WO2010102618A2 - Mikroorganismen zur verflüssigung von biomasse - Google Patents

Mikroorganismen zur verflüssigung von biomasse Download PDF

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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Definitions

  • the invention relates to processes for the liquefaction of biomass using microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and the species Clostridium sporosphaeroides.
  • Biofuels are usually obtained by fermenting plant substrates with the help of yeasts, bacteria or fungi.
  • the produced are usually obtained by fermenting plant substrates with the help of yeasts, bacteria or fungi.
  • Energy carriers in particular bioethanol, can then be used as fuel in suitable combustion plants or as fuel or fuel additive in
  • the biomass is thus converted into a liquid or gaseous, easily transportable energy source with a relatively high energy density, which can then be used universally.
  • the plant material used as a raw material in particular the organic dry matter (oTS) contained therein, must be opened up for subsequent recycling. This is done by hydrolysis of the organic dry matter, which also corresponds to a liquefaction of the organic dry matter. Bioethanol or another biofuel is then produced from the liquid biomass substrate by fermentation.
  • oTS organic dry matter
  • the ethanolic fermentation takes place primarily by added yeasts, which convert glucose into ethanol.
  • yeasts which convert glucose into ethanol.
  • firstly high molecular weight substrates such as starch, cellulose or hemicellulose (for example in cereals, straw, whole plants) must be enzymatically or chemically cleaved to allow alcoholic fermentation.
  • hydrolytic substrate digestion which also corresponds to liquefaction, are primarily responsible microorganisms, especially bacteria.
  • the increase in the yield of end products from a given amount of starting materials represents - as with any chemical reaction - in the case of liquefaction of biomass with the aim of producing biofuels an urgent goal of the process management. From a given amount of biomass is as large as possible Amount of liquid organic compounds or the largest possible amount of biogas are formed. Better liquefaction of biomass is associated with higher energy efficiency in biofuel production.
  • biofuel is understood to mean a liquid or gaseous fuel or energy carrier which is produced from biomass.
  • Biofuels are used for the operation of internal combustion engines both for mobile (eg motor vehicles) and stationary (eg production of electr - and heat energy in a combined heat and power plant) Applications
  • Examples of biofuels are biodiesel, bioethanol, biomethanol, biokerosene, biohydrogen or biogas.
  • biomass is understood as meaning ethanol which has been produced by alcoholic fermentation from biomass as a renewable carbon carrier or biodegradable fractions of waste and also serves in various concentrations as an additive to mineral oil fuels such as biodiesel or biofuel.
  • biogas is understood to mean the gaseous product of the anaerobic biodegradation of organic substrates, which generally contains about 45-70% of methane, 30-55% of carbon dioxide, and small amounts of nitrogen, hydrogen sulphide and other gases.
  • fermentation or “fermentation” in the context of the present invention include both anaerobic and aerobic metabolic processes which, under the action of microorganisms in a technical process from the supplied substrate to produce a product, e.g. Biogas or bioethanol.
  • a differentiation from the term “fermentation” is given in that it is exclusively anaerobic processes.
  • a “fermenter” is understood as meaning the container in which the microbiological degradation of the substrate takes place.
  • the terms “reactor”, “fermenter” and “digester” are used synonymously.
  • the terms “fermentation substrate” or “substrate” mean organic, biodegradable material which is added to the fermenter for fermentation. Substrates can be renewable raw materials, organic fertilizers, substrates from the processing agricultural industry, municipal organic residues, slaughter residues or green waste.
  • substrates examples include maize silage, rye silage, sugar beet pulp, molasses, grass silage, cattle or pig manure, cattle, pig, chicken or horse manure, spent grains, apple, fruit or vine pomace, cereal, potato or fruit vat.
  • transfer substrate and “substrate” are used synonymously.
  • fertilization residue is understood to be the residue of the biogas production which leaves the fermenter and is frequently stored in a separate container.
  • liquefaction of biomass or fermentation substrate is understood to mean a process under the action of microorganisms, which reduces the viscosity of the starting substrate .
  • the liquefaction of biomass can be measured with technical aids such as viscometers or the "substrate flow test" according to the invention.
  • volume load is understood to mean the amount of dry organic matter (oTS) in kg supplied to the fermenter per day and cubic meter (m 3 ) working volume.
  • organic dry substance (oTS) is understood to mean the anhydrous organic fraction of a substance mixture after removal of the inorganic constituents and drying at 105 ° C. As a rule, the dry matter content is stated in% of the substrate.
  • microorganism is understood microscopically small organisms, which are usually single-celled, but can also be multicellular. Examples of microorganisms are bacteria, microscopic algae, fungi or protozoa.
  • culture is understood to mean an accumulation of microorganisms under established conditions which ensures the growth or at least the survival of the microorganisms
  • these are eg enrichment cultures or pure cultures, liquid cultures as well as cultures on solid media such as nutrient media but also permanent crops such as frozen glycerin cultures, immobilized cultures such as gel cultures or highly concentrated cultures such as cell pellets.
  • pure culture of a microorganism is understood to mean the progeny of a single cell, which is isolated by a multi-step process from a mixture of different microorganisms.
  • the multi-step process involves the separation of a single cell from a cell population and requires that also from the cell
  • pure cultures of microorganisms can be selectively recovered
  • serial dilution of the suspension in the nutrient solution it can finally be achieved that in the last dilution stage there is only one cell left then the basis for a pure culture.
  • mixed culture is understood to mean a mixture of different microorganisms, but natural populations of microorganisms are usually mixed cultures, but mixed cultures can also be produced artificially, for example by combining several pure cultures.
  • the object of the invention is to provide a method for the liquefaction of biomass, by which a low viscosity of the biomass can be achieved.
  • the present invention provides a method for liquefying biomass.
  • the biomass is added according to the invention a microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides.
  • Microorganisms ie microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, microorganisms of the species Paenibacillus macerans and microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides. But it is also any mixture of two or all three types of said
  • the viscosity of the substrate can be greatly reduced by adding microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides to a biomass substrate.
  • the use of microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides leads to a significantly increased liquefaction of the biomass and as a result to a significant improvement in efficiency and efficiency of plants for the production of biofuels.
  • the term "type of microorganisms" is understood to mean the corresponding basic category of biological taxonomy.Species of microorganisms are identified and distinguished on the basis of their nucleotide sequences.A particular type does not only include microorganisms with a very specific nucleotide sequence, but also even to a certain extent their genetic variants.
  • a microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides is added in a process for the liquefaction of biomass in the form of a culture of microorganisms consisting predominantly of a microorganism of the species Clostridium sartagoformum which consists of the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides.
  • microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, of the species Paenibacillus macerans and of the species Clostridium sporosphaeroides could be detected, in each case, in traces of less than ⁇ 0 ⁇ 4 % of the total number of microorganisms present. Since the amount of microorganisms isolated from their natural occurrence is insufficient for the addition of the microorganisms, it is usually propagated in the form of a culture. In practice it is found that the addition of the microorganisms to a biomass substrate is most easily done directly in the form of a culture of microorganisms.
  • the addition of the culture of Clostridium sartagoformum, the culture Paenibacillus macerans and / or the culture Clostridium sporosphaeroides can be carried out in the form of a culture suspension, in the form of dry, freeze-dried or moist cell pellets or in the form of spore suspensions, spore preparations or dry, freeze-dried or moist spore pellets ,
  • the species Clostridium sartagoformum Since the positive effects on the process of biomass liquefaction with microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and the species Clostridium sporosphaeroides, at least one of these types of microorganisms should be present in the added culture in a concentration exceeding the natural abundance. Of course, mixed cultures of any composition can be used for the addition. All that is required is that the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans or the species Clostridium sporosphaeroides or a mixture of these species is present in a concentration which is enriched in biomass compared to the natural occurrence.
  • microorganisms of different types of microorganisms in mixed cultures are not a problem for the expert.
  • fluorescence-labeled oligosensors specifically the proportion of microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and the species Clostridium sporosphaeroides in a mixture be identified.
  • microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and the species Clostridium sporosphaeroides are preferably added to the biomass substrate in the form of cultures of microorganisms, the cultures of microorganisms consisting predominantly of said microorganisms.
  • the total number of microorganisms is also determined, the proportion of microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and the species Clostridium sporosphaeroides the culture in percent.
  • Microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and the species Clostridium sporosphaeroides are in a mixed culture then the predominant species of microorganisms, if they have the highest percentage of the various types of microorganisms present in the mixed culture.
  • the microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans, the species Clostridium sporosphaeroides or their mixture makes at least 10 "4 % or at least 10 " 2 % or at least 1% of the total number of microorganisms present in the culture added to the biomass substrate.
  • the microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans, the species Clostridium sporosphaeroides or their mixture makes up at least 10% or at least 50% or at least 90% of the total number of microorganisms present in the culture.
  • a pure culture of a microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides is added.
  • the said cultures of microorganisms are immobilized cultures of microorganisms.
  • Natural or synthetic polymers can be used as support materials on which microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides are immobilized.
  • Gel-forming polymers are preferably used. These have the advantage that bacteria can be taken up or stored within the gel structure. Preferably, those materials are used which dissolve slowly in water or are degraded, so that the release of the microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides takes place over a longer period of time.
  • suitable polymers are polyaniline, polypyrrole, polyvinylpyrrolidone, polystyrene, polyvinyl chloride, polyvinyl alcohol, polyethylene, polypropylene, epoxy resins, polyethyleneimines, polysaccharides such as agarose, alginate or cellulose, ethylcellulose, methylcellulose, carboxymethylethylcellulose, Cellulose acetates, alkali cellulose sulfate, copolymers of polystyrene and maleic anhydride, copolymers of styrene and methyl methacrylate, polystyrenesulfonate, polyacrylates and polymethacrylates, polycarbonates, polyesters, silicones, cellulose phthalate, proteins such as gelatin, gum arabic, albumin or fibrinogen, mixtures of gelatin and water glass, gelatin and polyphosphate, gelatin and copolymers of maleic anhydride and methyl vinyl ether, cellulose acetate butyrate,
  • Polydialkyldimethylammonium chloride mixtures of polyacrylic acids and Polydiallyldimethylammoniumchlorid and mixtures thereof.
  • the polymer material can also be crosslinked using conventional crosslinkers such as glutaraldehyde, urea / formaldehyde resins or tannin compounds.
  • Alginates as Immobilisate prove to be particularly advantageous because they do not have a negative impact on the activity of microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides and because they are slowly degraded by other microorganisms. Due to the slow degradation of the alginate immobilizates, the trapped microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides are gradually released.
  • the microorganisms are mixed with a polymer gel and then cured in a suitable hardener solution. For this they are first mixed with a gel solution and then dropped into a hardener solution of suitable height.
  • a suitable hardener solution of suitable height.
  • the biomass substrate used may in particular have a high proportion of solid constituents.
  • these solid constituents are at least partially liquefied.
  • thickening of the substrate can be prevented and targeted counteracted.
  • Another liquid entry into the biomass substrate in the form of Water during liquefaction to maintain a stable process can be avoided.
  • Another advantage in conserving the resource freshwater is the thus obtained obtaining the stirring and pumpability of the substrate. As a result, agitators and pumps are spared and significantly less energy is required for the stirring process.
  • a microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides used in the production of biofuel biogas in the hydrolysis stage is brought about by the increased degradation or metabolic performance, a liquefaction of the fermenter material without an acidification or a deterioration of the methane content of the resulting biogas is observed.
  • the space load is significantly increased and the stability of the process improved.
  • microorganisms of the species Clostridium sporosphaeroides, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides can also be used for the liquefaction of biomass in alcoholic fermentation with the aim of producing biofuel
  • At least one microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides is added in an amount to the biomass substrate, so that after addition the proportion of the microorganism of the species Clostridium sartagoformum, of the species Paenibacillus macerans, the species Clostridium sporosphaeroides or the mixture of these microorganisms between 10 "4 % and 90% of the total number of microorganisms present in the biomass substrate, in particular as a function of the fermenter size and thus depending on the amount of biomass Substrate may be necessary to achieve the desired effect, an addition of very different amounts of microorganisms.
  • At least one microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides is added in an amount to the biomass substrate, that after addition of the proportion of the microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans, the Species Clostridium sporosphaeroides or the mixture of these microorganisms between 10 "3 % and 50% of the total number of microorganisms present in the biomass substrate.
  • At least one microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and / or the species Clostridium sporosphaeroides is added in an amount to the biomass substrate such that, after addition, the proportion of the microorganism of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans, the Species Clostridium sporosphaeroides or the mixture of these microorganisms between 10 " accounts for 2 % and 20% of the total number of present in the biomass substrate microorganisms.
  • Clostridium sporosphaeroides added in an amount to the biomass substrate, that after addition of the proportion of the microorganism of the species
  • Clostridium sartagoformum the species Paenibacillus macerans, the species Clostridium sporosphaeroides or the mixture of these microorganisms between 10 "1 % and 10% of the total number present in the biomass substrate
  • the present invention also encompasses the use of a microorganism of the species Clostridium sartagoformum for the liquefaction of biomass.
