozentuale Gehalt an Trockensubstanz beziehungsweise organischer Trockensubstanz nahezu konstant. Diese Beobachtung legt nahe, dass während der Fermentierung des Gärsubstrats keine
Anhäufung von nicht-fermentierter organischer Trockensubstanz erfolgt. Die Zugabe von Reinkulturen von Clostridium sporosphaeroides SBG3 trägt also zu einer kontinuierlichen Umsetzung der enthaltenen Trockenmasse im Gärsubstrat bei, welche wiederum zu einer kontinuierlichen Fermentierung führt, indem die Anhäufung von Trockensubstanz vermindert wird.
In Phasen, in denen die Biogasanlage bei konstanter Raumbelastung betrieben wird, ist sogar eine Abnahme der Trockensubstanz zu beobachten, was darauf schließen lässt, dass die Clostridium sporosphaeroides SBG3 -Mikroorganismen mit ihrer hydrolytischen Stoffwechselaktivität nicht nur die Anhäufung von Trockensubstanz im Fermenter vermindern, sondern auch die hydrolytische Umsetzung dieser Trockensubstanz verbessern. In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Clostridium sporosphaeroides eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem Anteil an Clostridium sporosphaeroides verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden.
Die Zugabe des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides SBG3 zeigt einen positiven Effekt auf die Hydrolyse organischer Trockensubstanz. Durch die Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides kann die Raumbelastung eines Fermenters unter ansonsten identischen Bedingungen von etwa 5,5 kg oTS/m3d auf rund 8,5 kg oTS/m3d, also um mehr als 50% gesteigert werden, ohne dass sich eine Instabilität des Fermentationsprozesses auch nur andeuten würde. Parallel zu der erhöhten Raumbelastung wird die Menge an gebildetem Biogas mehr als verdoppelt. Zudem steigt die spezifische Ausbeute an Biogas an, da deutlich mehr der organischen Trockensubstanz abgebaut wird als bei fehlender Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides. Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides führt zu einer dramatischen Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Biogasanlagen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse in einem Fermentierungsreaktor, dadurch gekennzeichnet, dass der Biomasse ein Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in Form einer Kultur von Mikroorganismen zugesetzt wird, wobei der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10^% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"2% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen
Mikroorganismen ausmacht.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 1 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 50% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 75% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 90% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
9. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reinkultur des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt wird.
10. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides der Biomasse als Bestandteil zumindest einer immobilisierten
Kultur von Mikroorganismen zugesetzt wird.
11. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zeitnah zur Zugabe des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zusätzliche Biomasse in den
Fermentierungsreaktor gegeben wird.
12. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Raumbelastung im Fermentierungsreaktor durch kontinuierliche Zugabe von Biomasse kontinuierlich gesteigert wird.
13. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung von Biogas aus Biomasse bei einer Raumbelastung von ≥ 0,5 kg oTS/m3d, bevorzugt ≥ 4,0 kg oTS/m3d, besonders bevorzugt ≥ 8,0 kg oTS/m3d, durchgeführt wird.
14. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung von Biogas aus Biomasse unter konstanter Durchmischung des Gärsubstrats erfolgt.
15. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung von Biogas aus Biomasse bei einer Temperatur von 200C bis 800C, bevorzugt bei einer Temperatur von 40°C bis 500C durchgeführt wird.
16. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe von Gärsubstrat und die Zugabe des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides kontinuierlich erfolgen.
17. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"8% und 50% der Gesamtzahl an in dem
Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des
Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"6% und 25% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"4% und 10% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"3% und 1% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
21. Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
22. Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID
Nr. 1 aufweist.
23. Mikroorganismus nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,2% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
24. Mikroorganismus nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,4% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
25. Mikroorganismus nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,6% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
26. Mikroorganismus nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,8% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
27. Mikroorganismus nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99%
Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
28. Mikroorganismus nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
29. Mikroorganismus nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht.
30. Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides gemäß den Ansprüchen 22 bis 29 anwesend ist, wobei der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"40Zo der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
31. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"2% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
32. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 1% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
33. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 10% der
Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
34. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 25% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
35. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 50% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
36. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 75% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
37. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides zumindest 90% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
38. Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Reinkultur des Mikroorganismus Clostridium sporosphaeroides handelt.
39. Kultur von Mikroorganismen nach zumindest einem der Ansprüche 30 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine immobilisierte Kultur von
Mikroorganismen handelt.
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