DE102009026114A1

DE102009026114A1 - Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse

Info

Publication number: DE102009026114A1
Application number: DE102009026114A
Authority: DE
Inventors: Monika Dr. Reuter; Doris Dr. Schmack
Original assignee: Schmack Biogas GmbH
Current assignee: Schmack Biogas GmbH
Priority date: 2009-07-07
Filing date: 2009-07-07
Publication date: 2011-02-10

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse, wobei der Biomasse ein Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zugesetzt wird.

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von Biomasse unter Verwendung von Mikroorganismen sowie die Mikroorganismen an sich.
Stand der Technik
Biokraftstoffe werden hauptsächlich durch Vergärung von Pflanzensubstraten mit Hilfe von Hefen, Bakterien oder Pilzen gewonnen. Die produzierten flüssigen Energieträger, insbesondere Bioethanol, können anschließend als Brennstoff in geeigneten Feuerungsanlagen oder als Treibstoff oder -zusatz in Kraftfahrzeugmotoren oder Motoren zur Strom- und Wärmeerzeugung eingesetzt werden. Die Biomasse wird somit in einen flüssigen und gut transportierbaren Energieträger mit relativ hoher Energiedichte umgewandelt, der dann weitgehend universell eingesetzt werden kann.
Als Rohstoffe für die Erzeugung von flüssigen Biokraftstoffen kommen meist lokal verfügbare Pflanzen mit einem hohen Gehalt an Zucker oder Stärke zum Einsatz. In Europa sind dies vor allem Mais- und Geteidekörner sowie Zuckerrüben, in Nordamerika Mais und in Lateinamerika Zuckerrohr oder -melasse. In Frage kommen aber auch weitere Energiepflanzen wie Zuckerhirse (Sorghum), Triticale oder Cassava (Maniok). Derzeit werden als Ausgangsmaterial bei der Verflüssigung von Biomasse insbesondere Maiskorn und Getreidekorn eingesetzt. Aufgrund der zunehmenden Rohstoffknappheit, der gestiegenen Rohstoffpreise, einer enstandenen Konkurrenzsituation um Pflanzen, die sowohl der menschlichen und tierischen Nahrung dienen als auch der Energiegewinnung, einer verbesserten CO₂-Bilanz sowie der Schonung der Ressourcen wird nun zunehmend versucht, nicht nur die Körner von Mais und Getreide zu verwenden, sondern vielmehr die gesamte Pflanze der Energiegewinnung zuzuführen oder Pflanzen zu verwenden, die keiner intensiven landwirtschaftlichen Bewirtschaftung bedürfen wie Rutenhirse oder Chinaschilf. Dabei handelt es sich um sogenannte „second generation”-Kraftstoffe. Daneben wird auch eine vermehrte Nutzung von günstigen pflanzlichen Reststoffen wie Stroh, pflanzlichen Abfällen aus der Holzwirtschaft oder Garten- und Landschaftspflege angestrebt.
Um eine effiziente Vergärung der Biomasse sicher zu stellen, muss das als Rohstoff eingesetzte pflanzliche Material, insbesondere die darin enthaltene organische Trockensubstanz (oTS), für eine anschließende Verwertung aufgeschlossen werden. Dies geschieht durch Hydrolyse, was gleichermaßen einer Verflüssigung der organischen Trockensubstanz entspricht. Aus dem flüssigen Biomasse-Substrat wird dann durch Vergärung Ethanol oder ein anderer Biokraftstoff hergestellt. Mit den vorhandenen Techniken werden aber nur unbefriedigende Ausbeuten erreicht, was insbesondere an der nicht ausreichenden Verflüssigung und damit Verwertung des Rohmaterials liegt.
Bei der Herstellung von Bioethanol erfolgt die ethanolische Gärung in erster Linie durch zugesetzte Hefen, die Glucose in Ethanol umwandeln. Je nach Substrat ist schon ein relativ hoher Zuckeranteil vorhanden (z. B. bei Melasse) oder es müssen zuerst höhermolekulare Substrate wie Stärke, Cellulose oder Hemicellulose (z. B. bei Getreide, Stroh, Ganzpflanzeneinsatz) enzymatisch oder chemisch gespalten werden, damit die alkoholische Gärung erfolgen kann. Für diesen hydrolytischen Substrataufschluss, der auch einer Verflüssigung entspricht, sind in erster Linie Mikroorganismen, insbesondere Bakterien verantwortlich.
Soll die Umwandlung organischer Rohstoffe nicht zu einem flüssigen Biokraftstoff, sondern zu einem gasförmigen Energieträger führen, so kommen Biogasanlagen zum Einsatz. In Biogasanlagen wird Methan durch einen mikrobiellen Abbauprozess organischer Substanzen erzeugt. Das Biogas entsteht dabei in einem mehrstufigen Prozess der Vergärung oder Faulung durch die Aktivität von anaeroben Mikroorganismen, d. h. unter Ausschluss von Luft.
Das als Gärsubstrat verwendete organische Material besitzt aus chemischer Sicht einen hochmolekularen Aufbau, der in den einzelnen Verfahrensschritten einer Biogasanlage durch Stoffwechseltätigkeit der Mikroorganismen zu niedermolekularen Bausteinen abgebaut wird. Die bei der Fermentierung des organischen Gärsubstrats aktiven Populationen von Mikroorganismen sind bislang aber nur unzureichend charakterisiert.
Nach heutigem Kenntnisstand können vier nacheinander, aber auch parallel ablaufende und ineinander greifende biochemische Einzelprozesse unterschieden werden, die den Abbau von organischen Gärsubstraten zu den Endprodukten Methan und Kohlendioxid ermöglichen: Hydrolyse, Acidogenese, Acetogenese und Methanogenese.
In der Hydrolyse werden hochmolekulare, oft partikulär vorliegende, organische Verbindungen durch Exoenzyme (z. B. Cellulasen, Amylasen, Proteasen, Lipasen) fermentativer Bakterien in lösliche Spaltprodukte überführt. Dabei werden beispielsweise Fette in Fettsäuren, Kohlenhydrate, wie z. B. Polysaccharide, in Oligo- und Monosaccharide sowie Proteine in Oligopeptide beziehungsweise Aminosäuren zerlegt. Die daneben gebildeten gasförmigen Produkte bestehen überwiegend aus Kohlendioxid.
Fakultativ und obligat anaerob lebende Bakterien, oftmals identisch mit den hydrolysierenden Bakterien, verstoffwechseln in der Acidogenese die Hydrolyseprodukte (z. B. Mono-, Disaccharide, Di-, Oligopeptide, Aminosäuren, Glycerin, langkettige Fettsäuren) intrazellulär zu kurzkettigen Fett- oder Carbonsäuren, wie beispielsweise Butter-, Propion- und Essigsäure, zu kurzkettigen Alkoholen wie zum Beispiel Ethanol und zu den gasförmigen Produkten Wasserstoff und Kohlendioxid.
In der sich anschließenden Acetogenese werden die in der Acidogenese gebildeten kurzkettigen Fett- und Carbonsäuren sowie die kurzkettigen Alkohole von acetogenen Bakterien aufgenommen und nach β-Oxidation als Essigsäure wieder ausgeschieden. Nebenprodukte der Acetogenese sind CO₂ und molekularer Wasserstoff (H₂).
Die Produkte der Acetogenese wie Essigsäure aber auch andere Substrate wie Methanol und Formiat werden durch Methan-bildende Organismen in der obligat anaerob verlaufenden Methanogenese zu Methan und CO₂ umgesetzt. Das hier entstehende CO₂ und auch das während der übrigen Prozessschritte, wie z. B. der Hydrolyse, gebildete CO₂ kann wiederum durch Mikroorganismen mit dem angefallenen H₂ ebenfalls zu Methan umgesetzt werden.
Die Erhöhung der Ausbeute an Endprodukten aus einer gegebenen Menge an Edukten stellt wie bei jeder chemischen Umsetzung auch sowohl im Fall der Verflüssigung von Biomasse wie auch bei der Herstellung von Biogas ein vordringliches Ziel der Prozessführung dar. Aus einer gegebenen Menge an Biomasse soll eine möglichst große Menge an flüssigen organischen Verbindungen bzw. eine möglichst große Menge an Methan gebildet werden. Für die Erzeugung von Biogas aus Biomasse bedeutet dies, dass aus einer gegebenen Menge an organischem Gärsubstrat eine möglichst große Menge an Methan gebildet werden soll. Die durchschnittlich gebildeten Methanmengen (Methanproduktivität in Normkubikmeter pro m³ Arbeitsvolumen und Tag) von Biogasanlagen liegen zwischen 0,25 und 1,1 Nm³CH₄/m³d, wobei die meisten Anlagen eine Methanproduktivität im Bereich von 0,50 bis 0,75 Nm³CH₄/m³d aufweisen (aus „Ergebnisse des Biogas-Messprogramms", 2005, Hrsgb. Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V., Gülzow). Substratspezifische Methanausbeuten (angegeben in Normkubikmeter pro Tonne zugeführtes Substrat) weisen einen sehr großen Wertebereich zwischen etwa 16 und 206 Nm³CH₄/t auf, da die Substrate, mit denen Biogasanlagen betrieben werden, sehr unterschiedlich sind (z. B. Gülle oder tierische Exkremente, Abfälle aus der Lebensmittelproduktion oder Grünabfall, nachwachsende Rohstoffe wie Silomais oder Zuckerrübenschnitzel) und damit einhergehend sehr unterschiedliche Energiegehalte aufweisen (aus „Ergebnisse des Biogas-Messprogramms", 2005, Hrsgb. Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V., Gülzow). Daneben spielen für die substratspezifischen Methanausbeuten anlagenspezifische Parameter wie die Raumbelastung oder die hydraulische Verweilzeit eine Rolle.
In der Regel soll eine möglichst hohe Raumbelastung der Fermenter erreicht werden. Die durchschnittlichen Raumbelastungen (angegeben in kg organischer Trockensubstanz pro Kubikmeter und Tag), unter denen Biogasanlagen betrieben werden, liegen bei 1 bis 3 kg oTR/m³d, wobei einstufige Anlagen in der Regel höhere Raumbelastungen aufweisen als mehrstufige Anlagen und eine Raumbelastung von 5,7 kg oTR/m³d der höchste Wert war, der gemessen wurde (aus „Ergebnisse des Biogas-Messprogramms", 2005, Hrsgb. Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V., Gülzow).
Unter der Raumbelastung eines Fermenters versteht man die Menge an dem Fermenter zugeführten Substrat, die in Kilogramm organischer Trockensubstanz pro Kubikmeter Fermentervolumen und pro Tag angegeben wird. Die Menge an erzeugtem Biogas hängt stark von der Raumbelastung des Fermenters ab, wobei mit steigender Raumbelastung eine zunehmend größere Menge an Biogas erzeugt wird. Eine hohe Raumbelastung macht den Prozess der Biogaserzeugung also zunehmend ökonomisch rentabler, führt andererseits aber zu einer zunehmenden Destabilisierung der biologischen Prozesse der Fermentierung.
Es besteht weiterhin ein Bedarf an Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere an effizienteren Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse für die Produktion von Biokraftstoffen sowie an Verfahren zur Erzeugung von Biogas, die eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte Ausbeute an Methan ermöglichen.
Definitionen
Unter dem Begriff „Biokraftstoff” wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein flüssiger oder gasförmiger Kraftstoff bzw. Energieträger verstanden, der aus Biomasse hergestellt wird. Biokraftstoffe kommen für den Betrieb von Verbrennungsmotoren sowohl für mobile (z. B. Kraftfahrzeuge) als auch stationäre (z. B. Erzeugung von Elektro- und Wärmeengergie in einem Blockheizkraftwerk) Anwendungen zum Einsatz. Beispiele für Biokraftstoffe sind Biodiesel, Bioethanol, Biomethan, Biokerosin, Biowasserstoff.
Unter dem Begriff „Bioethanol” wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Ethanol verstanden, der durch alkoholische Gärung aus Biomasse als nachwachsendem Kohlenstoffträger oder biologisch abbaubaren Anteilen von Abfällen hergestellt wurde. Er dient in verschiedenen Konzentrationen als Zusatz zu Mineralölkraftstoffen wie Biodiesel oder Biokraftstoff.
Unter dem Begriff „Biogas” wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das gasförmige Produkt des anaeroben biologischen Abbaus organischer Substrate verstanden. Es enthält in der Regel ca. 45–70% Methan, 30–55% Kohlendioxid, sowie geringe Mengen an Stickstoff, Schwefelwasserstoff und andere Gasen.
Die Begriffe „Fermentation” oder „Fermentierung” umfassen im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl anaerobe wie auch aerobe Stoffwechselprozesse, die unter Einwirkung von Mikroorganismen in einem technischen Prozess aus dem zugeführten Substrat zur Erzeugung eines Produktes, z. B. Biogas führen. Eine Abgrenzung zu dem Begriff „Gärung” ist insofern gegeben, dass es sich bei diesem ausschließlich um annaerobe Prozesse handelt.
Unter einem „Fermenter” wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Behälter verstanden, in dem der mikrobiologische Abbau des Substrates bei gleichzeitiger Biogasbildung stattfindet. Die Begriffe „Reaktor”, „Gärbehälter” und „Faulbehälter” werden synonym verwendet.
Unter den Begriffen „Gärsubstrat” oder „Substrat” wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung organisches und biologisch abbaubares Material verstanden, das dem Fermenter zur Fermentation zugesetzt wird. Substrate können nachwachsende Rohstoffe, Wirtschaftsdünger, Substrate aus der weiterverarbeitenden Agrarindustrie, organische kommunale Reststoffe, Schlachtrückstände oder Grünschnitt sein. Beispiele für obengenannte Substrate sind Maissilage, Roggensilage, Zuckerrübenschnitzel, Melasse, Grassilage, Rinder- oder Schweinegülle, Rinder-, Schweine-, Hühner- oder Pferdemist, Biertreber, Apfel-, Obst- oder Rebentrester, Getreide-, Kartoffel- oder Obstschlempe. Organischer Abfall aus Biotonne, Speisereste, Marktabfälle, Fett aus Fettabscheidern, Panseninhalt, Schweinemageninhalt.
Unter dem Begriff „Gärrückstand” oder „Gärgut” wird der Rückstand der Biogasgewinnung verstanden der den Fermenter verlässt und häufig in einem eigenen Behälter gelagert wird.
Unter „Raumbelastung” wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die pro Tag und Kubikmeter (m³) Arbeitsvolumen dem Fermenter zugeführte Menge an organischer Trockensubstanz (oTS) in kg angegeben.
Unter „organischer Trockensubstanz” (o-TS) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der wasserfreie organische Anteil eines Stoffgemisches nach Entfernung der anorganischen Anteile und Trocknung bei 105°C verstanden. In der Regel wird der Trockensubstanzanteil in % vom Substrat angegeben.
Unter dem Begriff „Verweilzeit” wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die durchschnittliche Aufenthaltszeit des Substrates im Fermenter verstanden.