  • the present invention also includes the use of a microorganism of the species Paenibacillus macerans for the liquefaction of biomass.
  • the present invention also encompasses the use of a microorganism of the species Clostridium sporosphaeroides for the liquefaction of biomass.
  • microorganisms Preferably, a mixture of two or three of the mentioned types of microorganisms is used. If appropriate, these can also be supplemented by further types of microorganisms which likewise bring about a liquefaction of biomass according to the invention.
  • the present invention also encompasses the use of the liquefied biomass for biofuel production obtained by one of the described processes.
  • the liquefied biomass obtained by one of the processes described is preferably used for the production of bioethanol or biogas.
  • Bacteria of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and the species Clostridium sporosphaeroides can be isolated from the substrate of a fermenter by methods known to those skilled in the art.
  • a suitable substrate is introduced from a fermenter into a selection medium, cultured for a long time and finally isolated individual colonies of microorganisms from the selection medium.
  • microorganisms of the species Clostridium sartagoformum, the species Paenibacillus macerans and the species Clostridium sporosphaeroides can be selected on the basis of the DNA.
  • 1 shows a substrate flow test for investigating the extent of liquefaction of fermentation substrate with corn silage as starting substrate
  • FIG. 2 shows a substrate flow test for investigating the extent of liquefaction of fermentation substrate with straw as starting substrate
  • FIG. 3 shows a substrate flow test for investigating the extent of liquefaction of fermentation substrate with grass silage as starting substrate
  • Fig. 4 a substrate flow test to investigate the extent of
  • Clostridium sartagoformum, Paenibacillus macerans and Clostridium sporosphaeroides were successfully isolated from the substrate of a fermenter.
  • the isolation of the microorganisms was carried out in each case by means of a selection medium which contained carboxymethylcellulose as sole carbon source.
  • Carboxymethylcellulose is very similar to the cellulose contained in substrates of biomass liquefaction plants, and has improved solubility in an aqueous medium by linking the hydroxyl groups with carboxymethyl groups (-CH 2 -COOH-).
  • Clostridium sartagoformum, Paenibacillus macerans and Clostridium sporosphaeroides used medium was gassed with N 2 and CO 2 , so that the selection could be carried out under anaerobic conditions. Contained residual oxygen was then reduced with the aid of 0.5 g / l Na 2 S and the medium finally autoclaved (20 min. At 121 0 C).
  • the selection medium (DSMZ medium 520 plus 1% CMC and 0.2% yeast extract) was then inoculated with the supernatant of material from a fermenter. After one week of cultivation at 40 ° C., single rods were observed under microscopic analysis. Further selection of the liquid cultures was made by smearing on anaerobic carboxymethylcellulose plates. The cell material of the grown colonies was used to amplify the microbial DNA by the Colony PCR method according to a standard program.
  • the proportion of bacteria of the species Clostridium sporosphaeroides or Paenibacillus macerans or Clostridium sartagoformum was determined by "whole cell hybridization" according to the method described in Amann et al. (1995, Microbiol Rev 59, 143-169)
  • Clostridium sporosphaeroides a labeled oligonucleotide with the sequence Cy3- CCACAGCTCTCACGCCCG (indicated in 5 " ⁇ 3 " direction) was used, for Paenibacillus macerans a labeled oligonucleotide having the sequence Cy3- GCAACCCGAACTGAGACC (indicated in 5 " ⁇ 3 " direction) and for Clostridium sartagoformum a labeled oligonucleotide having the sequence Cy3 CTTCATGCGAAAATGTAA (indicated in 5 " ⁇ 3 " direction).
  • the oligonucleotides carried the dye indocarbocyanine (Cy3) as a label at the 5 " end in each case
  • the indicated labeled oligonucleotides can also be used as hybridization probes to detect the presence of the corresponding types of microorganisms in a sample.
  • Experiments with pure cultures of the microorganisms Clostridium sartagoformum, Paenibacillus macerans and Clostridium sporosphaeroides and with mixed cultures showed that the addition of the highly viscous, viscous carboxymethylcellulose-containing selection medium leads to a successive liquefaction of the medium.
  • Clostridium sartagoformum bacteria were cultured with the strains Clostridium sartagoformum SBG1 and Clostridium sartagoformum SBGIa, bacteria of the species Clostridium sporosphaeroides with the strain Clostridium sporosphaeroides SBG3 and bacteria of the species Paenibacillus macerans with the strain Paenibacillus macerans SBG2 at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ( DSMZ) in Braunschweig according to the Budapest Treaty.
  • DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
  • Clostridium sartagoformum SBG1 bears the accession number DSM 19861, Clostridium sartagoformum SBGIa the accession number DSM 22578, Clostridium sporosphaeroides SBG3 the accession number DSM 22577 and Paenibacillus macerans SBG2 the accession number DSM 22569.
  • the liquefaction of a fermentation substrate with a high dry matter content or the maintenance of a liquid pulpy consistency in a wet fermentation process is essential in order to ensure a smooth and cost-effective course of the technical process. Partly it comes in continuous operation also to an increasing "mucusification" of the fermenter content, which also has a negative impact on the process of biofuel production.
  • Starting material for the substrate flow test discussed below in connection with FIG. 1 was material from a biogas plant with a dry matter content of about 8-12%, which was operated with corn silage. Each 500 ml of material from a fermenter was filled into 1 I Schott bottles and incubated for 1 day at 40 0 C.
  • each of the bacterial cell mass from a 500 ml preculture (corresponding to approximately 4 x 10 11 cells) of Clostridium sporosphaeroides SBG3, Clostridium sartagoformum SBGIa, Paenibacillus macerans SBG2 or a mixture of the three bacteria was resuspended in equal proportions in 1 ml of medium, and added for further Incubated for 5 days at 40 ° C. with shaking. For the control sample, only 1 ml of medium was added.
  • FIG. 1 shows the following traces in FIG. 1: Lane 1: control without addition of microorganisms; Lane 2: Clostridium sartagoformum SBGIa; Lane 3: Clostridium sporosphaeroides SBG3; Lane 4: Paenibacillus macerans SBG2; Lane 5: Mixture of Clostridium sartagoformum SBGIa, Clostridium sporosphaeroides SBG3 and Paenibacillus macerans SBG2 in equal parts.
  • FIG. 1A shows the traces directly after the application of the samples, FIG. 1B after 2 min. and Figure 1 C after 18 min.
  • SBGIa and Paenibacillus macerans SBG2 also produced a marked but less pronounced effect. Also by the addition of a mixture of 3 microorganisms, a significant liquefaction of the substrate could be achieved.
  • the grass silage had a content of organic dry matter (oTS) of 18.5%, straw of 85.0% and cattle slurry of 4.9%.