Unter dem Begriff „spezifische Biogasausbeute” oder „spezifische Methanausbeute” wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Menge an erzeugtem Biogas oder Methan (angegeben in Normkubikmeter Nm³ erzeugtem Gas) dividiert durch die Menge (in der Regel pro Tonne t) an eingesetzter organischer Trockensubstanz oder Substrat verstanden.
Von dem Begriff „Nukleotidsequenz” wird sowohl die DNA-Sequenz als auch die korrespondierende RNA-Sequenz umfasst. In der Erfindung angegebene RNA-Sequenzen unter der Verwendung der Basen A, U, C, G beziehen sich beispielsweise ebenso auf die korrespondierenden DNA-Sequenzen unter Verwendung der Basen A, T, C, G und umgekehrt.
Die Bestimmung der Nukleotid-Sequenz eines Mikroorganismus erfolgt mit Hilfe eines standardisierten Prozesses, durch den die einzelnen Nukleotide der DNA oder RNA des Mikroorganismus mit hoher Genauigkeit nachgewiesen werden können. Trotz der hohen Genauigkeit der Sequenzierungsverfahren können in einer Sequenz immer wieder einzelne Positionen vorliegen, für die die Bestimmung des an der jeweiligen Position vorliegenden Nukleotids nicht mit hinreichender Genauigkeit möglich war. In solchen Fällen ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung in der Nukelotidsequenz der Buchstabe „N” angegeben. Wird nachfolgend in einer Nukelotidsequenz der Buchstabe „N” verwendet, so steht dies als Kürzel für jedes denkbare Nukleotid, also für A, U, G oder C im Falle einer Ribonukleinsäure oder für A, T, G oder C im Falle einer Desoxyribonukleinsäure.
Der Begriff „Nukleotidmutation” wie hier verwendet bedeutet eine Veränderung der Ausgangsnukleotidsequenz. Dabei können einzelne Nukleotide oder mehrere, direkt aufeinander folgende oder durch nicht veränderte Nukleotide unterbrochene Nukleotidsequenzen entfernt (Deletion), hinzugefügt (Insertion oder Addition) oder durch andere ersetzt (Substitution) werden. Der Begriff schließt auch jede mögliche Kombination der einzelnen genannten Veränderungen ein.
Der Begriff „Deletion” wie hier verwendet bedeutet das Entfernen von 1, 2 oder mehr Nukleotiden aus der jeweiligen Ausgangssequenz.
Der Begriff „Insertion” oder „Addition” wie hier verwendet bedeutet das Hinzufügen von 1, 2 oder mehr Nukleotiden zu der jeweiligen Ausgangssequenz.
Der Begriff „Substitution” wie hier verwendet bedeutet den Austausch eines an einer bestimmten Position vorhandenen Nukleotids durch einen anderes.
Unter dem Begriff „Mikroorganismus” werden mikroskopisch kleine Lebewesen verstanden, die in der Regel Einzeller sind, aber auch Mehrzeller sein können. Beispiele für Mikroorganismen sind Bakterien, mikroskopische Algen, Pilze oder Protozoen.
Unter den Bezeichnungen „Gattung” von Mikroorganismen, „Art” von Mikroorganismen und „Stamm” von Mikroorganismen wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die entsprechende grundlegende Kategorie der biologischen Taxonomie, insbesondere der phylogenetischen Klassifikation verstanden. Gattungen, Arten und Stämme von Mikroorganismen werden u. a. anhand ihrer RNA-Sequenzen identifiziert und unterschieden. Unter eine bestimmte Gattung, eine bestimmte Art bzw. einen bestimmten Stamm fallen dabei nicht nur Mikroorganismen mit einer ganz bestimmten RNA-Sequenz, sondern auch bis zu einem gewissen Umfang deren genetische Varianten, wobei die genetische Varianz in der Reihe Stamm, Art, Gattung zunimmt.
Die Definition einer „Art” eines Bakteriens befindet sich im wissenschaftlichen Wandel und ist weder abgeschlossen noch sind die verschiedenen Konzepte unumstritten. In der vorliegenden Erfindung wird unter „Art” das Artkonzept verstanden, das sich auf genomische und phylogenetische Analysen bezieht und in dem Review von Staley (Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 2006, 361, 1899-1909) beschrieben ist. Weitestgehend anerkannt ist, dass zwei bakterielle Spezies, die mehr als 70% DNA-DNA-Hydridisierung oder mehr als 94% durchschnittliche Nukleotididentität (ANI, average nucleotide identity) aufweisen, derselben Art angehören bzw. zwei Spezies, die weniger als 97% Identität der 16S rRNA aufweisen, zwei unterschiedlichen Arten zuzuordnen sind.
Unter dem Begriff „Kultur” versteht sich in diesem Zusammenhang eine Ansammlung von Mikroorganismen unter geschaffenen Bedingungen, die das Wachstum oder zumindest das Überleben der Mikroorganismen gewährleisten. Für Bakterien sind das z. B. Anreicherungskulturen oder Reinkulturen, Flüssigkulturen ebenso wie Kulturen auf festen Medien wie Nährböden, aber auch Dauerkulturen wie tiefgekühlte Glycerinkulturen, immobilisierte Kulturen wie z. B. Gelkulturen oder hochkonzentrierte Kulturen wie Zellpellets.
Unter dem Begriff „Reinkultur” eines Mikroorganismus wird die Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle verstanden. Diese wird durch einen mehrstufigen Prozess aus einem Gemisch verschiedener Mikroorganismen isoliert. Der mehrstufige Prozess umfasst die Abtrennung einer einzelnen Zelle aus einer Zellpopulation und erfordert, dass auch die aus der Zelle durch Wachstum und Zellteilung hervorgehende Kolonie von anderen Einzelzellen oder Kolonien getrennt bleibt. Durch eine sorgfältige Abtrennung einer Kolonie, erneutes Suspendieren in Flüssigkeit und wiederholtes Ausstreichen können gezielt Reinkulturen von Mikroorganismen gewonnen werden. Die Isolierung einer Reinkultur kann auch in flüssigen Nährmedien erfolgen, sofern der gewünschte Organismus im Ausgangsmaterial zahlenmäßig überwiegt. Durch serienmäßige Verdünnung der Suspension in der Nährlösung lässt es sich schließlich erreichen, dass sich in der letzten Verdünnungsstufe nur noch eine Zelle befindet. Diese Zelle stellt dann die Basis für eine Reinkultur dar. Die Erläuterung des Begriffs „Reinkultur” und Verfahren zur Erzeugung derselben sind in „Allgemeine Mikrobiologie" von Hans G. Schlegel, 7. überarbeitete Auflage, 1992, Georg Thieme Verlag, S. 205 aufgeführt, worauf hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Unter dem Begriff „Mischkultur” wird ein Gemisch verschiedener Mikroorganismen verstanden. Natürliche Populationen von Mikroorganismen sind in der Regel Mischkulturen. Mischkulturen können jedoch auch künstlich hergestellt werden z. B. durch die Vereinigung von mehreren Reinkulturen.
Darstellung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse bereitzustellen, das eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte Ausbeute an verwertbaren Biokraftstoff ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren zur Behandlung von Biomasse gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung und den Beispielen.
Die Frage, ob die Erzeugung von Biogas in einem bestimmten Fermenter unter bestimmten Bedingungen in einer befriedigenden Güte abläuft, lässt sich nicht alleine anhand der absoluten Menge an erzeugtem Biogas beurteilen. Die Menge an erzeugtem Biogas hängt stark von der Menge an zugeführtem Substrat ab, vor allem von der Menge an organischer Trockensubstanz, die in den Fermenter eingebracht wird. Dies drückt sich in den Messparametern „Raumbelastung” und „spezifische Gasausbeute” aus, die somit eine besondere Bedeutung für die Effizienz einer Anlage darstellen. Treten Instabilitäten des Fermentierungsprozesses auf, wie z. B. ein Absinken des pH-Wertes, ein starker Anstieg der Bildung von flüchtigen Fettsäuren oder die Akkumulation von Hemmstoffen wie z. B. Ammoniak oder Schwefelwasserstoff, so nimmt die spezifische Gasausbeute ab.
Die Zusammensetzung der mikrobiellen Populationen in den verschiedenen Gärsubstraten sowie die Entwicklung der Organismenzusammensetzung während des Fermentationsprozesses ist größtenteils unbekannt, jedoch sehr variabel und unterliegt einem komplizierten dynamischen Prozeß, der auch durch die jeweiligen Prozessbedingungen beeinflusst wird. Zur Bestimmung der mikrobiellen Zusammensetzung sowie der Gesamtzahl von Mikroorganismen in einem Gärsubstrat wie auch der Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen in dem Gärsubstrat sind dem Fachmann verschiedene Methoden bekannt, die beispielsweise in dem Überblicksartikel von Amann et al. (Microbiol. Review. 59, 143-169, 1995) beschrieben sind. Eine bevorzugte Methode zur Bestimmung der Mikroorganismenzusammensetzung unabhängig von einer vorherigen Kultivierung der Mikroorganismen ist zum Beispiel die Erstellung einer rDNA Klonbibliothek (z. B. auf der Basis von 16S rRNA) nach Nukleinsäureextraktion und PCR, die anschließend sequenziert werden kann. Mit Hilfe dieser Klonbibliothek kann beispielsweise durch in situ Hybridisierung mit spezifischen Fluoreszenz-markierten Oligonukleotidsonden die Zusammensetzung der mikrobiellen Population im Gärsubstrat ermittelt werden. Geeignete rRNA-basierende Oligonukleotidsonden sind aus dem oben erwähnten Review bekannt oder können beispielsweise mittels probeBase (Loy et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31, 514-516. Loy et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: D800-D804) oder dem ARB Programmpaket (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371) gefunden werden. Eine quantitative Bestimmung des Anteils einzelner Mikroorganismen an der Gesamtpopulation kann in geeigneter Weise mit den Methoden quantitativer Dot Blot, in situ Hybridisierung oder der Hybridisierung von ganzen Zellen (whole cell hybrisization) durchgeführt werden.
Sämtliche nachfolgend beschriebenen, in einem Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse oder in einem Verfahren zur Herstellung von flüssigem Biokraftstoff zugesetzten Mikroorganismen werden bevorzugt in Form einer angereicherten Kultur dem biotechnologischen Prozess zugesetzt. Die Zugabe der Bakterienkultur kann in Form einer flüssigen Kultursuspension, bevorzugt in einem Anreicherungs- oder Selektionsmedium oder in Form trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Zellpellets vorgenommen werden. Für nicht-methanogene Mikroorganismen liegen die Zellkonzentrationen, die in angereicherten Kulturen erreicht werden, in einem Konzentrationsbereich von ca. 10⁶ Zellen pro ml Kultur bis etwa 10¹³ Zellen pro ml Kultur.
Die erfindungsgemäß in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse zugesetzten Mikroorganismen werden bevorzugt in Form einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen zugegeben. Für sämtliche nachfolgend beschriebene Arten von Mikroorganismen können als Trägermaterialien, auf denen der jeweilige Mikroorganismus immobilisiert wird, natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt werden. Bevorzugt werden gelbildende Polymere verwendet. Diese haben den Vorteil, dass Bakterien innerhalb der Gelstruktur aufgenommen bzw. eingelagert werden können. Bevorzugt werden solche Materialien eingesetzt, die sich in Wasser langsam auflösen bzw. abgebaut werden, so dass die Freisetzung des jeweiligen Mikroorganismus über einen längeren Zeitraum hinweg erfolgt.
Beispiele für geeignete Polymere sind Polyanillin, Polypyrrol, Polyvinylpyrolidon, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyvinylalkohol, Polyethylen, Polypropylen, Epoxidharze, Polyethylenimine, Polysaccharide wie Agarose, Alginat oder Cellulose, Ethylcellulose, Methylcellulose, Carboxymethylethylcellulose, Celluloseacetate, Alkali-Cellulosesulfat, Copolymere aus Polystyrol und Maleinsäureanhydrid, Copolymere aus Styrol und Methylmethacrylat, Polystyrolsulfonat, Polyacrylate und Polymethacrylate, Polycarbonate, Polyester, Silikone, Cellulosephthalat, Proteine wie Gelatine, Gummi arabicum, Albumin oder Fibrinogen, Gemische aus Gelatine und Wasserglas, Gelatine und Polyphosphat, Gelatine und Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Methylvinylether, Celluloseacetatbutyrat, Chitosan, Polydialkyldimethylammoniumchlorid, Mischungen aus Polyacrylsäuren und Polydiallyldimethylammoniumchlorid sowie deren Gemische. Das Polymermaterial kann auch mit Hilfe üblicher Vernetzer wie Glutaraldehyd, Harnstoff/Formaldehydharzen oder Taninverbindungen vernetzt werden.
Alginate als Immobilisate erweisen sich als besonders vorteilhaft, da sie zum einen keinen negativen Einfluss auf die Aktivität der Mikroorganismen nehmen und da sie zum anderen durch Mikroorganismen langsam abgebaut werden. Durch den langsamen Abbau der Alginat-Immobilisate werden nach und nach die eingeschlossenen Mikroorganismen freigesetzt.
Für die Immobilisation werden die Mikroorganismen mit einem Polymergel vermengt und dann in einer geeigneten Härterlösung gehärtet. Dazu werden sie zunächst mit einer Gellösung vermischt und anschließend in eine Härterlösung aus geeigneter Höhe getropft. Die genauen Vorgehensweisen zur Immobilisation sind dem Fachmann bekannt.
Es hat sich gezeigt, dass die nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen Eigenschaften aufweisen, aufgrund derer sich der Zusatz der Mikroorganismen während einer Fermentation zur Erzeugung von Biogas oder in einem Verfahren zur Erzeugung von flüssigem Biokraftstoff positiv auf die erzeugte Menge an Biokraftstoff, insbesondere Biomethan oder Bioethanol auswirkt, was die Rentabilität der entsprechenden Anlagen oder Prozesse signifikant erhöht. Da es sich bei den nachfolgend beschriebenen Mikroorganismen weder um methanbildende noch um ethanolbildende Bakterien handelt, kommt die Wirkungsweise der zugesetzten Bakterien wohl durch einen indirekten Effekt zustande, der sich aus dem komplexen Zusammenwirken verschiedener Mikroorganismen im biologischen Prozess der Biokraftstofferzeugung ergibt. Es ist davon auszugehen, dass die erfindungsgemäßen Bakterien Stoffwechselprodukte erzeugen, die den Mikroorganismen, die die eigentlichen Endprodukte (z. B. Methan, Ethanol, Methanol, Wasserstoff) generieren, als gut verwertbare Substrate dienen.
Zusätzlich zeigte sich, dass die nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen die Eigenschaft besitzen, hochmolekulare Anteile aus der Biomasse zu verwerten und damit das Substrat zu verflüssigen, was zu einer höheren Energieausbeute führt.