  • oTS organic dry matter
  • Each 25 ml of biomass from a Nachgärer the biogas production (oTS between 6% and 10%) were filled for the experimental batches in 50 ml plastic vessels, mixed with 5 g grass silage or 1 g of straw as substrate and incubated for 1 day at 40 0 C.
  • Bovine manure as a substrate was used directly (25 ml each) without mixing with biomass from a post-fermenter.
  • the corresponding amount of water was added instead of the bacterial cells.
  • FIG. 2 shows the result of the liquefaction of straw as a starting substrate for biofuel production.
  • the following traces are shown: Lane 1: control without addition of microorganisms; Lane 2: Clostridium sartagoformum; Lane 3: mixture of Clostridium sartagoformum and Clostridium sporosphaeroides in equal parts; Lane 4: Clostridium sporosphaeroides; Lane 5: control without addition of microorganisms; Lane 6: Clostridium sartagoformum, dead cells; Lane 7: Mixture of Clostridium sartagoformum and Clostridium sporosphaeroides in equal parts, dead cells; Lane 8: Clostridium sporosphaeroides, dead cells.
  • FIG. 2A shows the traces directly after the application of the samples, FIG. 2B 5 minutes after the sample application.
  • FIG. 3 shows the result of liquefaction of grass silage as a starting substrate for biofuel production.
  • the following traces are shown: Lane 1: control without addition of microorganisms; Lane 2: Clostridium sartagoformum; Lane 3: mixture of Clostridium sartagoformum and Clostridium sporosphaeroides in equal parts; Lane 4: Clostridium sporosphaeroides; Lane 5: control without addition of microorganisms; Lane 6: Clostridium sartagoformum, dead cells; Lane 7: Mixture of Clostridium sartagoformum and Clostridium sporosphaeroides in equal parts, dead cells; Lane 8: Clostridium sporosphaeroides, dead cells.
  • FIG. 2A shows the traces directly after the application of the samples, FIG. 2B 5 minutes after the sample application.
  • FIG. 4 shows the result of the liquefaction of cattle slurry as a starting substrate for biofuel production.
  • FIG. 2A shows the traces directly after the application of the samples, FIG. 2B 5 minutes after the sample application.

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Verflϋssigung von Biomasse, wobei der Biomasse zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt wird.

Description

Mikroorganismen zur Verflüssigung von Biomasse
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse unter Verwendung von Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides.
Stand der Technik
Biokraftstoffe werden in der Regel durch Vergärung von Pflanzensubstraten mit Hilfe von Hefen, Bakterien oder Pilzen gewonnen. Die produzierten
Energieträger, insbesondere Bioethanol, können anschließend als Brennstoff in geeigneten Feuerungsanlagen oder als Treibstoff bzw. Treibstoffzusatz in
Motoren zur Strom- und Wärmeerzeugung eingesetzt werden. Die Biomasse wird somit in einen flüssigen oder gasförmigen, gut transportierbaren Energieträger mit relativ hoher Energiedichte umgewandelt, der dann weitgehend universell eingesetzt werden kann.
Als Rohstoffe für die Erzeugung von flüssigen Biokraftstoffen kommen meist lokal verfügbare Pflanzen mit einem hohen Gehalt an Zucker oder Stärke zum Einsatz. In Europa sind dies vor allem Mais- und Getreidekörner sowie Zuckerrüben, in Nordamerika Mais und in Lateinamerika Zuckerrohr oder -melasse. In Frage kommen aber auch weitere Energiepflanzen wie Zuckerhirse (Sorghum), Triticale oder Cassava (Maniok). Derzeit werden als Ausgangsmaterial bei der Verflüssigung von Biomasse insbesondere Maiskorn und Getreidekorn eingesetzt. Aufgrund der zunehmenden Rohstoffknappheit, der gestiegenen Rohstoffpreise, einer enstandenen Konkurrenzsituation um Pflanzen, die sowohl der menschlichen und tierischen Nahrung dienen als auch der Energiegewinnung, einer verbesserten CO"2-Bilanz sowie der Schonung der Ressourcen wird nun zunehmend versucht, nicht nur die Körner von Mais und Getreide zu verwenden, sondern vielmehr die gesamte Pflanze der Energiegewinnung zuzuführen oder Pflanzen zu verwenden, die keiner intensiven landwirtschaftlichen Bewirtschaftung bedürfen wie Rutenhirse oder Chinaschilf. Bei den aus diesen Rohstoffen hergestellten Biokraftstoffen handelt es sich um sogenannte „second generation"-Kraftstoffe. Daneben wird auch eine vermehrte Nutzung von günstigen pflanzlichen Reststoffen wie Stroh, pflanzlichen Abfällen aus der Holzwirtschaft oder Garten- und Landschaftspflege angestrebt.
Um eine effiziente Vergärung der Biomasse sicher zu stellen, muss das als Rohstoff eingesetzte pflanzliche Material, insbesondere die darin enthaltene organische Trockensubstanz (oTS) für eine anschließende Verwertung aufgeschlossen werden. Dies geschieht durch Hydrolyse der organischen Trockensubstanz, was gleichermaßen einer Verflüssigung der organischen Trockensubstanz entspricht. Aus dem flüssigen Biomasse-Substrat wird dann durch Vergärung Bioethanol oder ein anderer Biokraftstoff hergestellt. Mit den vorhandenen Techniken wird aber keine hohe Energieeffizienz erreicht, was insbesondere an der nicht ausreichenden Verflüssigung und damit Verwertung des Rohmaterials liegt.
Bei der Herstellung von Bioethanol erfolgt die ethanolische Gärung in erster Linie durch zugesetzte Hefen, die Glucose in Ethanol umwandeln. Je nach Substrat ist schon ein relativ hoher Zuckeranteil vorhanden (z.B. bei Melasse) oder es müssen zuerst höhermolekulare Substrate wie Stärke, Cellulose oder Hemicellulose (z.B. bei Getreide, Stroh, Ganzpflanzeneinsatz) enzymatisch oder chemisch gespalten werden, damit die alkoholische Gärung erfolgen kann. Für diesen hydrolytischen Substrataufschluss, der auch einer Verflüssigung entspricht, sind in erster Linie Mikroorganismen, insbesondere Bakterien verantwortlich.