Neben der besseren Energiebilanz ist die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Bei einer hohen Viskosität des Substrates entstehen höhere Kosten durch vermehrten Energieaufwand beim Pumpen und Rühren sowie höhere Nebenkosten durch Abnutzung oder Reparatur von Pumpen, Rührwerken o. ä.. Falls eine Substratverdünnung wegen eines hohen Trockensubstanzgehalts notwendig ist, entstehen zusätzliche Wasser- und Abwasserkosten sowie technische Ausrüstung zur Wasserzufuhr, -rückgewinnung oder Abwasserbehandlung. Ein Zusatz von Mikroorganismen, die Gärsubstrate gezielt verflüssigen können und damit die oben genannten Probleme verringern, wäre für die Prozessführung sehr vorteilhaft. Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Substrats ausübt, kann mit einem Test bestimmt werden, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wird (Substratfließtest). Dazu werden Substratproben für etwa 1 bis 7 Tage nach einer Zugabe von erfindungsgemäßen Mikroorganismen unter Bedingungen inkubiert, die auch im Prozess der Biokraftstofferzeugung vorliegen. Anschließend werden die so behandelten Proben sowie Kontrollproben ohne Zugabe von erfindungsgemäßen Mikroorganismen an den oberen Rand einer schiefen Ebene gesetzt und anschließend die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke in einer bestimmten Zeit) gemessen. Eine höhere Fließgeschwindigkeit korreliert in diesem Test mit einer verstärkten Verflüssigung des Substrates bzw. mit einer verringerten Viskosität.
Grundsätzlich kann der Zusatz von hierfür geeigneten Mikroorganismen zu jedem beliebigen Zeitpunkt des Fermentationsprozesses erfolgen, insbesondere können die Mikroorganismen zum Animpfen von Gärsubstrat bei der erstmaligen Inbetriebnahme oder einer Wiederinbetriebnahme eines Fermenters verwendet werden. Es können sämtliche, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen zum Animpfen von Gärsubstrat oder zur Verflüssigung von Biomasse in der alkoholischen Gärung verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen können in Form einer Kultur einmalig oder mehrmalig in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen, bevorzugt jedoch wöchentlich oder monatlich, besonders bevorzugt täglich oder zweimal pro Woche in einer geeigneten Konzentration und Menge zugegeben werden. Geeignete Konzentrationen an Mikroorganismen und zugegebenen Mengen werden in den speziellen Ausführungsbeispielen erläutert.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Mikroorganismen auch bei Störungen des Fermentationsprozesses zur Stabilisierung der Fermentation zuzugeben. Solche Störungen können durch Überwachung bestimmter charakteristischer Parameter der Fermentierung frühzeitig erkannt werden. Charakteristische Parameter geben Auskunft über die Qualität eines ablaufenden Fermentierungsprozesses zur Herstellung von Biogas. Solche charakteristischen Parameter sind nicht nur die Menge an erzeugtem Biogas und der Methangehalt des erzeugten Biogases sondern beispielsweise auch der Wasserstoffgehalt des erzeugten Biogases, der pH-Wert des Gärsubstrats, das Redoxpotential des Gärsubstrats, der Carbonsäuregehalt des Gärsubstrats, die Anteile verschiedener Carbonsäuren im Gärsubstrat, der Wasserstoffgehalt des Gärsubstrats, der Anteil der Trockensubstanz am Gärsubstrat, der Anteil der organischen Trockensubstanz am Gärsubstrat, die Viskosität des Gärsubstrats und die Raumbelastung des Fermentierungsreaktors. Es können sämtliche, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen bei Störungen des Fermentationsprozesses zur Stabilisierung der Fermentation zugegeben werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird zeitnah zur Zugabe der nachfolgend beschriebenen Mikroorganismen zusätzliche Biomasse in den Fermentierungsreaktor gegeben. Eine zeitnahe Zugabe von zusätzlicher Biomasse kann innerhalb einer Zeitspanne von 1 Sekunde bis hin zu 3 Tagen nach Zugabe von Mikroorganismen erfolgen oder sie kann gleichzeitig mit der Zugabe von Mikroorganismen erfolgen. Dabei kann die Raumbelastung im Fermentationsreaktor durch kontinuierliche Zugabe von neuem Substrat kontinuierlich gesteigert oder in etwa konstant gehalten werden, wobei die Fermentierung bei allen Raumbelastungen, bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥ 0.5 kg organischer Trockensubstanz pro m³ und Tag [kg oTS/m³d], weiter bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥ 4.0 kg oTS/m³d und besonders bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥ 8.0 kg oTS/m³d durchgeführt werden kann, was im Vergleich zum gegenwärtigen Stand der Technik einer Erhöhung der durchschnittlichen Raumbelastung um mehr als das Doppelte entspricht. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird daher die Raumbelastung im Fermentierungsreaktor durch kontinuierliche Zugabe von Biomasse kontinuierlich gesteigert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Gärsubstrat und Mikroorganismen kontinuierlich zugegeben. Der kontinuierliche Betrieb eines Fermentationsreaktors soll bei einer stabilen mikrobiellen Biozönose zu einer kontinuierlichen Produktion von Biogas führen, wobei das Aussetzen der Substratzugabe zur Fermentation infolge einer Prozessstörung vermindert werden soll. Auch in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können alle, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen eingesetzt werden.
Ebenfalls ist die Ausführung des Fermentationsverfahrens und der damit zusammenhängenden Prozesse auch in einem diskontinuierlichen Betrieb, beispielsweise „Batch”-Fermentierung denkbar. So kann dem Gärsubstrat gemäß einer weiteren Ausführungsform während der Fermentierung ein Mikroorganismus beispielsweise in regelmäßigen Abständen zugegeben werden. Die Zugabe des Mikroorganismus in regelmäßigen Abständen führt zu einer Steigerung der Lebendzellzahl und somit zu einem verbesserten Ablauf der Methanbildung. Auch in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können alle, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen eingesetzt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Erzeugung von Biogas aus Biomasse unter konstanter Durchmischung des Gärsubstrats. Durch die konstante Durchmischung des Gärsubstrats können die zugegebenen Kulturen von Mikroorganismen besser im Gärsubstrat verteilt werden. Außerdem kann das gebildete Biogas besser aus dem Fermentationsprozess abgeführt werden. Die genannten Vorteile stellen sich im Zusammenhang mit sämtlichen, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen ein.
Die konstante Durchmischung des Gärsubstrats führt zudem zu einer gleichmäßigen Wärmeverteilung im Fermentationsreaktor. Messungen der Temperatur im Fermentationsreaktor, die in periodischen Abständen, aber auch kontinuierlich durchgeführt wurden, ergaben, dass das Gärsubstrat in einem Temperaturbereich von 20°C bis 80°C, bevorzugt bei etwa 35°C bis 60°C, besonders bevorzugt bei 40°C bis 50°C effizient fermentiert wird. Diese Temperaturbereiche werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung daher im Zusammenhang mit sämtlichen, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen bevorzugt. Neben der Hydrolyse erfolgt insbesondere die letzte Stufe des Fermentationsprozesses, nämlich die Bildung von Methan durch methanogene Mikroorganismen, besonders effizient bei erhöhten Temperaturen. Für mehrstufige Biogasanlagen ist es auch sinnvoll, die unterschiedlichen Reaktoren bei unterschiedlichen Temperaturen zu betreiben, z. B. die erste Stufe unter mesophilen Bedingungen und die nachgeordneten Stufen, insbesondere die Methanogenese, bei thermophilen Bedingungen. Geeignete Bedingungen hierfür sind aus dem Stand der Technik bekannt (z. B. DE 10 2005 012367 A1 ).
Sämtliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind nicht auf einstufige Verfahren zur Herstellung von Biogas beschränkt. Der Einsatz sämtlicher, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen kann auch in zwei- oder mehrstufigen Verfahren erfolgen. Ebenso können die nachfolgend beschriebenen Mikroorganismen in Verfahren zur Erzeugung von flüssigen Biokraftstoffen eingesetzt werden.
Es sei nochmals darauf hingewiesen, dass sämtliche, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen einzeln oder in beliebigen Kombinationen in allen, oben erläuterten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Die obigen Ausführungen beziehen sich also auf alle nachfolgenden Mikroorganismen.
Ruminobacillus
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse zur Verfügung. Der Biomasse wird ein Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zugesetzt.
Dem einschlägigen Fachmann ist bekannt, welche Stämme von Mikroorganismen unter den Begriff „Gattung Ruminobacillus” fallen. Im Zusammenhang mit der Behandlung von Biomasse und insbesondere im Zusammenhang mit der Verflüssigung von Biomasse bzw. der Herstellung von Biogas durch Fermentation organischer Substrate sind Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus bisher nicht bekannt.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren zur Behandlung von Biomasse um ein Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass durch die Zugabe von Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus zu einem Biomasse-Substrat die Viskosität des Substrats stark vermindert werden kann. Der Einsatz von Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus führt zu einer deutlich verstärkten Verflüssigung der Biomasse und in der Folge zu einer deutlichen Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Anlagen zur Herstellung von Biokraftstoffen.
Ebenfalls bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren zur Behandlung von Biomasse um ein Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass durch die Zugabe von Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus zum Gärsubstrat sowohl die Raumbelastung des Fermenters gesteigert werden kann als auch die Menge an gebildetem Biogas deutlich erhöht wird. Wie in experimentellen Untersuchungen gezeigt werden konnte, bewirkt die Zugabe eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus eine Steigerung der Raumbelastung eines Fermenters ohne dass eine Instabilität des Fermentationsprozesses eintreten würde. Parallel zu der erhöhten Raumbelastung wird die Menge an gebildetem Biogas deutlich erhöht. Zudem steigt die spezifische Ausbeute an Biogas an, da deutlich mehr der organischen Trockensubstanz abgebaut wird als bei fehlender Zugabe von Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus. Durch den erhöhten Abbaugrad kann eine deutlich erhöhte spezifische Gasausbeute bei einer verbesserten Substratausnutzung erzielt werden. Durch die Zugabe von Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus kann die Verweilzeit des Gärsubstrats im Fermenter bei konstanter Gasausbeute deutlich verkürzt werden, wodurch die Erhöhung der Raumbelastung möglich wird. Der Einsatz von Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus führt daher zu einer Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Biogasanlagen.
Das verwendete Biomasse-Substrat kann insbesondere einen hohen Anteil an festen Bestandteilen aufweisen. Durch die Zugabe zumindest eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus werden diese festen Bestandteile zumindest teilweise verflüssigt. Durch die erzielte Verflüssigung des Substrats kann einem Eindicken des Substrats vorgebeugt und gezielt entgegengewirkt werden. Ein weiterer Flüssigkeitseintrag in das Biomasse-Substrat in Form von Wasser während der Verflüssigung zur Aufrechterhaltung eines stabilen Prozesses kann vermieden werden. Somit besteht ein weiterer Vorteil in der Schonung der Ressource Süßwasser. Ebenfalls von Vorteil ist der so erzielte Erhalt der Rühr- und Pumpfähigkeit des Substrats. Dadurch werden Rührwerke und Pumpen geschont und für den Rührvorgang ist deutlich weniger Energie erforderlich.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus in Form einer Kultur von Mikroorganismen zugesetzt, die überwiegend aus einem Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus besteht. In Gärsubstraten von Biogasanlagen konnten Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus nur in Spuren von weniger als 10^–4% Anteil an der gesamten Anzahl von anwesenden Mikroorgansimen nachgewiesen werden. Da für die Zugabe der Mikroorganismen die Menge an aus ihrem natürlichen Vorkommen isolierten Mikroorganismen nicht ausreicht, wird üblicherweise eine Vermehrung in Form einer Kultur vorgenommen. In der Praxis zeigt sich, dass die Zugabe der Mikroorganismen zu dem Gärsubstrat eines Fermenters am einfachsten direkt in Form einer Kultur von Mikroorganismen vorgenommen wird.
Die Zugabe der Kultur von Ruminobacillus kann in Form einer Kultursuspension, in Form trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Zellpellets oder auch in Form von Sporensuspensionen, Sporenpräparaten oder trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Sporenpellets vorgenommen werden.
Da die bereits angesprochenen verschiedenen positiven Effekte auf den Gärprozess mit der Mikroorganismengattung Ruminobacillus verbunden sind, sollte diese Gattung von Mikroorganismen in der zugegebenen Kultur in einer das natürliche Vorkommen übersteigenden Konzentration anwesend sein. Es können auch Mischkulturen in beliebiger Zusammensetzung für die Zugabe verwendet werden. Voraussetzung ist jedoch, dass die Gattung Ruminobacillus in einer gegenüber dem natürlichen Vorkommen angereicherten Konzentration anwesend ist.
Für die Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen in Mischkulturen sind dem Fachmann verschiedene Methoden aus dem Stand der Technik bekannt. So kann beispielsweise mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten Oligosonden spezifisch der Anteil von Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus in einer Mischung identifiziert werden. Wird neben der Bestimmung der Anzahl an Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus auch die Gesamtzahl an Mikroorganismen bestimmt, so kann der Anteil an Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus in der Kultur in Prozent angegeben werden. Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus sind in einer Mischkultur dann die überwiegend anwesende Art von Mikroorganismen, wenn sie den höchsten prozentualen Anteil der verschiedenen in der Mischkultur anwesenden Arten von Mikroorganismen aufweisen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung macht der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der zu dem Gärsubstrat zugegebenen Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus, besonders bevorzugt zumindest 10^–2% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen und insbesondere bevorzugt mindestens 1% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen. Gemäß weiterer bevorzugter Ausführungsformen macht der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 10% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus, besonders bevorzugt zumindest 50% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen und insbesondere bevorzugt zumindest 90% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Reinkultur eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zugesetzt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus als Bestandteil zumindest einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen zugesetzt. Da für die Zugabe der Mikroorganismen die Menge an aus ihrem natürlichen Vorkommen isolierten Mikroorganismen nicht ausreicht, wird üblicherweise eine Vermehrung in Form einer Kultur vorgenommen. In der Praxis zeigte sich, dass die Zugabe der Mikroorganismen zu dem Gärsubstrat eines Fermenters am einfachsten in Form einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen vorgenommen wird.
Da die bereits angesprochenen verschiedenen positiven Effekte auf den Gärprozess mit Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus verbunden sind, sollte diese Art von Mikroorganismen in der zugegebenen immobilisierten Kultur in einer im Vergleich zum natürlichen Vorkommen angereicherten Konzentration anwesend sein. Es können auch immobilisierte Mischkulturen in beliebiger Zusammensetzung für die Zugabe verwendet werden. Voraussetzung ist jedoch, dass Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus in einer Menge enthalten sind, die deren natürliches Vorkommen übersteigt.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung macht der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der zu dem Gärsubstrat zugegebenen immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus, besonders bevorzugt zumindest 10^–2% der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen und insbesondere bevorzugt zumindest 1% der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Gemäß weiterer bevorzugter Ausführungsformen macht der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 10% der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus, besonders bevorzugt zumindest 50% der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen und insbesondere bevorzugt zumindest 90% der Gesamtzahl an in der immobilisierten Kultur vorhandenen Mikroorganismen.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird zumindest eine immobilisierte Reinkultur eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zugesetzt.
Sowohl die Bestimmung der Gesamtzahl von Mikroorganismen in dem Gärsubstrat als auch die Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen im Gärsubstrat stellt für den Fachmann kein Problem dar. So kann beispielsweise mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten Oligosonden spezifisch der Anteil verschiedener Mikroorganismen in dem Gärsubstrat identifiziert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zwischen 10^–8% und 50% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Insbesondere in Abhängigkeit von der Fermentergröße und damit in Abhängigkeit von der Menge an Gärsubstrat kann zur Erzielung der gewünschten Wirkung eine Zugabe von sehr stark unterschiedlichen Mengen an Mikroorganismen notwendig werden.
Besonders bevorzugt wird ein Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zwischen 10^–6% und 25% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Insbesondere bevorzugt wird der Mikroorganismus in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zwischen 10^–4% und 10% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Ganz besonders bevorzugt wird der Mikroorganismus in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zwischen 10^–3% und 1% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus um einen Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus beschäftigen, wird also besonders bevorzugt ein Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum zugegeben.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon CFB-21. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus beschäftigen, wird also besonders bevorzugt ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon CFB-21 zugegeben.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon 127. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus beschäftigen, wird also besonders bevorzugt ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon 127 zugegeben.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon B55_F_B_E09. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus beschäftigen, wird also besonders bevorzugt ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon B55_F_B_E09 zugegeben.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon G35_D8_H_B_A04. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus beschäftigen, wird also besonders bevorzugt ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon G35_D8_H_B_A04 zugegeben.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon M55_D15_L_B_H07. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus beschäftigen, wird also besonders bevorzugt ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon M55_D15_L_B_H07 zugegeben.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Kompostbakterium Klon 1B10. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus beschäftigen, wird also besonders bevorzugt ein Mikroorganismus des Stammes Kompostbakterium Klon 1B10 zugegeben.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Porphyromonadaceae sp. D148-4E. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus beschäftigen, wird also besonders bevorzugt ein Mikroorganismus des Stammes Porphyromonadaceae sp. D148-4E zugegeben.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zur Behandlung von Biomasse. Besonders bevorzugt wird ein Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum verwendet. Insbesondere bevorzugt wird ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon CFB-21 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon 127 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon B55_F_B_E09 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon G35_D8_H_B_A04 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon M55_D15_L_B_H07 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Kompostbakterium Klon 1B10 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Porphyromonadaceae sp. D148-4E verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Besonders bevorzugt wird ein Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum verwendet. Insbesondere bevorzugt wird ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon CFB-21 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon 127 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon B55_F_B_E09 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon G35_D8_H_B_A04 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon M55_D15_L_B_H07 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Kompostbakterium Klon 1B10 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Porphyromonadaceae sp. D148-4E verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zur Verflüssigung von Biomasse. Besonders bevorzugt wird ein Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum verwendet. Insbesondere bevorzugt wird ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon CFB-21 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon 127 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon B55_F_B_E09 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon G35_D8_H_B_A04 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon M55_D15_L_B_H07 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Kompostbakterium Klon 1B10 verwendet. Insbesondere bevorzugt wird auch ein Mikroorganismus des Stammes Porphyromonadaceae sp. D148-4E verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der durch eines der beschriebenen Verfahren erhaltenen verflüssigten Biomasse zur Herstellung von Biokraftstoff. Bevorzugt wird die durch eines der beschriebenen Verfahren erhaltene verflüssigte Biomasse zur Herstellung von Bioethanol eingesetzt.
Bakterien der Gattung Ruminobacillus können mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Methoden aus dem Gärsubstrat eines Fermenters isoliert werden. Dabei wird ein geeignetes Substrat aus einem Fermenter in ein Selektionsmedium eingebracht, über längere Zeit kultiviert und schließlich einzelne Kolonien von Mikroorganismen aus dem Selektionsmedium isoliert. Nach Vervielfältigung der daraus erhaltenen mikrobiellen RNA mittels PCR können auf der Basis der RNA Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus ausgewählt werden.
Nachdem die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 erfolgreich aus dem Gärsubstrat des Nachgärers isoliert worden waren, wurden diese Mikroorganismen einer Sequenzanalyse unterzogen. Die ermittelte 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 6 umfasst 1511 Nukleotide. Als nächster Verwandter wurde der Stamm Bakterium Klon CFB-21 identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass insgesamt 8 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Sequenz von Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 von 1511 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 1471 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des BLAST-Algorithmus eine Übereinstimmung von 99,46%.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,46% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,48% oder mehr als 99,50% oder mehr als 99,52% oder mehr als 99,54% oder mehr als 99,56% oder mehr als 99,58% oder mehr als 99,60% oder mehr als 99,65% oder mehr als 99,70% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,75% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,80% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,90% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 entspricht.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation” ist im Abschnitt „Definitionen” des vorliegenden Textes erläutert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 99,46% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,48% oder mehr als 99,50% oder mehr als 99,52% oder mehr als 99,54% oder mehr als 99,56% oder mehr als 99,58% oder mehr als 99,60% oder mehr als 99,65% oder mehr als 99,70% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,75% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,80% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,90% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 definiert wurde zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren.
Nachdem die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 erfolgreich aus dem Gärsubstrat des Nachgärers isoliert worden waren, wurden diese Mikroorganismen einer Sequenzanalyse unterzogen. Die ermittelte 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 4 umfasst 1487 Nukleotide. Als nächster Verwandter wurde der Stamm Bakterium Klon 127 identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass insgesamt 107 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Sequenz von Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 von 1487 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 1498 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des BLAST-Algorithmus eine Übereinstimmung von 92,80%.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 92,80% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 92,90% oder mehr als 93,00% oder mehr als 93,50% oder mehr als 94,00% oder mehr als 94,50% oder mehr als 95,00% oder mehr als 95,50% oder mehr als 96,00% oder mehr als 96,50% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 97,00% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 entspricht.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 an an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen oder an zehn Positionen oder an elf Positionen oder an zwölf Positionen oder an 13 Positionen oder an 14 Positionen oder an 15 Positionen oder an 16 Positionen oder an 17 Positionen oder an 18 Positionen oder an 19 Positionen oder an 20 Positionen oder an 21 Positionen oder an 22 Positionen oder an 23 Positionen oder an 24 Positionen oder an 25 Positionen oder an 26 Positionen oder an 27 Positionen oder an 28 Positionen oder an 29 Positionen oder an 30 Positionen oder an 31 Positionen oder an 32 Positionen oder an 33 Positionen oder an 34 Positionen oder an 35 Positionen oder an 36 Positionen oder an 37 Positionen oder an 38 Positionen oder an 39 Positionen oder an 40 Positionen oder an 41 Positionen oder an 42 Positionen oder an 43 Positionen oder an 44 Positionen oder an 45 Positionen oder an 46 Positionen oder an 47 Positionen oder an 48 Positionen oder an 49 Positionen oder an 50 Positionen oder an 55 Positionen oder an 60 Positionen oder an 65 Positionen oder an 70 Positionen oder an 80 Positionen oder an 90 Positionen oder an 100 Positionen oder an 105 Positionen oder an 107 Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation” ist im Abschnitt „Definitionen” des vorliegenden Textes erläutert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 92,80% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 92,90% oder mehr als 93,00% oder mehr als 93,50% oder mehr als 94,00% oder mehr als 94,50% oder mehr als 95,00% oder mehr als 95,50% oder mehr als 96,00% oder mehr als 96,50% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 97,00% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 definiert wurde zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren.
Nachdem die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 erfolgreich aus dem Gärsubstrat des Nachgärers isoliert worden waren, wurden diese Mikroorganismen einer Sequenzanalyse unterzogen. Die ermittelte 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst 905 Nukleotide. Als nächster Verwandter wurde der Stamm Bakterium Klon B55_F_B_E09 identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass insgesamt 9 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Sequenz von Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 von 905 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 905 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des BLAST-Algorithmus eine Übereinstimmung von 99,01%.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,02% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,04% oder mehr als 99,06% oder mehr als 99,08% oder mehr als 99,10% oder mehr als 99,15% oder mehr als 99,20% oder mehr als 99,25% oder mehr als 99,30% oder mehr als 99,35% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,40% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,6% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation” ist im Abschnitt „Definitionen” des vorliegenden Textes erläutert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 99,01% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,02% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,04% oder mehr als 99,06% oder mehr als 99,08% oder mehr als 99,10% oder mehr als 99,15% oder mehr als 99,20% oder mehr als 99,25% oder mehr als 99,30% oder mehr als 99,35% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,40% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,6% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 definiert wurde zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren.
Nachdem die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 erfolgreich aus dem Gärsubstrat des Nachgärers isoliert worden waren, wurden diese Mikroorganismen einer Sequenzanalyse unterzogen. Die ermittelte 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 3 umfasst 1494 Nukleotide. Als nächster Verwandter wurde der Stamm Bakterium Klon G35_D8_H_B_A04 identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass insgesamt 151 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Sequenz von Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 von 1494 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 1509 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des BLAST-Algorithmus eine Übereinstimmung von 89,89%.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 89,89% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 90,0% oder mehr als 90,1% oder mehr als 90,2% oder mehr als 90,4% oder mehr als 90,6% oder mehr als 90,8% oder mehr als 91,0% oder mehr als 92,0% oder mehr als 93,0% oder mehr als 94,0% oder mehr als 95,0% oder mehr als 96,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 97,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 entspricht.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen oder an zehn Positionen oder an elf Positionen oder an zwölf Positionen oder an 13 Positionen oder an 14 Positionen oder an 15 Positionen oder an 16 Positionen oder an 17 Positionen oder an 18 Positionen oder an 19 Positionen oder an 20 Positionen oder an 21 Positionen oder an 22 Positionen oder an 23 Positionen oder an 24 Positionen oder an 25 Positionen oder an 26 Positionen oder an 27 Positionen oder an 28 Positionen oder an 29 Positionen oder an 30 Positionen oder an 31 Positionen oder an 32 Positionen oder an 33 Positionen oder an 34 Positionen oder an 35 Positionen oder an 36 Positionen oder an 37 Positionen oder an 38 Positionen oder an 39 Positionen oder an 40 Positionen oder an 41 Positionen oder an 42 Positionen oder an 43 Positionen oder an 44 Positionen oder an 45 Positionen oder an 46 Positionen oder an 47 Positionen oder an 48 Positionen oder an 49 Positionen oder an 50 Positionen oder an 55 Positionen oder an 60 Positionen oder an 65 Positionen oder an 70 Positionen oder an 80 Positionen oder an 90 Positionen oder an 100 Positionen oder an 110 Positionen oder an 120 Positionen oder an 130 Positionen oder an 140 Positionen oder an 150 Positionen oder an 151 Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation” ist im Abschnitt „Definitionen” des vorliegenden Textes erläutert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 89,89% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 89,89% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 90,0% oder mehr als 90,1% oder mehr als 90,2% oder mehr als 90,4% oder mehr als 90,6% oder mehr als 90,8% oder mehr als 91,0% oder mehr als 92,0% oder mehr als 93,0% oder mehr als 94,0% oder mehr als 95,0% oder mehr als 96,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 97,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 definiert wurde zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren.
Nachdem die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 erfolgreich aus dem Gärsubstrat des Nachgärers isoliert worden waren, wurden diese Mikroorganismen einer Sequenzanalyse unterzogen. Die ermittelte 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 7 umfasst 1522 Nukleotide. Als nächster Verwandter wurde der Stamm Bakterium Klon M55_D15_L_B_H07 identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass insgesamt 54 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Sequenz von Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 von 1522 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 1419 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des BLAST-Algorithmus eine Übereinstimmung von 96,20%.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 96,20% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 96,30% oder mehr als 96,40% oder mehr als 96,50% oder mehr als 96,60% oder mehr als 96,80% oder mehr als 97,00% oder mehr als 97,3% oder mehr als 97,6% oder mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 98,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 entspricht.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen oder an zehn Positionen oder an elf Positionen oder an zwölf Positionen oder an 13 Positionen oder an 14 Positionen oder an 15 Positionen oder an 16 Positionen oder an 17 Positionen oder an 18 Positionen oder an 19 Positionen oder an 20 Positionen oder an 21 Positionen oder an 22 Positionen oder an 23 Positionen oder an 24 Positionen oder an 25 Positionen oder an 26 Positionen oder an 27 Positionen oder an 28 Positionen oder an 29 Positionen oder an 30 Positionen oder an 31 Positionen oder an 32 Positionen oder an 33 Positionen oder an 34 Positionen oder an 35 Positionen oder an 36 Positionen oder an 37 Positionen oder an 38 Positionen oder an 39 Positionen oder an 40 Positionen oder an 41 Positionen oder an 42 Positionen oder an 43 Positionen oder an 44 Positionen oder an 45 Positionen oder an 46 Positionen oder an 47 Positionen oder an 48 Positionen oder an 49 Positionen oder an 50 Positionen oder an 54 Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation” ist im Abschnitt „Definitionen” des vorliegenden Textes erläutert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 96,20% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 96,30% oder mehr als 96,40% oder mehr als 96,50% oder mehr als 96,60% oder mehr als 96,80% oder mehr als 97,00% oder mehr als 97,3% oder mehr als 97,6% oder mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 98,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 definiert wurde zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren.
Nachdem die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 erfolgreich aus dem Gärsubstrat des Nachgärers isoliert worden waren, wurden diese Mikroorganismen einer Sequenzanalyse unterzogen. Die ermittelte 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 5 umfasst 937 Nukleotide. Als nächster Verwandter wurde der Stamm Bakterium Klon CFB-21 identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass insgesamt 49 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Sequenz von Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 von 937 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 916 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des BLAST-Algorithmus eine Übereinstimmung von 94,65%.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 94,65% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 94,80% oder mehr als 94,90% oder mehr als 95,00% oder mehr als 95,20% oder mehr als 95,40% oder mehr als 95,60% oder mehr als 95,80% oder mehr als 96,0% oder mehr als 96,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 97,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 entspricht.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen oder an zehn Positionen oder an elf Positionen oder an zwölf Positionen oder an 13 Positionen oder an 14 Positionen oder an 15 Positionen oder an 16 Positionen oder an 17 Positionen oder an 18 Positionen oder an 19 Positionen oder an 20 Positionen oder an 21 Positionen oder an 22 Positionen oder an 23 Positionen oder an 24 Positionen oder an 25 Positionen oder an 26 Positionen oder an 27 Positionen oder an 28 Positionen oder an 29 Positionen oder an 30 Positionen oder an 31 Positionen oder an 32 Positionen oder an 33 Positionen oder an 34 Positionen oder an 35 Positionen oder an 36 Positionen oder an 37 Positionen oder an 38 Positionen oder an 39 Positionen oder an 40 Positionen oder an 41 Positionen oder an 42 Positionen oder an 43 Positionen oder an 44 Positionen oder an 45 Positionen oder an 46 Positionen oder an 47 Positionen oder an 48 Positionen oder an 49 Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation” ist im Abschnitt „Definitionen” des vorliegenden Textes erläutert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 94,65% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 94,80% oder mehr als 94,90% oder mehr als 95,00% oder mehr als 95,20% oder mehr als 95,40% oder mehr als 95,60% oder mehr als 95,80% oder mehr als 96,0% oder mehr als 96,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 97,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 definiert wurde zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren.