Wird ein Fermenter zur Biokraftstoffproduktion im kontinuierlichen Betrieb betrieben, führt ein steigender Trockensubstanzanteil zunehmend zu Problemen bei der Rühr- und Pumpfähigkeit des Fermenterinhalts. Bei einer weiteren Steigerung der Trockensubstanzgehalte kann diese Eindickung zur Instabilität der Biozönose und damit zum weitgehenden bis vollständigen Erliegen der biologischen Stoffwechselprozesse und damit auch der Biokraftstoffproduktion führen, was als „Fermenterabsturz" bezeichnet wird. Um eine Eindickung zu verhindern, kann durch Zugabe flüssiger Substanzen, wie zum Beispiel Wasser oder Gülle eine Verflüssigung des Fermenterinhaltes erreicht werden. Die Problematik liegt dabei in den gesetzlichen Rahmenbedingungen (EEG - Erneuerbare Energien Gesetz), die bei Erhalt des Trockenfermentations-Bonus eine Zugabe von Substanzen, die einen geringeren Trockensubstanzanteil als durchschnittlich 30 % aufweisen, nicht gestatten. Eine Verflüssigung des Fermentermaterials durch zusätzliche Flüssigkeitszufuhr kann daher selten angewendet werden.
Bedenkt man zusätzlich zu den oben genannten Erwägungen die Knappheit der Ressource Süßwasser, so scheidet eine Verflüssigung des Fermenterinhalts durch Zugabe von Wasser aus. Gülle als Verflüssigungsstoff ist zum einen wegen des technischen Aufwandes mit hohen Kosten verbunden, zum anderen nicht überall verfügbar und außerdem von wechselnder Qualität und Güte. Außerdem ist beim Einsatz von Gülle länderspezifisch nach dem Fermentationsprozess eine Hygienisierungsstufe aus rechtlichen Gründen erforderlich bevor der Gärrest wieder auf das Feld ausgebracht werden kann.
Die Erhöhung der Ausbeute an Endprodukten aus einer gegebenen Menge an Edukten stellt - wie bei jeder chemischen Umsetzung - im Fall der Verflüssigung von Biomasse mit dem Ziel der Herstellung von Biokraftstoffen ein vordringliches Ziel der Prozessführung dar. Aus einer gegebenen Menge an Biomasse soll eine möglichst große Menge an flüssigen organischen Verbindungen bzw. eine möglichst große Menge an Biogas gebildet werden. Eine bessere Verflüssigung von Biomasse geht in der Biokraftstoffproduktion einher mit einer höheren Energieeffizienz.
Es besteht daher ein Bedarf an Verfahren zur Behandlung von Biomasse, insbesondere an effizienteren Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse, durch die eine möglichst geringe Viskosität der Biomasse erreicht werden kann. - A -
Definitionen
Unter dem Begriff „Biokraftstoff" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein flüssiger oder gasförmiger Kraftstoff bzw. Energieträger verstanden, der aus Biomasse hergestellt wird. Biokraftstoffe kommen für den Betrieb von Verbrennungsmotoren sowohl für mobile (z.B. Kraftfahrzeuge) als auch stationäre (z.B. Erzeugung von Elektro- und Wärmeenergie in einem Blockheizkraftwerk) Anwendungen zum Einsatz. Beispiele für Biokraftstoffe sind Biodiesel, Bioethanol, Biomethanol, Biokerosin, Biowasserstoff oder Biogas.
Unter dem Begriff „Bioethanol" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Ethanol verstanden, der durch alkoholische Gärung aus Biomasse als nachwachsendem Kohlenstoffträger oder biologisch abbaubaren Anteilen von Abfällen hergestellt wurde. Er dient in verschiedenen Konzentrationen auch als Zusatz zu Mineralölkraftstoffen wie Biodiesel oder Biokraftstoff.
Unter dem Begriff „Biogas" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das gasförmige Produkt des anaeroben biologischen Abbaus organischer Substrate verstanden. Es enthält in der Regel ca. 45-70 % Methan, 30-55 % Kohlendioxid, sowie geringe Mengen an Stickstoff, Schwefelwasserstoff und anderen Gasen.
Die Begriffe „Fermentation" oder „Fermentierung" umfassen im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl anaerobe wie auch aerobe Stoffwechselprozesse, die unter Einwirkung von Mikroorganismen in einem technischen Prozess aus dem zugeführten Substrat zur Erzeugung eines Produktes, z.B. Biogas oder Bioethanol führen. Eine Abgrenzung zu dem Begriff „Gärung" ist insofern gegeben, dass es sich bei diesem ausschließlich um anaerobe Prozesse handelt.
Unter einem „Fermenter" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Behälter verstanden, in dem der mikrobiologische Abbau des Substrates erfolgt. Die Begriffe „Reaktor", „Gärbehälter" und „Faulbehälter" werden synonym verwendet. Unter den Begriffen „Gärsubstrat" oder „Substrat" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung organisches, biologisch abbaubares Material verstanden, das dem Fermenter zur Fermentation zugesetzt wird. Substrate können nachwachsende Rohstoffe, Wirtschaftsdünger, Substrate aus der weiterverarbeitenden Agrarindustrie, kommunale organische Reststoffe, Schlachtrückstände oder Grünschnitt sein. Beispiele für solche Substrate sind Maissilage, Roggensilage, Zuckerrübenschnitzel, Melasse, Grassilage, Rinderoder Schweinegülle, Rinder-, Schweine-, Hühner- oder Pferdemist, Biertreber, Apfel-, Obst- oder Rebentrester, Getreide-, Kartoffel- oder Obstschlempe. Organischer Abfall aus Biotonne, Speisereste, Marktabfälle, Fett aus Fettabscheidern, Panseninhalt und Schweinemageninhalt. Die Begriffe „Gärsubstrat" und „Substrat" werden synonym verwendet.
Unter dem Begriff „Gärrest" wird der Rückstand der Biogasgewinnung verstanden, der den Fermenter verlässt und häufig in einem eigenen Behälter gelagert wird.
Unter dem Begriff „Verflüssigung" von Biomasse oder Gärsubstrat wird ein Prozess unter Einwirkung von Mikroorganismen verstanden, der die Viskosität des Ausgangssubstrates verringert. Die Verflüssigung von Biomasse kann mit technischen Hilfsmitteln wie Viskosimeter oder dem erfindungsgemäßen „Substratfließtest" gemessen werden.
Unter „Raumbelastung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die pro Tag und Kubikmeter (m3) Arbeitsvolumen dem Fermenter zugeführte Menge an organischer Trockensubstanz (oTS) in kg verstanden.
Unter „organischer Trockensubstanz" (oTS) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der wasserfreie organische Anteil eines Stoffgemisches nach Entfernung der anorganischen Anteile und Trocknung bei 105 0C verstanden. In der Regel wird der Trockensubstanzanteil in % des Substrats angegeben.
Unter dem Begriff „Mikroorganismus" werden mikroskopisch kleine Lebewesen verstanden, die in der Regel Einzeller sind, aber auch Mehrzeller sein können. Beispiele für Mikroorganismen sind Bakterien, mikroskopische Algen, Pilze oder Protozoen.