Nachdem die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 erfolgreich aus dem Gärsubstrat des Nachgärers isoliert worden waren, wurden diese Mikroorganismen einer Sequenzanalyse unterzogen. Die ermittelte 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst 823 Nukleotide. Als nächster Verwandter wurde der Stamm Kompostbakterium Klon 1B10 identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass insgesamt 33 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Sequenz von Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 von 823 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 827 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des BLAST-Algorithmus eine Übereinstimmung von 95,99%.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 95,99% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 96,00% oder mehr als 96,02% oder mehr als 96,04% oder mehr als 96,06% oder mehr als 96,08% oder mehr als 96,10% oder mehr als 96,15% oder mehr als 96,20% oder mehr als 96,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 97,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen oder an zehn Positionen oder an elf Positionen oder an zwölf Positionen oder an 13 Positionen oder an 14 Positionen oder an 15 Positionen oder an 16 Positionen oder an 17 Positionen oder an 18 Positionen oder an 19 Positionen oder an 20 Positionen oder an 21 Positionen oder an 22 Positionen oder an 23 Positionen oder an 24 Positionen oder an 25 Positionen oder an 26 Positionen oder an 27 Positionen oder an 28 Positionen oder an 29 Positionen oder an 30 Positionen oder an 31 Positionen oder an 32 Positionen oder an 33 Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation” ist im Abschnitt „Definitionen” des vorliegenden Textes erläutert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 95,99% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 96,00% oder mehr als 96,02% oder mehr als 96,04% oder mehr als 96,06% oder mehr als 96,08% oder mehr als 96,10% oder mehr als 96,15% oder mehr als 96,20% oder mehr als 96,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 97,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 definiert wurde zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren.
Nachdem die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 erfolgreich aus dem Gärsubstrat des Nachgärers isoliert worden waren, wurden diese Mikroorganismen einer Sequenzanalyse unterzogen. Die ermittelte 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 8 umfasst 1492 Nukleotide. Als nächster Verwandter wurde der Stamm Porphyromonadaceae sp. D14B-4E identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass insgesamt 21 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Sequenz von Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 von 1492 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 1453 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des BLAST-Algorithmus eine Übereinstimmung von 98,56%.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,56% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 98,58% oder mehr als 98,60% oder mehr als 98,62% oder mehr als 98,64% oder mehr als 98,66% oder mehr als 98,68% oder mehr als 98,70% oder mehr als 98,75% oder mehr als 98,80% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 98,90% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 entspricht.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen oder an zehn Positionen oder an elf Positionen oder an zwölf Positionen oder an 13 Positionen oder an 14 Positionen oder an 15 Positionen oder an 16 Positionen oder an 17 Positionen oder an 18 Positionen oder an 19 Positionen oder an 20 Positionen oder an 21 Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation” ist im Abschnitt „Definitionen” des vorliegenden Textes erläutert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der zumindest 98,56% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 98,58% oder mehr als 98,60% oder mehr als 98,62% oder mehr als 98,64% oder mehr als 98,66% oder mehr als 98,68% oder mehr als 98,70% oder mehr als 98,75% oder mehr als 98,80% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist und insbesondere bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 98,90% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse und/oder einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 entspricht.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 definiert wurde zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur Behandlung von Biomasse, insbesondere zur Verflüssigung von Biomasse und/oder zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Ruminobacillus xylanolyticum näher beschriebenen Verfahren.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen. Sofern nicht anders angegeben, wurden molekularbiologische Standardmethoden verwendet, wie z. B. von Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben.
Ruminobacillus xylanolyticum SBG356
DNA-Isolierung
Aus dem Fermenter einer Biogasanlage wurden Substrat-Proben entnommen und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Abtrennung von nicht verdautem Pflanzenmaterial durch Zentrifugation (30 s, 3000 rpm (Umdrehungern pro Minute) in einer Tischzentrifuge) wurde ein Zellpellet durch Zentrifugation (30 min, 13000 rpm in einer Tischzentrifuge) gewonnen. Die Zellen wurden resuspendiert in 1300 μl salinem Extraktionspuffer (0,1 mol l^–1 EDTA, 0,15 mol l^–1 NaCl, der 30–40 mg mit Säure gewaschenes PVPP enthielt) und anschließend dreimal eingefroren (–80°C) und aufgetaut (bei 56°C). Nach Lyse der Zellen (30 min Inkubation bei 37°C nach Zugabe von 20 μl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) wurden die Zellen nach Zugabe von Protease (20 μl einer 1% igen (w/v) ProteinaseK Lösung) und SDS (100 μl einer 10%igen Lösung) für 45 min bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde anschliessend mit einem Volumen Phenol, mit einem Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, (v/v/v)) und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Aus dem wässrigen Überstand wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen einer Natriumacetat-Lösung (3,0 M, pH 5,2) die DNA mit 0,8 Volumen Isopropanol 30 Min. bei –20°C gefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, zweimal mit 70%igen Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur an Luft getrocknet.
Nukleotidsequenzbestimmung
Zur Bestimmung der 16S rRNA Sequenz wurde aus der isolierten DNA über PCR das Gen für die 16S rRNA amplifiziert. Dafür wurden die Primer mit den Sequenzen GRGTTTGATCCTGGCTCAG und ACGGHTACCTTGTTACGACTT verwendet (angegeben in 5' → 3'Richtung; R bedeutet G oder C; H bedeutet C, T oder A). Die als PCR-Produkte erhaltenen DNA-Stücke wurden dann in einen Klonierungsvektor kloniert (Ligation mit dem QIAGEN PCR-Cloning-Kit der Firma QIAGEN/Hilden unter Verwendung des Vektors p-Drive), in E.coli transformiert (gemäß QIAGEN PCR-Cloning-Handbook) und mittels Colony-PCR untersucht. Die erhaltenen Colony-PCR-Produkte wurden einer Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen-Analyse (RFLP) zur Auswahl geeigneter Klone unterzogen. Aus den jeweiligen Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) sequenziert.
Sequenzanalyse
Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpaket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371) phylogenetisch analysiert werden. Anhand einer Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov konnte Bakterium Klon CFB-21 als nächster Verwandter ermittelt werden.
Isolierung und Anreicherung der Mikroorganismen
Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 wurden aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Dazu wurde durch ein flüssiges Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC (Carboxymethylcellulose) und 0,2% Hefeextrakt ohne weitere Kohlenstoffquelle) Stickstoff und Kohlendioxid (in einem Volumenverhältnis von 1:4) durchgeleitet, anschließend Na₂S zu dem Selektionsmedium zugegeben und autoklaviert (20 Min. bei 121°C). In das Selektionsmedium wurde eine Probe aus dem Überstand eines Nachgärers eingebracht und für mindestens eine Woche bei einer Temperatur von mindestes 30°C kultiviert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen bzw. durch Ausstreichen auf feste Nährmedien. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) konnten die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 angereichert werden.
Bestimmung der Zelldichte
Um die Zelldichte in Bezug auf lebende Bakterien zu bestimmen, wurden jeweils 10 μl Bakterienprobe (z. B. Vorkultur, Bakterienzuchtansatz, Überstand von Fermenterprobe) mit 2 μl BacLight^TM-Farbstoff (Invitrogen) vermischt und bei 1000 facher Vergrößerung mikroskopiert (AXIO Imager A1, Zeiss, Jena). Unter UV-Licht mit Nutzung zweier verschiedener Filter, kann mit dem BacLight^TM-System der Anteil lebender Zellen in der Probe bestimmt werden. Die Gesamtzellzahl wurde in einer Thomazählkammer ausgezählt.
Bestimmung des Zellanteils von Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 an einer Probe-„Fishing”
Der Anteil von Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 wurde durch „whole cell hybridization” nach der in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143-169) beschriebenen Methode bestimmt.
Verflüssigung von cellulosehaltigem Medium
Versuche mit einer Reinkultur des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums bis hin zu einer wasserähnlichen Konsistenz während des Bakterienwachstums führte, was durch Schütteln des Anzuchtkolbens und visuelle Inspektion deutlich beobachtet werden konnte.
Verflüssigung von Gärsubstrat
Die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren ist essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Gärsubstrates machte, wurde mit einem Test bestimmt, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wurde (Substratfließtest). Ausgangsmaterial für den Fließtest war Material aus einer Biogasanlage mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 8–12%. Jeweils 500 ml Material aus einem Fermenter wurde in 1 l Schott-Flaschen abgefüllt. Es wurden einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 (totautoklaviert) und einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 (lebend) in insgesamt ca. 1 ml Medium resuspendiert zugesetzt und die Schott-Flaschen für 3 bis 7 Tage bei 40°C inkubiert. Für die Kontrolle wurde 1 ml Medium zugegeben. Jeweils 1,3 g der Proben wurden an den Startpunkt der schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke pro 10 min) der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Es zeigte sich, dass die Viskosität des Fermenterinhalts durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 abnahm, während eine Zugabe von toten Zellen praktisch keinen Effekt hatte.
Verflüssigung von Biomasse
Während einer Verflüssigung von Biomasse in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur 40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf der Viskosität bestimmt (Viskosimeter von Anton Paar). Die Verflüssigung der Biomasse lief unter ansonsten identischen Bedingungen einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und jeweils unter mehrfacher Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG356. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 eine Verringerung der Viskosität des Substrats auf weniger als 2/3 des ursprünglichen Wertes bewirkte.
Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG356
Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z. B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG356, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Nährmedium inkubiert worden war.
Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5% höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wurde als ohne Zugabe von Mikroorganismen.
Es zeigte sich außerdem, dass die Raumbelastung während der Fermentation deutlich gesteigert werden konnte, mindestens jedoch auf einen Wert von 5 kg oTS/m³d, wenn Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 zugesetzt wurden. Insbesondere beeinflusste die erhöhte Raumbelastung die Stabilität des Fermentationsprozesses nicht negativ, was z. B. anhand der Produktion von Fettsäuren kontrolliert wurde.
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem erfindungsgemäßen Anteil an Ruminobacillus xylanolyticum SBG356 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden.
Ruminobacillus xylanolyticum SBG357
DNA-Isolierung
Aus dem Fermenter einer Biogasanlage wurden Substrat-Proben entnommen und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Abtrennung von nicht verdautem Pflanzenmaterial durch Zentrifugation (30 s, 3000 rpm (Umdrehungern pro Minute) in einer Tischzentrifuge) wurde ein Zellpellet durch Zentrifugation (30 min, 13000 rpm in einer Tischzentrifuge) gewonnen. Die Zellen wurden resuspendiert in 1300 μl salinem Extraktionspuffer (0,1 mol l^–1 EDTA, 0,15 mol l^–1 NaCl, der 30–40 mg mit Säure gewaschenes PVPP enthielt) und anschließend dreimal eingefroren (–80°C) und aufgetaut (bei 56°C). Nach Lyse der Zellen (30 min Inkubation bei 37°C nach Zugabe von 20 μl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) wurden die Zellen nach Zugabe von Protease (20 μl einer 1% igen (w/v) ProteinaseK Lösung) und SDS (100 μl einer 10%igen Lösung) für 45 min bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde anschliessend mit einem Volumen Phenol, mit einem Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, (v/v/v)) und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Aus dem wässrigen Überstand wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen einer Natriumacetat-Lösung (3,0 M, pH 5,2) die DNA mit 0,8 Volumen Isopropanol 30 Min. bei –20°C gefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, zweimal mit 70%igen Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur an Luft getrocknet.
Nukleotidsequenzbestimmung
Zur Bestimmung der 16S rRNA Sequenz wurde aus der isolierten DNA über PCR das Gen für die 16S rRNA amplifiziert. Dafür wurden die Primer mit den Sequenzen GRGTTTGATCCTGGCTCAG und ACGGHTACCTTGTTACGACTT verwendet (angegeben in 5' → 3'Richtung; R bedeutet G oder C; H bedeutet C, T oder A). Die als PCR-Produkte erhaltenen DNA-Stücke wurden dann in einen Klonierungsvektor kloniert (Ligation mit dem QIAGEN PCR-Cloning-Kit der Firma QIAGEN/Hilden unter Verwendung des Vektors p-Drive), in E.coli transformiert (gemäß QIAGEN PCR-Cloning-Handbook) und mittels Colony-PCR untersucht. Die erhaltenen Colony-PCR-Produkte wurden einer Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen-Analyse (RFLP) zur Auswahl geeigneter Klone unterzogen. Aus den jeweiligen Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) sequenziert.
Sequenzanalyse
Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpaket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371) phylogenetisch analysiert werden. Anhand einer Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov konnte Bakterium Klon 127 als nächster Verwandter ermittelt werden.
Isolierung und Anreicherung der Mikroorganismen
Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 wurden aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Dazu wurde durch ein flüssiges Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC (Carboxymethylcellulose) und 0,2% Hefeextrakt ohne weitere Kohlenstoffquelle) Stickstoff und Kohlendioxid (in einem Volumenverhältnis von 1:4) durchgeleitet, anschließend Na₂S zu dem Selektionsmedium zugegeben und autoklaviert (20 Min. bei 121°C). In das Selektionsmedium wurde eine Probe aus dem Überstand eines Nachgärers eingebracht und für mindestens eine Woche bei einer Temperatur von mindestes 30°C kultiviert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen bzw. durch Ausstreichen auf feste Nährmedien. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) konnten die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 angereichert werden.
Bestimmung der Zelldichte
Um die Zelldichte in Bezug auf lebende Bakterien zu bestimmen, wurden jeweils 10 μl Bakterienprobe (z. B. Vorkultur, Bakterienzuchtansatz, Überstand von Fermenterprobe) mit 2 μl BacLight^TM-Farbstoff (Invitrogen) vermischt und bei 1000 facher Vergrößerung mikroskopiert (AXIO Imager A1, Zeiss, Jena). Unter UV-Licht mit Nutzung zweier verschiedener Filter, kann mit dem BacLight^TM-System der Anteil lebender Zellen in der Probe bestimmt werden. Die Gesamtzellzahl wurde in einer Thomazählkammer ausgezählt.
Bestimmung des Zellanteils von Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 an einer Probe-„Fishing”
Der Anteil von Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 wurde durch „whole cell hybridization” nach der in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143-169) beschriebenen Methode bestimmt.
Verflüssigung von cellulosehaltigem Medium
Versuche mit einer Reinkultur des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums bis hin zu einer wasserähnlichen Konsistenz während des Bakterienwachstums führte, was durch Schütteln des Anzuchtkolbens und visuelle Inspektion deutlich beobachtet werden konnte.
Verflüssigung von Gärsubstrat
Die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren ist essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Gärsubstrates machte, wurde mit einem Test bestimmt, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wurde (Substratfließtest). Ausgangsmaterial für den Fließtest war Material aus einer Biogasanlage mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 8–12%. Jeweils 500 ml Material aus einem Fermenter wurde in 1 l Schott-Flaschen abgefüllt. Es wurden einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 (totautoklaviert) und einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 (lebend) in insgesamt ca. 1 ml Medium resuspendiert zugesetzt und die Schott-Flaschen für 3 bis 7 Tage bei 40°C inkubiert. Für die Kontrolle wurde 1 ml Medium zugegeben. Jeweils 1,3 g der Proben wurden an den Startpunkt der schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke pro 10 min) der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Es zeigte sich, dass die Viskosität des Fermenterinhalts durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 abnahm, während eine Zugabe von toten Zellen praktisch keinen Effekt hatte.
Verflüssigung von Biomasse
Während einer Verflüssigung von Biomasse in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur 40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf der Viskosität bestimmt (Viskosimeter von Anton Paar). Die Verflüssigung der Biomasse lief unter ansonsten identischen Bedingungen einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und jeweils unter mehrfacher Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG357. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 eine Verringerung der Viskosität des Substrats auf weniger als 2/3 des ursprünglichen Wertes bewirkte.
Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG357
Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z. B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG357, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Nährmedium inkubiert worden war.
Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5% höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wurde als ohne Zugabe von Mikroorganismen.
Es zeigte sich außerdem, dass die Raumbelastung während der Fermentation deutlich gesteigert werden konnte, mindestens jedoch auf einen Wert von 5 kg oTS/m³d, wenn Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 zugesetzt wurden. Insbesondere beeinflusste die erhöhte Raumbelastung die Stabilität des Fermentationsprozesses nicht negativ, was z. B. anhand der Produktion von Fettsäuren kontrolliert wurde.
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem erfindungsgemäßen Anteil an Ruminobacillus xylanolyticum SBG357 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden.
Ruminobacillus xylanolyticum SBG358
DNA-Isolierung
Aus dem Fermenter einer Biogasanlage wurden Substrat-Proben entnommen und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Abtrennung von nicht verdautem Pflanzenmaterial durch Zentrifugation (30 s, 3000 rpm (Umdrehungern pro Minute) in einer Tischzentrifuge) wurde ein Zellpellet durch Zentrifugation (30 min, 13000 rpm in einer Tischzentrifuge) gewonnen. Die Zellen wurden resuspendiert in 1300 μl salinem Extraktionspuffer (0,1 mol l^–1 EDTA, 0,15 mol l^–1 NaCl, der 30–40 mg mit Säure gewaschenes PVPP enthielt) und anschließend dreimal eingefroren (–80°C) und aufgetaut (bei 56°C). Nach Lyse der Zellen (30 min Inkubation bei 37°C nach Zugabe von 20 μl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) wurden die Zellen nach Zugabe von Protease (20 μl einer 1%igen (w/v) ProteinaseK Lösung) und SDS (100 μl einer 10%igen Lösung) für 45 min bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde anschliessend mit einem Volumen Phenol, mit einem Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, (v/v/v)) und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Aus dem wässrigen Überstand wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen einer Natriumacetat-Lösung (3,0 M, pH 5,2) die DNA mit 0,8 Volumen Isopropanol 30 Min. bei –20°C gefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, zweimal mit 70%igen Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur an Luft getrocknet.
Nukleotidsequenzbestimmung
Zur Bestimmung der 16S rRNA Sequenz wurde aus der isolierten DNA über PCR das Gen für die 16S rRNA amplifiziert. Dafür wurden die Primer mit den Sequenzen GRGTTTGATCCTGGCTCAG und ACGGHTACCTTGTTACGACTT verwendet (angegeben in 5' → 3'Richtung; R bedeutet G oder C; H bedeutet C, T oder A). Die als PCR-Produkte erhaltenen DNA-Stücke wurden dann in einen Klonierungsvektor kloniert (Ligation mit dem QIAGEN PCR-Cloning-Kit der Firma QIAGEN/Hilden unter Verwendung des Vektors p-Drive), in E.coli transformiert (gemäß QIAGEN PCR-Cloning-Handbook) und mittels Colony-PCR untersucht. Die erhaltenen Colony-PCR-Produkte wurden einer Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen-Analyse (RFLP) zur Auswahl geeigneter Klone unterzogen. Aus den jeweiligen Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) sequenziert.
Sequenzanalyse
Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpaket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371) phylogenetisch analysiert werden. Anhand einer Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov konnte Bakterium Klon B55_F_B_E09 als nächster Verwandter ermittelt werden.
Isolierung und Anreicherung der Mikroorganismen
Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 wurden aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Dazu wurde durch ein flüssiges Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC (Carboxymethylcellulose) und 0,2% Hefeextrakt ohne weitere Kohlenstoffquelle) Stickstoff und Kohlendioxid (in einem Volumenverhältnis von 1:4) durchgeleitet, anschließend Na₂S zu dem Selektionsmedium zugegeben und autoklaviert (20 Min. bei 121°C). In das Selektionsmedium wurde eine Probe aus dem Überstand eines Nachgärers eingebracht und für mindestens eine Woche bei einer Temperatur von mindestes 30°C kultiviert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen bzw. durch Ausstreichen auf feste Nährmedien. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) konnten die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 angereichert werden.
Bestimmung der Zelldichte
Um die Zelldichte in Bezug auf lebende Bakterien zu bestimmen, wurden jeweils 10 μl Bakterienprobe (z. B. Vorkultur, Bakterienzuchtansatz, Überstand von Fermenterprobe) mit 2 μl BacLight^TM-Farbstoff (Invitrogen) vermischt und bei 1000 facher Vergrößerung mikroskopiert (AXIO Imager A1, Zeiss, Jena). Unter UV-Licht mit Nutzung zweier verschiedener Filter, kann mit dem BacLight^TM-System der Anteil lebender Zellen in der Probe bestimmt werden. Die Gesamtzellzahl wurde in einer Thomazählkammer ausgezählt.
Bestimmung des Zellanteils von Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 an einer Probe-„Fishing”
Der Anteil von Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 wurde durch „whole cell hybridization” nach der in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143-169) beschriebenen Methode bestimmt.
Verflüssigung von cellulosehaltigem Medium
Versuche mit einer Reinkultur des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums bis hin zu einer wasserähnlichen Konsistenz während des Bakterienwachstums führte, was durch Schütteln des Anzuchtkolbens und visuelle Inspektion deutlich beobachtet werden konnte.
Verflüssigung von Gärsubstrat
Die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren ist essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Gärsubstrates machte, wurde mit einem Test bestimmt, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wurde (Substratfließtest). Ausgangsmaterial für den Fließtest war Material aus einer Biogasanlage mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 8–12%. Jeweils 500 ml Material aus einem Fermenter wurde in 1 l Schott-Flaschen abgefüllt. Es wurden einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 (totautoklaviert) und einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 (lebend) in insgesamt ca. 1 ml Medium resuspendiert zugesetzt und die Schott-Flaschen für 3 bis 7 Tage bei 40°C inkubiert. Für die Kontrolle wurde 1 ml Medium zugegeben. Jeweils 1,3 g der Proben wurden an den Startpunkt der schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke pro 10 min) der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Es zeigte sich, dass die Viskosität des Fermenterinhalts durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 abnahm, während eine Zugabe von toten Zellen praktisch keinen Effekt hatte.
Verflüssigung von Biomasse
Während einer Verflüssigung von Biomasse in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur 40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf der Viskosität bestimmt (Viskosimeter von Anton Paar). Die Verflüssigung der Biomasse lief unter ansonsten identischen Bedingungen einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und jeweils unter mehrfacher Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG358. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 eine Verringerung der Viskosität des Substrats auf weniger als 2/3 des ursprünglichen Wertes bewirkte.
Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG358
Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z. B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG358, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Nährmedium inkubiert worden war.
Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5% höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wurde als ohne Zugabe von Mikroorganismen.
Es zeigte sich außerdem, dass die Raumbelastung während der Fermentation deutlich gesteigert werden konnte, mindestens jedoch auf einen Wert von 5 kg oTS/m³d, wenn Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 zugesetzt wurden. Insbesondere beeinflusste die erhöhte Raumbelastung die Stabilität des Fermentationsprozesses nicht negativ, was z. B. anhand der Produktion von Fettsäuren kontrolliert wurde.
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem erfindungsgemäßen Anteil an Ruminobacillus xylanolyticum SBG358 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden.
Ruminobacillus xylanolyticum SBG359
DNA-Isolierung
Aus dem Fermenter einer Biogasanlage wurden Substrat-Proben entnommen und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Abtrennung von nicht verdautem Pflanzenmaterial durch Zentrifugation (30 s, 3000 rpm (Umdrehungern pro Minute) in einer Tischzentrifuge) wurde ein Zellpellet durch Zentrifugation (30 min, 13000 rpm in einer Tischzentrifuge) gewonnen. Die Zellen wurden resuspendiert in 1300 μl salinem Extraktionspuffer (0,1 mol l^–1 EDTA, 0,15 mol l^–1 NaCl, der 30–40 mg mit Säure gewaschenes PVPP enthielt) und anschließend dreimal eingefroren (–80°C) und aufgetaut (bei 56°C). Nach Lyse der Zellen (30 min Inkubation bei 37°C nach Zugabe von 20 μl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) wurden die Zellen nach Zugabe von Protease (20 μl einer 1%igen (w/v) ProteinaseK Lösung) und SDS (100 μl einer 10%igen Lösung) für 45 min bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde anschliessend mit einem Volumen Phenol, mit einem Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, (v/v/v)) und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Aus dem wässrigen Überstand wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen einer Natriumacetat-Lösung (3,0 M, pH 5,2) die DNA mit 0,8 Volumen Isopropanol 30 Min. bei –20°C gefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, zweimal mit 70%igen Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur an Luft getrocknet.
Nukleotidsequenzbestimmung
Zur Bestimmung der 16S rRNA Sequenz wurde aus der isolierten DNA über PCR das Gen für die 16S rRNA amplifiziert. Dafür wurden die Primer mit den Sequenzen GRGTTTGATCCTGGCTCAG und ACGGHTACCTTGTTACGACTT verwendet (angegeben in 5' → 3'Richtung; R bedeutet G oder C; H bedeutet C, T oder A). Die als PCR-Produkte erhaltenen DNA-Stücke wurden dann in einen Klonierungsvektor kloniert (Ligation mit dem QIAGEN PCR-Cloning-Kit der Firma QIAGEN/Hilden unter Verwendung des Vektors p-Drive), in E.coli transformiert (gemäß QIAGEN PCR-Cloning-Handbook) und mittels Colony-PCR untersucht. Die erhaltenen Colony-PCR-Produkte wurden einer Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen-Analyse (RFLP) zur Auswahl geeigneter Klone unterzogen. Aus den jeweiligen Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) sequenziert.
Sequenzanalyse
Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpaket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371) phylogenetisch analysiert werden. Anhand einer Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov konnte Bakterium Klon G35_D8_H_B_A04 als nächster Verwandter ermittelt werden.
Isolierung und Anreicherung der Mikroorganismen
Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 wurden aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Dazu wurde durch ein flüssiges Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC (Carboxymethylcellulose) und 0,2% Hefeextrakt ohne weitere Kohlenstoffquelle) Stickstoff und Kohlendioxid (in einem Volumenverhältnis von 1:4) durchgeleitet, anschließend Na₂S zu dem Selektionsmedium zugegeben und autoklaviert (20 Min. bei 121°C). In das Selektionsmedium wurde eine Probe aus dem Überstand eines Nachgärers eingebracht und für mindestens eine Woche bei einer Temperatur von mindestes 30°C kultiviert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen bzw. durch Ausstreichen auf feste Nährmedien. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) konnten die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 angereichert werden.
Bestimmung der Zelldichte
Um die Zelldichte in Bezug auf lebende Bakterien zu bestimmen, wurden jeweils 10 μl Bakterienprobe (z. B. Vorkultur, Bakterienzuchtansatz, Überstand von Fermenterprobe) mit 2 μl BacLight^TM-Farbstoff (Invitrogen) vermischt und bei 1000 facher Vergrößerung mikroskopiert (AXIO Imager A1, Zeiss, Jena). Unter UV-Licht mit Nutzung zweier verschiedener Filter, kann mit dem BacLight^TM-System der Anteil lebender Zellen in der Probe bestimmt werden. Die Gesamtzellzahl wurde in einer Thomazählkammer ausgezählt.
Bestimmung des Zellanteils von Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 an einer Probe-„Fishing”
Der Anteil von Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 wurde durch „whole cell hybridization” nach der in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143-169) beschriebenen Methode bestimmt.
Verflüssigung von cellulosehaltigem Medium
Versuche mit einer Reinkultur des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums bis hin zu einer wasserähnlichen Konsistenz während des Bakterienwachstums führte, was durch Schütteln des Anzuchtkolbens und visuelle Inspektion deutlich beobachtet werden konnte.
Verflüssigung von Gärsubstrat
Die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren ist essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Gärsubstrates machte, wurde mit einem Test bestimmt, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wurde (Substratfließtest). Ausgangsmaterial für den Fließtest war Material aus einer Biogasanlage mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 8–12%. Jeweils 500 ml Material aus einem Fermenter wurde in 1 l Schott-Flaschen abgefüllt. Es wurden einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 (totautoklaviert) und einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 (lebend) in insgesamt ca. 1 ml Medium resuspendiert zugesetzt und die Schott-Flaschen für 3 bis 7 Tage bei 40°C inkubiert. Für die Kontrolle wurde 1 ml Medium zugegeben. Jeweils 1,3 g der Proben wurden an den Startpunkt der schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke pro 10 min) der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Es zeigte sich, dass die Viskosität des Fermenterinhalts durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 abnahm, während eine Zugabe von toten Zellen praktisch keinen Effekt hatte.
Verflüssigung von Biomasse
Während einer Verflüssigung von Biomasse in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur 40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf der Viskosität bestimmt (Viskosimeter von Anton Paar). Die Verflüssigung der Biomasse lief unter ansonsten identischen Bedingungen einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und jeweils unter mehrfacher Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG359. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 eine Verringerung der Viskosität des Substrats auf weniger als 2/3 des ursprünglichen Wertes bewirkte.
Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG359
Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z. B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG359, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Nährmedium inkubiert worden war.
Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5% höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wurde als ohne Zugabe von Mikroorganismen.
Es zeigte sich außerdem, dass die Raumbelastung während der Fermentation deutlich gesteigert werden konnte, mindestens jedoch auf einen Wert von 5 kg oTS/m³d, wenn Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 zugesetzt wurden. Insbesondere beeinflusste die erhöhte Raumbelastung die Stabilität des Fermentationsprozesses nicht negativ, was z. B. anhand der Produktion von Fettsäuren kontrolliert wurde.
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem erfindungsgemäßen Anteil an Ruminobacillus xylanolyticum SBG359 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden.
Ruminobacillus xylanolyticum SBG360
DNA-Isolierung
Aus dem Fermenter einer Biogasanlage wurden Substrat-Proben entnommen und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Abtrennung von nicht verdautem Pflanzenmaterial durch Zentrifugation (30 s, 3000 rpm (Umdrehungern pro Minute) in einer Tischzentrifuge) wurde ein Zellpellet durch Zentrifugation (30 min, 13000 rpm in einer Tischzentrifuge) gewonnen. Die Zellen wurden resuspendiert in 1300 μl salinem Extraktionspuffer (0,1 mol l^–1 EDTA, 0,15 mol l^–1 NaCl, der 30–40 mg mit Säure gewaschenes PVPP enthielt) und anschließend dreimal eingefroren (–80°C) und aufgetaut (bei 56°C). Nach Lyse der Zellen (30 min Inkubation bei 37°C nach Zugabe von 20 μl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) wurden die Zellen nach Zugabe von Protease (20 μl einer 1%igen (w/v) ProteinaseK Lösung) und SDS (100 μl einer 10%igen Lösung) für 45 min bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde anschliessend mit einem Volumen Phenol, mit einem Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, (v/v/v)) und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Aus dem wässrigen Überstand wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen einer Natriumacetat-Lösung (3,0 M, pH 5,2) die DNA mit 0,8 Volumen Isopropanol 30 Min. bei –20°C gefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, zweimal mit 70%igen Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur an Luft getrocknet.