Unter den Bezeichnungen „Art" von Mikroorganismen und „Stamm" von Mikroorganismen wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die entsprechende grundlegende Kategorie der biologischen Taxonomie, insbesondere der phylogenetischen Klassifikation verstanden. Gattungen, Arten und Stämme von Mikroorganismen werden u.a. anhand ihrer RNA-Sequenzen identifiziert und unterschieden. Unter eine bestimmte Gattung, eine bestimmte Art bzw. einen bestimmten Stamm fallen dabei nicht nur Mikroorganismen mit einer ganz bestimmten RNA-Sequenz, sondern auch bis zu einem gewissen Umfang deren genetische Varianten, wobei die genetische Varianz in der Reihe Stamm, Art, Gattung zunimmt.
Die Definition einer „Art" eines Bakteriens befindet sich im wissenschaftlichen Wandel und ist weder abgeschlossen noch sind die verschiedenen Konzepte unumstritten. In der vorliegenden Erfindung wird unter „Art" das Artkonzept verstanden, das sich auf genomische und phylogenetische Analysen bezieht und in dem Review von Staley (Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei., 2006, 361 , 1899-1909) beschrieben ist. Weitestgehend anerkannt ist, dass zwei bakterielle Spezies, die mehr als 70 % DNA-DNA-Hydridisierung oder mehr als 94 % durchschnittliche Nukleotididentität (ANI, average nucleotide identity) aufweisen, derselben Art angehören bzw. zwei Spezies, die weniger als 97 % Identität der 16S rRNA aufweisen, zwei unterschiedlichen Arten zuzuordnen sind.
Unter dem Begriff „Kultur" wird in diesem Zusammenhang eine Ansammlung von Mikroorganismen unter geschaffenen Bedingungen verstanden, durch die das Wachstum oder zumindest das Überleben der Mikroorganismen gewährleistet wird. Für Bakterien sind das z.B. Anreicherungskulturen oder Reinkulturen, Flüssigkulturen ebenso wie Kulturen auf festen Medien wie Nährböden, aber auch Dauerkulturen wie tiefgekühlte Glycerinkulturen, immobilisierte Kulturen wie z.B. Gelkulturen oder hochkonzentrierte Kulturen wie Zellpellets. Unter dem Begriff „Reinkultur" eines Mikroorganismus wird die Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle verstanden. Diese wird durch einen mehrstufigen Prozess aus einem Gemisch verschiedener Mikroorganismen isoliert. Der mehrstufige Prozess umfasst die Abtrennung einer einzelnen Zelle aus einer Zellpopulation und erfordert, dass auch die aus der Zelle durch Wachstum und Zellteilung hervorgehende Kolonie von anderen Einzelzellen oder Kolonien getrennt bleibt. Durch eine sorgfältige Abtrennung einer Kolonie, erneutes Suspendieren in Flüssigkeit und wiederholtes Ausstreichen können gezielt Reinkulturen von Mikroorganismen gewonnen werden. Die Isolierung einer Reinkultur kann auch in flüssigen Nährmedien erfolgen, sofern der gewünschte Organismus im Ausgangsmaterial zahlenmäßig überwiegt. Durch serienmäßige Verdünnung der Suspension in der Nährlösung lässt es sich schließlich erreichen, dass sich in der letzten Verdünnungsstufe nur noch eine Zelle befindet. Diese Zelle stellt dann die Basis für eine Reinkultur dar. Die Erläuterung des Begriffs „Reinkultur" und Verfahren zur Erzeugung derselben sind in „Allgemeine Mikrobiologie" von Hans G. Schlegel, 7. überarbeitete Auflage, 1992, Georg Thieme Verlag, S. 205 aufgeführt, worauf hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Unter dem Begriff „Mischkultur" wird ein Gemisch verschiedener Mikroorganismen verstanden. Natürliche Populationen von Mikroorganismen sind in der Regel Mischkulturen. Mischkulturen können jedoch auch künstlich hergestellt werden z.B. durch die Vereinigung von mehreren Reinkulturen.
Darstellung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse bereitzustellen, durch das eine geringe Viskosität der Biomasse erreicht werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung und den Beispielen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse zur Verfügung. Der Biomasse wird erfindungsgemäß ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt.
Wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung der Ausdruck „Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der
Art Clostridium sporosphaeroides" gebraucht, so ist damit für jede beliebige
Ausführungsform grundsätzlich zum einen jede einzelne Art von
Mikroorganismen gemeint, also Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, Mikroorganismen der Art Paenibacillus macerans und Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides. Es ist aber auch jede beliebige Mischung von zwei oder allen drei Arten der genannten
Mikroorganismen umfasst.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass durch die Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zu einem Biomasse- Substrat die Viskosität des Substrats stark vermindert werden kann. Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides führt zu einer deutlich verstärkten Verflüssigung der Biomasse und in der Folge zu einer deutlichen Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Anlagen zur Herstellung von Biokraftstoffen.
Unter der Bezeichnung „Art von Mikroorganismen" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die entsprechende grundlegende Kategorie der biologischen Taxonomie verstanden. Arten von Mikroorganismen werden anhand ihrer Nukleotidsequenzen identifiziert und unterschieden. Unter eine bestimmte Art fallen dabei nicht nur Mikroorganismen mit einer ganz bestimmten Nukleotidsequenz, sondern auch bis zu einem gewissen Umfang deren genetische Varianten. Dem einschlägigen Fachmann ist bekannt, welche Stämme von Mikroorganismen unter den Begriff „Art Clostridium sartagoformum", „Art Paenibacillus macerans" und „Art Clostridium sporosphaeroides" fallen. Im Zusammenhang mit der Verflüssigung von Biomasse sind Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides bisher nicht bekannt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides in einem Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse in Form einer Kultur von Mikroorganismen zugesetzt, die überwiegend aus einem Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides besteht.
In Substraten von Biogasanlagen konnten Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides beispielsweise jeweils in Spuren von weniger als '\ 0~4% Anteil an der gesamten Anzahl von anwesenden Mikroorgansimen nachgewiesen werden. Da für die Zugabe der Mikroorganismen die Menge an aus ihrem natürlichen Vorkommen isolierten Mikroorganismen nicht ausreicht, wird üblicherweise eine Vermehrung in Form einer Kultur vorgenommen. In der Praxis zeigt sich, dass die Zugabe der Mikroorganismen zu einem Biomasse-Substrat am einfachsten direkt in Form einer Kultur von Mikroorganismen vorgenommen wird.