Nukleotidsequenzbestimmung
Zur Bestimmung der 16S rRNA Sequenz wurde aus der isolierten DNA über PCR das Gen für die 16S rRNA amplifiziert. Dafür wurden die Primer mit den Sequenzen GRGTTTGATCCTGGCTCAG und ACGGHTACCTTGTTACGACTT verwendet (angegeben in 5' → 3'Richtung; R bedeutet G oder C; H bedeutet C, T oder A). Die als PCR-Produkte erhaltenen DNA-Stücke wurden dann in einen Klonierungsvektor kloniert (Ligation mit dem QIAGEN PCR-Cloning-Kit der Firma QIAGEN/Hilden unter Verwendung des Vektors p-Drive), in E.coli transformiert (gemäß QIAGEN PCR-Cloning-Handbook) und mittels Colony-PCR untersucht. Die erhaltenen Colony-PCR-Produkte wurden einer Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen-Analyse (RFLP) zur Auswahl geeigneter Klone unterzogen. Aus den jeweiligen Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) sequenziert.
Sequenzanalyse
Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpaket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371) phylogenetisch analysiert werden. Anhand einer Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov konnte Bakterium Klon M55_D15_L_B_H07 als nächster Verwandter ermittelt werden.
Isolierung und Anreicherung der Mikroorganismen
Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 wurden aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Dazu wurde durch ein flüssiges Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC (Carboxymethylcellulose) und 0,2% Hefeextrakt ohne weitere Kohlenstoffquelle) Stickstoff und Kohlendioxid (in einem Volumenverhältnis von 1:4) durchgeleitet, anschließend Na₂S zu dem Selektionsmedium zugegeben und autoklaviert (20 Min. bei 121°C). In das Selektionsmedium wurde eine Probe aus dem Überstand eines Nachgärers eingebracht und für mindestens eine Woche bei einer Temperatur von mindestes 30°C kultiviert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen bzw. durch Ausstreichen auf feste Nährmedien. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) konnten die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 angereichert werden.
Bestimmung der Zelldichte
Um die Zelldichte in Bezug auf lebende Bakterien zu bestimmen, wurden jeweils 10 μl Bakterienprobe (z. B. Vorkultur, Bakterienzuchtansatz, Überstand von Fermenterprobe) mit 2 μl BacLight^TM-Farbstoff (Invitrogen) vermischt und bei 1000 facher Vergrößerung mikroskopiert (AXIO Imager A1, Zeiss, Jena). Unter UV-Licht mit Nutzung zweier verschiedener Filter, kann mit dem BacLight^TM-System der Anteil lebender Zellen in der Probe bestimmt werden. Die Gesamtzellzahl wurde in einer Thomazählkammer ausgezählt.
Bestimmung des Zellanteils von Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 an einer Probe-„Fishing”
Der Anteil von Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 wurde durch „whole cell hybridization” nach der in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143-169) beschriebenen Methode bestimmt.
Verflüssigung von cellulosehaltigem Medium
Versuche mit einer Reinkultur des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums bis hin zu einer wasserähnlichen Konsistenz während des Bakterienwachstums führte, was durch Schütteln des Anzuchtkolbens und visuelle Inspektion deutlich beobachtet werden konnte.
Verflüssigung von Gärsubstrat
Die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren ist essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Gärsubstrates machte, wurde mit einem Test bestimmt, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wurde (Substratfließtest). Ausgangsmaterial für den Fließtest war Material aus einer Biogasanlage mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 8–12%. Jeweils 500 ml Material aus einem Fermenter wurde in 1 l Schott-Flaschen abgefüllt. Es wurden einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 (totautoklaviert) und einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 (lebend) in insgesamt ca. 1 ml Medium resuspendiert zugesetzt und die Schott-Flaschen für 3 bis 7 Tage bei 40°C inkubiert. Für die Kontrolle wurde 1 ml Medium zugegeben. Jeweils 1,3 g der Proben wurden an den Startpunkt der schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke pro 10 min) der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Es zeigte sich, dass die Viskosität des Fermenterinhalts durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 abnahm, während eine Zugabe von toten Zellen praktisch keinen Effekt hatte.
Verflüssigung von Biomasse
Während einer Verflüssigung von Biomasse in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur 40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf der Viskosität bestimmt (Viskosimeter von Anton Paar). Die Verflüssigung der Biomasse lief unter ansonsten identischen Bedingungen einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und jeweils unter mehrfacher Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG360. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 eine Verringerung der Viskosität des Substrats auf weniger als 2/3 des ursprünglichen Wertes bewirkte.
Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG360
sWährend eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z. B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG360, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Nährmedium inkubiert worden war.
Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5% höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wurde als ohne Zugabe von Mikroorganismen.
Es zeigte sich außerdem, dass die Raumbelastung während der Fermentation deutlich gesteigert werden konnte, mindestens jedoch auf einen Wert von 5 kg oTS/m³d, wenn Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 zugesetzt wurden. Insbesondere beeinflusste die erhöhte Raumbelastung die Stabilität des Fermentationsprozesses nicht negativ, was z. B. anhand der Produktion von Fettsäuren kontrolliert wurde.
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem erfindungsgemäßen Anteil an Ruminobacillus xylanolyticum SBG360 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden.
Ruminobacillus xylanolyticum SBG361
DNA-Isolierung
Aus dem Fermenter einer Biogasanlage wurden Substrat-Proben entnommen und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Abtrennung von nicht verdautem Pflanzenmaterial durch Zentrifugation (30 s, 3000 rpm (Umdrehungern pro Minute) in einer Tischzentrifuge) wurde ein Zellpellet durch Zentrifugation (30 min, 13000 rpm in einer Tischzentrifuge) gewonnen. Die Zellen wurden resuspendiert in 1300 μl salinem Extraktionspuffer (0,1 mol l^–1 EDTA, 0,15 mol l^–1 NaCl, der 30–40 mg mit Säure gewaschenes PVPP enthielt) und anschließend dreimal eingefroren (–80°C) und aufgetaut (bei 56°C). Nach Lyse der Zellen (30 min Inkubation bei 37°C nach Zugabe von 20 μl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) wurden die Zellen nach Zugabe von Protease (20 μl einer 1%igen (w/v) ProteinaseK Lösung) und SDS (100 μl einer 10%igen Lösung) für 45 min bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde anschliessend mit einem Volumen Phenol, mit einem Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, (v/v/v)) und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Aus dem wässrigen Überstand wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen einer Natriumacetat-Lösung (3,0 M, pH 5,2) die DNA mit 0,8 Volumen Isopropanol 30 Min. bei –20°C gefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, zweimal mit 70%igen Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur an Luft getrocknet.
Nukleotidsequenzbestimmung
Zur Bestimmung der 16S rRNA Sequenz wurde aus der isolierten DNA über PCR das Gen für die 16S rRNA amplifiziert. Dafür wurden die Primer mit den Sequenzen GRGTTTGATCCTGGCTCAG und ACGGHTACCTTGTTACGACTT verwendet (angegeben in 5' → 3'Richtung; R bedeutet G oder C; H bedeutet C, T oder A). Die als PCR-Produkte erhaltenen DNA-Stücke wurden dann in einen Klonierungsvektor kloniert (Ligation mit dem QIAGEN PCR-Cloning-Kit der Firma QIAGEN/Hilden unter Verwendung des Vektors p-Drive), in E.coli transformiert (gemäß QIAGEN PCR-Cloning-Handbook) und mittels Colony-PCR untersucht. Die erhaltenen Colony-PCR-Produkte wurden einer Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen-Analyse (RFLP) zur Auswahl geeigneter Klone unterzogen. Aus den jeweiligen Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) sequenziert.
Sequenzanalyse
Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpaket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371) phylogenetisch analysiert werden. Anhand einer Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov konnte Bakterium Klon CFB-21 als nächster Verwandter ermittelt werden.
Isolierung und Anreicherung der Mikroorganismen
Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 wurden aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Dazu wurde durch ein flüssiges Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC (Carboxymethylcellulose) und 0,2% Hefeextrakt ohne weitere Kohlenstoffquelle) Stickstoff und Kohlendioxid (in einem Volumenverhältnis von 1:4) durchgeleitet, anschließend Na₂S zu dem Selektionsmedium zugegeben und autoklaviert (20 Min. bei 121°C). In das Selektionsmedium wurde eine Probe aus dem Überstand eines Nachgärers eingebracht und für mindestens eine Woche bei einer Temperatur von mindestes 30°C kultiviert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen bzw. durch Ausstreichen auf feste Nährmedien. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) konnten die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 angereichert werden.
Bestimmung der Zelldichte
Um die Zelldichte in Bezug auf lebende Bakterien zu bestimmen, wurden jeweils 10 μl Bakterienprobe (z. B. Vorkultur, Bakterienzuchtansatz, Überstand von Fermenterprobe) mit 2 μl BacLight^TM-Farbstoff (Invitrogen) vermischt und bei 1000 facher Vergrößerung mikroskopiert (AXIO Imager A1, Zeiss, Jena). Unter UV-Licht mit Nutzung zweier verschiedener Filter, kann mit dem BacLight^TM-System der Anteil lebender Zellen in der Probe bestimmt werden. Die Gesamtzellzahl wurde in einer Thomazählkammer ausgezählt.
Bestimmung des Zellanteils von Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 an einer Probe-„Fishing”
Der Anteil von Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 wurde durch „whole cell hybridization” nach der in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143-169) beschriebenen Methode bestimmt.
Verflüssigung von cellulosehaltigem Medium
Versuche mit einer Reinkultur des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums bis hin zu einer wasserähnlichen Konsistenz während des Bakterienwachstums führte, was durch Schütteln des Anzuchtkolbens und visuelle Inspektion deutlich beobachtet werden konnte.
Verflüssigung von Gärsubstrat
Die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren ist essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Gärsubstrates machte, wurde mit einem Test bestimmt, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wurde (Substratfließtest). Ausgangsmaterial für den Fließtest war Material aus einer Biogasanlage mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 8–12%. Jeweils 500 ml Material aus einem Fermenter wurde in 1 l Schott-Flaschen abgefüllt. Es wurden einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 (totautoklaviert) und einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 (lebend) in insgesamt ca. 1 ml Medium resuspendiert zugesetzt und die Schott-Flaschen für 3 bis 7 Tage bei 40°C inkubiert. Für die Kontrolle wurde 1 ml Medium zugegeben. Jeweils 1,3 g der Proben wurden an den Startpunkt der schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke pro 10 min) der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Es zeigte sich, dass die Viskosität des Fermenterinhalts durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 abnahm, während eine Zugabe von toten Zellen praktisch keinen Effekt hatte.
Verflüssigung von Biomasse
Während einer Verflüssigung von Biomasse in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur 40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf der Viskosität bestimmt (Viskosimeter von Anton Paar). Die Verflüssigung der Biomasse lief unter ansonsten identischen Bedingungen einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und jeweils unter mehrfacher Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG361. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 eine Verringerung der Viskosität des Substrats auf weniger als 2/3 des ursprünglichen Wertes bewirkte.
Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG361
Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z. B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG361, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Nährmedium inkubiert worden war.
Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5% höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wurde als ohne Zugabe von Mikroorganismen.
Es zeigte sich außerdem, dass die Raumbelastung während der Fermentation deutlich gesteigert werden konnte, mindestens jedoch auf einen Wert von 5 kg oTS/m³d, wenn Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 zugesetzt wurden. Insbesondere beeinflusste die erhöhte Raumbelastung die Stabilität des Fermentationsprozesses nicht negativ, was z. B. anhand der Produktion von Fettsäuren kontrolliert wurde.
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem erfindungsgemäßen Anteil an Ruminobacillus xylanolyticum SBG361 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden.
Ruminobacillus xylanolyticum SBG362
DNA-Isolierung
Aus dem Fermenter einer Biogasanlage wurden Substrat-Proben entnommen und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Abtrennung von nicht verdautem Pflanzenmaterial durch Zentrifugation (30 s, 3000 rpm (Umdrehungern pro Minute) in einer Tischzentrifuge) wurde ein Zellpellet durch Zentrifugation (30 min, 13000 rpm in einer Tischzentrifuge) gewonnen. Die Zellen wurden resuspendiert in 1300 μl salinem Extraktionspuffer (0,1 mol l^–1 EDTA, 0,15 mol l^–1 NaCl, der 30–40 mg mit Säure gewaschenes PVPP enthielt) und anschließend dreimal eingefroren (–80°C) und aufgetaut (bei 56°C). Nach Lyse der Zellen (30 min Inkubation bei 37°C nach Zugabe von 20 μl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) wurden die Zellen nach Zugabe von Protease (20 μl einer 1%igen (w/v) ProteinaseK Lösung) und SDS (100 μl einer 10%igen Lösung) für 45 min bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde anschliessend mit einem Volumen Phenol, mit einem Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, (v/v/v)) und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Aus dem wässrigen Überstand wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen einer Natriumacetat-Lösung (3,0 M, pH 5,2) die DNA mit 0,8 Volumen Isopropanol 30 Min. bei –20°C gefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, zweimal mit 70%igen Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur an Luft getrocknet.
Nukleotidsequenzbestimmung
Zur Bestimmung der 16S rRNA Sequenz wurde aus der isolierten DNA über PCR das Gen für die 16S rRNA amplifiziert. Dafür wurden die Primer mit den Sequenzen GRGTTTGATCCTGGCTCAG und ACGGHTACCTTGTTACGACTT verwendet (angegeben in 5' → 3'Richtung; R bedeutet G oder C; H bedeutet C, T oder A). Die als PCR-Produkte erhaltenen DNA-Stücke wurden dann in einen Klonierungsvektor kloniert (Ligation mit dem QIAGEN PCR-Cloning-Kit der Firma QIAGEN/Hilden unter Verwendung des Vektors p-Drive), in E.coli transformiert (gemäß QIAGEN PCR-Cloning-Handbook) und mittels Colony-PCR untersucht. Die erhaltenen Colony-PCR-Produkte wurden einer Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen-Analyse (RFLP) zur Auswahl geeigneter Klone unterzogen. Aus den jeweiligen Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) sequenziert.
Sequenzanalyse
Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpaket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371) phylogenetisch analysiert werden. Anhand einer Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov konnte Kompostbakterium Klon 1B10 als nächster Verwandter ermittelt werden.