Die Zugabe der Kultur von Clostridium sartagoformum, der Kultur Paenibacillus macerans und/oder der Kultur Clostridium sporosphaeroides kann in Form einer Kultursuspension, in Form trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Zellpellets oder auch in Form von Sporensuspensionen, Sporenpräparaten oder trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Sporenpellets vorgenommen werden.
Da die positiven Effekte auf den Vorgang der Biomasse-Verflüssigung mit Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides verbunden sind, sollte zumindest eine dieser Arten von Mikroorganismen in der zugegebenen Kultur in einer das natürliche Vorkommen übersteigenden Konzentration anwesend sein. Selbstverständlich können Mischkulturen in beliebiger Zusammensetzung für die Zugabe verwendet werden. Voraussetzung ist lediglich, dass die Art Clostridium sartagoformum, die Art Paenibacillus macerans oder die Art Clostridium sporosphaeroides bzw. eine Mischung dieser Arten in einer gegenüber dem natürlichen Vorkommen in Biomasse angereicherten Konzentration anwesend ist.
Die Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen in Mischkulturen stellt für den Fachmann kein Problem dar. So kann beispielsweise mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten Oligosonden spezifisch der Anteil von Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Mischung identifiziert werden. Wie bereits erwähnt, werden Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides bevorzugt in Form von Kulturen von Mikroorganismen dem Biomasse-Substrat zugesetzt, wobei die Kulturen von Mikroorganismen überwiegend aus den genannten Mikroorganismen bestehen. Wird neben der Bestimmung der Anzahl an Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides auch die Gesamtzahl an Mikroorganismen bestimmt, so kann der Anteil an Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides in der Kultur in Prozent angegeben werden. Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides sind in einer Mischkultur dann die überwiegend anwesende Art von Mikroorganismen, wenn sie den höchsten prozentualen Anteil der verschiedenen in der Mischkultur anwesenden Arten von Mikroorganismen aufweisen.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans, der Art Clostridium sporosphaeroides oder deren Mischung zumindest 10"4% oder zumindest 10"2% oder zumindest 1% der Gesamtzahl an in der zu dem Biomasse-Substrat zugegebenen Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen macht der Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans, der Art Clostridium sporosphaeroides oder deren Mischung zumindest 10% oder zumindest 50% oder zumindest 90 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen wird eine Reinkultur eines Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den genannten Kulturen von Mikroorganismen um immobilisierte Kulturen von Mikroorganismen.
Als Trägermaterialien, auf denen Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides immobilisiert werden, können natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt werden. Bevorzugt werden gelbildende Polymere verwendet. Diese haben den Vorteil, dass Bakterien innerhalb der Gelstruktur aufgenommen bzw. eingelagert werden können. Bevorzugt werden solche Materialien eingesetzt, die sich in Wasser langsam auflösen bzw. abgebaut werden, so dass die Freisetzung des Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides über einen längeren Zeitraum hinweg erfolgt.
Beispiele für geeignete Polymere sind Polyanillin, Polypyrrol, Polyvinylpyrolidon, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyvinylalkohol, Polyethylen, Polypropylen, Epoxidharze, Polyethylenimine, Polysaccharide wie Agarose, Alginat oder Cellulose, Ethylcellulose, Methylcellulose, Carboxymethylethylcellulose, Celluloseacetate, Alkali-Cellulosesulfat, Copolymere aus Polystyrol und Maleinsäureanhydrid, Copolymere aus Styrol und Methylmethacrylat, Polystyrolsulfonat, Polyacrylate und Polymethacrylate, Polycarbonate, Polyester, Silikone, Cellulosephthalat, Proteine wie Gelatine, Gummi arabicum, Albumin oder Fibrinogen, Gemische aus Gelatine und Wasserglas, Gelatine und Polyphosphat, Gelatine und Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Methylvinylether, Celluloseacetatbutyrat, Chitosan,
Polydialkyldimethylammonium-chlorid, Mischungen aus Polyacrylsäuren und Polydiallyldimethylammoniumchlorid sowie deren Gemische. Das Polymermaterial kann auch mit Hilfe üblicher Vernetzer wie Glutaraldehyd, Harnstoff/Formaldehydharzen oder Taninverbindungen vernetzt werden.
Alginate als Immobilisate erweisen sich als besonders vorteilhaft, da sie zum einen keinen negativen Einfluss auf die Aktivität von Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides nehmen und da sie zum anderen durch Mikroorganismen langsam abgebaut werden. Durch den langsamen Abbau der Alginat-Immobilisate werden nach und nach die eingeschlossenen Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides freigesetzt.
Für die Immoblisation werden die Mikroorganismen mit einem Polymergel vermengt und dann in einer geeigneten Härterlösung gehärtet. Dazu werden sie zunächst mit einer Gellösung vermischt und anschließend in eine Härterlösung aus geeigneter Höhe getropft. Die genauen Vorgehensweisen zur Immobilisation sind dem Fachmann bekannt.
Das verwendete Biomasse-Substrat kann insbesondere einen hohen Anteil an festen Bestandteilen aufweisen. Durch die Zugabe zumindest eines Mik- roorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides werden diese festen Bestandteile zumindest teilweise verflüssigt. Durch die erzielte Verflüssigung des Substrats kann einem Eindicken des Substrats vorgebeugt und gezielt entgegengewirkt werden. Ein weiterer Flüssigkeitseintrag in das Biomasse-Substrat in Form von Wasser während der Verflüssigung zur Aufrechterhaltung eines stabilen Prozesses kann vermieden werden. Somit besteht ein weiterer Vorteil in der Schonung der Ressource Süßwasser. Ebenfalls von Vorteil ist der so erzielte Erhalt der Rühr- und Pumpfähigkeit des Substrats. Dadurch werden Rührwerke und Pumpen geschont und für den Rührvorgang ist deutlich weniger Energie erforderlich.
Wird ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides bei der Produktion des Biokraftstoffs Biogas in der Hydrolyse-Stufe eingesetzt, wird durch die erhöhte Abbau- bzw. Stoffwechselleistung eine Verflüssigung des Fermentermaterials herbeigeführt, ohne dass dabei eine Versäuerung, bzw. eine Verschlechterung des Methangehaltes des entstehenden Biogases zu beobachten ist. Die Raumbelastung wird deutlich erhöht und die Stabilität des Prozesses verbessert.