Isolierung und Anreicherung der Mikroorganismen
Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 wurden aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Dazu wurde durch ein flüssiges Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC (Carboxymethylcellulose) und 0,2% Hefeextrakt ohne weitere Kohlenstoffquelle) Stickstoff und Kohlendioxid (in einem Volumenverhältnis von 1:4) durchgeleitet, anschließend Na₂S zu dem Selektionsmedium zugegeben und autoklaviert (20 Min. bei 121°C). In das Selektionsmedium wurde eine Probe aus dem Überstand eines Nachgärers eingebracht und für mindestens eine Woche bei einer Temperatur von mindestes 30°C kultiviert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen bzw. durch Ausstreichen auf feste Nährmedien. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) konnten die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 angereichert werden.
Bestimmung der Zelldichte
Um die Zelldichte in Bezug auf lebende Bakterien zu bestimmen, wurden jeweils 10 μl Bakterienprobe (z. B. Vorkultur, Bakterienzuchtansatz, Überstand von Fermenterprobe) mit 2 μl BacLight^TM-Farbstoff (Invitrogen) vermischt und bei 1000 facher Vergrößerung mikroskopiert (AXIO Imager A1, Zeiss, Jena). Unter UV-Licht mit Nutzung zweier verschiedener Filter, kann mit dem BacLight^TM-System der Anteil lebender Zellen in der Probe bestimmt werden. Die Gesamtzellzahl wurde in einer Thomazählkammer ausgezählt.
Bestimmung des Zellanteils von Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 an einer Probe-„Fishing”
Der Anteil von Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 wurde durch „whole cell hybridization” nach der in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143-169) beschriebenen Methode bestimmt.
Verflüssigung von cellulosehaltigem Medium
Versuche mit einer Reinkultur des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums bis hin zu einer wasserähnlichen Konsistenz während des Bakterienwachstums führte, was durch Schütteln des Anzuchtkolbens und visuelle Inspektion deutlich beobachtet werden konnte.
Verflüssigung von Gärsubstrat
Die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren ist essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Gärsubstrates machte, wurde mit einem Test bestimmt, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wurde (Substratfließtest). Ausgangsmaterial für den Fließtest war Material aus einer Biogasanlage mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 8–12%. Jeweils 500 ml Material aus einem Fermenter wurde in 1 l Schott-Flaschen abgefüllt. Es wurden einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 (totautoklaviert) und einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 (lebend) in insgesamt ca. 1 ml Medium resuspendiert zugesetzt und die Schott-Flaschen für 3 bis 7 Tage bei 40°C inkubiert. Für die Kontrolle wurde 1 ml Medium zugegeben. Jeweils 1,3 g der Proben wurden an den Startpunkt der schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke pro 10 min) der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Es zeigte sich, dass die Viskosität des Fermenterinhalts durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 abnahm, während eine Zugabe von toten Zellen praktisch keinen Effekt hatte.
Verflüssigung von Biomasse
Während einer Verflüssigung von Biomasse in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur 40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf der Viskosität bestimmt (Viskosimeter von Anton Paar). Die Verflüssigung der Biomasse lief unter ansonsten identischen Bedingungen einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und jeweils unter mehrfacher Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG362. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 eine Verringerung der Viskosität des Substrats auf weniger als 2/3 des ursprünglichen Wertes bewirkte.
Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG362
Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z. B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG362, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Nährmedium inkubiert worden war.
Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5% höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wurde als ohne Zugabe von Mikroorganismen.
Es zeigte sich außerdem, dass die Raumbelastung während der Fermentation deutlich gesteigert werden konnte, mindestens jedoch auf einen Wert von 5 kg oTS/m³d, wenn Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 zugesetzt wurden. Insbesondere beeinflusste die erhöhte Raumbelastung die Stabilität des Fermentationsprozesses nicht negativ, was z. B. anhand der Produktion von Fettsäuren kontrolliert wurde.
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem erfindungsgemäßen Anteil an Ruminobacillus xylanolyticum SBG362 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden.
Ruminobacillus xylanolyticum SBG431
DNA-Isolierung
Aus dem Fermenter einer Biogasanlage wurden Substrat-Proben entnommen und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Abtrennung von nicht verdautem Pflanzenmaterial durch Zentrifugation (30 s, 3000 rpm (Umdrehungern pro Minute) in einer Tischzentrifuge) wurde ein Zellpellet durch Zentrifugation (30 min, 13000 rpm in einer Tischzentrifuge) gewonnen. Die Zellen wurden resuspendiert in 1300 μl salinem Extraktionspuffer (0,1 mol l^–1 EDTA, 0,15 mol l^–1 NaCl, der 30–40 mg mit Säure gewaschenes PVPP enthielt) und anschließend dreimal eingefroren (–80°C) und aufgetaut (bei 56°C). Nach Lyse der Zellen (30 min Inkubation bei 37°C nach Zugabe von 20 μl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) wurden die Zellen nach Zugabe von Protease (20 μl einer 1%igen (w/v) ProteinaseK Lösung) und SDS (100 μl einer 10%igen Lösung) für 45 min bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde anschliessend mit einem Volumen Phenol, mit einem Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, (v/v/v)) und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Aus dem wässrigen Überstand wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen einer Natriumacetat-Lösung (3,0 M, pH 5,2) die DNA mit 0,8 Volumen Isopropanol 30 Min. bei –20°C gefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, zweimal mit 70%igen Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur an Luft getrocknet.
Nukleotidsequenzbestimmung
Zur Bestimmung der 16S rRNA Sequenz wurde aus der isolierten DNA über PCR das Gen für die 16S rRNA amplifiziert. Dafür wurden die Primer mit den Sequenzen GRGTTTGATCCTGGCTCAG und ACGGHTACCTTGTTACGACTT verwendet (angegeben in 5' → 3'Richtung; R bedeutet G oder C; H bedeutet C, T oder A). Die als PCR-Produkte erhaltenen DNA-Stücke wurden dann in einen Klonierungsvektor kloniert (Ligation mit dem QIAGEN PCR-Cloning-Kit der Firma QIAGEN/Hilden unter Verwendung des Vektors p-Drive), in E.coli transformiert (gemäß QIAGEN PCR-Cloning-Handbook) und mittels Colony-PCR untersucht. Die erhaltenen Colony-PCR-Produkte wurden einer Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen-Analyse (RFLP) zur Auswahl geeigneter Klone unterzogen. Aus den jeweiligen Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) sequenziert.
Sequenzanalyse
Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpaket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371) phylogenetisch analysiert werden. Anhand einer Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov konnte Porphyromonadaceae sp. D14B-4E als nächster Verwandter ermittelt werden.
Isolierung und Anreicherung der Mikroorganismen
Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 wurden aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers isoliert. Dazu wurde durch ein flüssiges Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC (Carboxymethylcellulose) und 0,2% Hefeextrakt ohne weitere Kohlenstoffquelle) Stickstoff und Kohlendioxid (in einem Volumenverhältnis von 1:4) durchgeleitet, anschließend Na₂S zu dem Selektionsmedium zugegeben und autoklaviert (20 Min. bei 121°C). In das Selektionsmedium wurde eine Probe aus dem Überstand eines Nachgärers eingebracht und für mindestens eine Woche bei einer Temperatur von mindestes 30°C kultiviert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen bzw. durch Ausstreichen auf feste Nährmedien. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) konnten die Bakterien Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 angereichert werden.
Bestimmung der Zelldichte
Um die Zelldichte in Bezug auf lebende Bakterien zu bestimmen, wurden jeweils 10 μl Bakterienprobe (z. B. Vorkultur, Bakterienzuchtansatz, Überstand von Fermenterprobe) mit 2 μl BacLight^TM-Farbstoff (Invitrogen) vermischt und bei 1000 facher Vergrößerung mikroskopiert (AXIO Imager A1, Zeiss, Jena). Unter UV-Licht mit Nutzung zweier verschiedener Filter, kann mit dem BacLight^TM-System der Anteil lebender Zellen in der Probe bestimmt werden. Die Gesamtzellzahl wurde in einer Thomazählkammer ausgezählt.
Bestimmung des Zellanteils von Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 an einer Probe-„Fishing”
Der Anteil von Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 wurde durch „whole cell hybridization” nach der in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143-169) beschriebenen Methode bestimmt.
Verflüssigung von cellulosehaltigem Medium
Versuche mit einer Reinkultur des hydrolytisch aktiven, fermentativen Mikroorganismus Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1% CMC und 0,2% Hefeextrakt) zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums bis hin zu einer wasserähnlichen Konsistenz während des Bakterienwachstums führte, was durch Schütteln des Anzuchtkolbens und visuelle Inspektion deutlich beobachtet werden konnte.
Verflüssigung von Gärsubstrat
Die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren ist essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Gärsubstrates machte, wurde mit einem Test bestimmt, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wurde (Substratfließtest). Ausgangsmaterial für den Fließtest war Material aus einer Biogasanlage mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 8–12%. Jeweils 500 ml Material aus einem Fermenter wurde in 1 l Schott-Flaschen abgefüllt. Es wurden einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 (totautoklaviert) und einmal 4 × 10¹¹ Zellen Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 (lebend) in insgesamt ca. 1 ml Medium resuspendiert zugesetzt und die Schott-Flaschen für 3 bis 7 Tage bei 40°C inkubiert. Für die Kontrolle wurde 1 ml Medium zugegeben. Jeweils 1,3 g der Proben wurden an den Startpunkt der schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke pro 10 min) der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Es zeigte sich, dass die Viskosität des Fermenterinhalts durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 abnahm, während eine Zugabe von toten Zellen praktisch keinen Effekt hatte.
Verflüssigung von Biomasse
Während einer Verflüssigung von Biomasse in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur 40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf der Viskosität bestimmt (Viskosimeter von Anton Paar). Die Verflüssigung der Biomasse lief unter ansonsten identischen Bedingungen einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und jeweils unter mehrfacher Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG431. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 eine Verringerung der Viskosität des Substrats auf weniger als 2/3 des ursprünglichen Wertes bewirkte.
Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Ruminobacillus xylanolyticum SBG431
Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40°C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z. B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG431, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Nährmedium inkubiert worden war.
Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5% höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wurde als ohne Zugabe von Mikroorganismen.
Es zeigte sich außerdem, dass die Raumbelastung während der Fermentation deutlich gesteigert werden konnte, mindestens jedoch auf einen Wert von 5 kg oTS/m³d, wenn Mikroorganismen Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 zugesetzt wurden. Insbesondere beeinflusste die erhöhte Raumbelastung die Stabilität des Fermentationsprozesses nicht negativ, was z. B. anhand der Produktion von Fettsäuren kontrolliert wurde.
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem erfindungsgemäßen Anteil an Ruminobacillus xylanolyticum SBG431 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden.
Der Einsatz von Mikroorganismen der Gattung Ruminobacillus führt zu einer deutlichen Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Anlagen zur Verflüssigung von Biomasse wie auch von Biogasanlagen.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 102005012367 A1 [0058]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verfahren zur Behandlung von Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass der Biomasse ein Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse handelt.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus in Form einer Kultur von Mikroorganismen zugesetzt wird, wobei der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 10^–1% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 10^–2% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 1% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 10% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 50% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 75% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zumindest 90% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reinkultur des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zugesetzt wird.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus der Biomasse als Bestandteil zumindest einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen zugesetzt wird.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass zeitnah zur Zugabe des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zusätzliche Biomasse in den Fermentierungsreaktor gegeben wird.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Raumbelastung im Fermentierungsreaktor durch kontinuierliche Zugabe von Biomasse kontinuierlich gesteigert wird.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 3 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung von Biogas aus Biomasse bei einer Raumbelastung von ≥ 0,5 kg oTS/m³d, bevorzugt ≥ 4,0 kg oTS/m³d, besonders bevorzugt ≥ 8,0 kg oTS/m³d, durchgeführt wird.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung von Biomasse unter konstanter Durchmischung des Substrats erfolgt.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung von Biomasse bei einer Temperatur von 20°C bis 80°C, bevorzugt bei einer Temperatur von 40°C bis 50°C durchgeführt wird.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe von Gärsubstrat und die Zugabe des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus kontinuierlich erfolgen.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zwischen 10^–8% und 50% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zwischen 10^–6% und 25% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zwischen 10^–4% und 10% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zwischen 10^–3% und 1% der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus um einen Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon CFB-21 handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobaclilus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon 127 handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon B55_F_B_E09 handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon G35_D8_H_B_A04 handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon M55_D15_L_B_H07 handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Kompostbakterium Klon 1B10 handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Porphyromonadaceae sp. D148-4E handelt.
Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zur Behandlung von Biomasse.
Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zur Verflüssigung von Biomasse.
Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Verwendung nach zumindest einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Gattung Ruminobacillus um einen Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum handelt.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon CFB-21 handelt.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon 127 handelt.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon B55_F_B_E09 handelt.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon G35_D8_H_B_A04 handelt.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Bakterium Klon M55_D15_L_B_H07 handelt.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Kompostbakterium Klon 1B10 handelt.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus der Art Ruminobacillus xylanolyticum um einen Mikroorganismus des Stammes Porphyromonadaceae sp. D148-4E handelt.
Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,46% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,50% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,60% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,70% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,80% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 entspricht.
Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 92,80% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 93,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 95,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 97,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 entspricht.
Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,01% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,1% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,3% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,7% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 89,89% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 90,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 93,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 62, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 96,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 64, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 entspricht.
Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 96,20% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 66, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 97,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 67, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 70, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 entspricht.
Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 94,65% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 72, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 95,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 73, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 96,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 74, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 97,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 75, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 76, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 entspricht.
Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 95,99% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 78, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 96,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 79, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 97,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 80, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 81, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 82, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht.
Mikroorganismus mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,56% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 84, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,75% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 85, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,0% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 86, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,25% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 87, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,5% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 88, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 8 entspricht.
Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur Behandlung von Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus gemäß den Ansprüchen 42 bis 89 anwesend ist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 90, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus zumindest 10^–2% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 91, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus zumindest 1% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 92, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus zumindest 10% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 93, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus zumindest 50% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 94, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus zumindest 90% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
Kultur von Mikroorganismen nach Anspruch 95, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Reinkultur eines Mikroorganismus gemäß den Ansprüchen 42 bis 89 handelt.
Kultur von Mikroorganismen nach zumindest einem der Ansprüche 90 bis 96, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine immobilisierte Kultur von Mikroorganismen handelt.
Verwendung eines Mikroorganismus nach zumindest einem der Ansprüche 42 bis 89 zur Behandlung von Biomasse.
Verwendung nach Anspruch 98, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 30 handelt.
Verwendung eines Mikroorganismus nach zumindest einem der Ansprüche 42 bis 89 zur Verflüssigung von Biomasse.
Verwendung nach Anspruch 100, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 2 bis 30 handelt.
Verwendung eines Mikroorganismus nach zumindest einem der Ansprüche 42 bis 89 zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Verwendung nach Anspruch 102, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 3 bis 30 handelt.
Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen nach zumindest einem der Ansprüche 90 bis 97 zur Behandlung von Biomasse.
Verwendung nach Anspruch 104, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Behandlung von Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 30 handelt.
Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen nach zumindest einem der Ansprüche 90 bis 97 zur Verflüssigung von Biomasse.
Verwendung nach Anspruch 106, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 2 bis 30 handelt.
Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen nach zumindest einem der Ansprüche 90 bis 97 zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse.
Verwendung nach Anspruch 108, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse nach zumindest einem der Ansprüche 3 bis 30 handelt.