Mikroorganismen der Art Clostridium sporosphaeroides, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides können aber auch zur Verflüssigung von Biomasse in der alkoholischen Gärung mit dem Ziel der Produktion von Biokraftstoff verwendet werden
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Biomasse-Substrat zugegeben, so dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans, der Art Clostridium sporosphaeroides oder der Mischung dieser Mikroorganismen zwischen 10"4% und 90% der Gesamtzahl an in dem Biomasse-Substrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Insbesondere in Abhängigkeit von der Fermentergröße und damit in Abhängigkeit von der Menge an Biomasse-Substrat kann zur Erzielung der gewünschten Wirkung eine Zugabe von sehr stark unterschiedlichen Mengen an Mikroorganismen notwendig werden. Sowohl die Bestimmung der Gesamtzahl von Mikroorganismen in dem Biomasse-Substrat wie auch die Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen im Biomasse-Substrat stellt für den Fachmann kein Problem dar. So kann beispielsweise mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten Oligosonden spezifisch der Anteil verschiedener Mikroorganismen in dem Biomasse-Substrat identifiziert werden
Besonders bevorzugt wird zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Biomasse-Substrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans, der Art Clostridium sporosphaeroides oder der Mischung dieser Mikroorganismen zwischen 10"3% und 50% der Gesamtzahl an in dem Biomasse-Substrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
Insbesondere bevorzugt wird zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Biomasse-Substrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans, der Art Clostridium sporosphaeroides oder der Mischung dieser Mikroorganismen zwischen 10"2% und 20% der Gesamtzahl an in dem Biomasse-Substrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
Ganz besonders bevorzugt wird zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art
Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Biomasse-Substrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art
Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans, der Art Clostridium sporosphaeroides oder der Mischung dieser Mikroorganismen zwischen 10"1% und 10% der Gesamtzahl an in dem Biomasse-Substrat anwesenden
Mikroorganismen ausmacht.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum zur Verflüssigung von Biomasse. Daneben umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Art Paenibacillus macerans zur Verflüssigung von Biomasse.
Schließlich umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zur Verflüssigung von Biomasse.
Bevorzugt wird eine Mischung von zwei oder drei der genannten Arten von Mikroorganismen verwendet. Diese kann gegebenenfalls noch durch weitere Arten von Mikroorganismen ergänzt werden, die ebenfalls eine erfindungsgemäße Verflüssigung von Biomasse bewirken.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der durch eines der beschriebenen Verfahren erhaltenen verflüssigten Biomasse zur Herstellung von Biokraftstoff. Bevorzugt wird die durch eines der beschriebenen Verfahren erhaltene verflüssigte Biomasse zur Herstellung von Bioethanol oder Biogas eingesetzt.
Bakterien der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides können mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Methoden aus dem Substrat eines Fermenters isoliert werden. Dabei wird ein geeignetes Substrat aus einem Fermenter in ein Selektionsmedium eingebracht, über längere Zeit kultiviert und schließlich einzelne Kolonien von Mikroorganismen aus dem Selektionsmedium isoliert. Nach Vervielfältigung der daraus erhaltenen mikrobiellen DNA mittels PCR können auf der Basis der DNA Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides ausgewählt werden. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Zur Illustration der Erfindung und zur Verdeutlichung ihrer Vorzüge werden nachfolgend Ausführungsbeispiele angegeben. Die Ausführungsbeispiele sollen im Zusammenhang mit den Figuren 1 bis 4 näher erläutert werden. Es versteht sich von selbst, dass die im Zusammenhang mit den Ausführungsbeispielen gemachten Angaben die Erfindung nicht beschränken sollen. Es zeigen
Fig. 1 : einen Substratfließtest zur Untersuchung des Ausmaßes der Verflüssigung von Gärsubstrat mit Maissilage als Ausgangssubstrat;
Fig. 2: einen Substratfließtest zur Untersuchung des Ausmaßes der Verflüssigung von Gärsubstrat mit Stroh als Ausgangssubstrat;
Fig. 3: einen Substratfließtest zur Untersuchung des Ausmaßes der Verflüssigung von Gärsubstrat mit Grassilage als Ausgangssubstrat und
Fig. 4: einen Substratfließtest zur Untersuchung des Ausmaßes der
Verflüssigung von Gärsubstrat mit Maissilage als Ausgangssubstrat.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Bakterien der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und der Art Clostridium sporosphaeroides wurden erfolgreich aus dem Substrat eines Fermenters isoliert. Die Isolation der Mikroorganismen erfolgte jeweils mit Hilfe eines Selektionsmediums, das Carboxymethylcellulose als einzige Kohlenstoffquelle beinhaltete. Carboxymethylcellulose besitzt sehr große Ähnlichkeit mit der in Substraten von Anlagen zur Verflüssigung von Biomasse enthaltenen Cellulose und weist zudem durch die Verknüpfung der Hydroxylgruppen mit Carboxymethylgruppen (-CH2-COOH-) eine verbesserte Löslichkeit in wässrigem Medium auf. Das zur Selektion von Clostridium sartagoformum, Paenibacillus macerans und Clostridium sporosphaeroides eingesetzte Medium wurde mit N2 und CO2 begast, damit die Selektion unter anaeroben Bedingungen erfolgen konnte. Enthaltener Restsauerstoff wurde anschließend mit Hilfe von 0,5 g/l Na2S reduziert und das Medium schließlich autoklaviert (20 Min. bei 1210C).
Das Selektionsmedium (DSMZ Medium 520 plus 1 % CMC und 0,2 % Hefeextrakt) wurde anschließend mit dem Überstand von Material aus einem Fermenter beimpft. Nach einer einwöchigen Kultivierung bei 400C zeigten sich bei mikroskopischer Analyse einzelne Stäbchen. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte durch den Ausstrich auf anaeroben Carboxymethylcellulose-Platten. Das Zellmaterial der gewachsenen Kolonien diente zur Vervielfältigung der mikrobiellen DNA mittels der Colony-PCR Methode nach einem Standard-Programm. Nach der Sequenzanalyse der Kolonien erbrachte der phylogenetische Vergleich der daraus generierten Sequenzdaten mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov, dass die erhaltenen Sequenzen den Organismen Clostridium sartagoformum, Paenibacillus macerans bzw. Clostridium sporosphaeroides als nächsten Verwandten zugeordnet werden können.
Der Anteil von Bakterien der Art Clostridium sporosphaeroides oder Paenibacillus macerans oder Clostridium sartagoformum wurde durch „whole cell hybridization" nach der in Amann et al. (1995, Microbiol. Rev. 59, 143-169) beschriebenen Methode bestimmt. Als Sonde zum „Fishing" wurde für Clostridium sporosphaeroides ein markiertes Oligonukleotid mit der Sequenz Cy3- CCACAGCTCTCACGCCCG (angegeben in 5"→ 3"Richtung) verwendet, für Paenibacillus macerans ein markiertes Oligonukleotid mit der Sequenz Cy3- GCAACCCGAACTGAGACC (angegeben in 5"→ 3"Richtung) und für Clostridium sartagoformum ein markiertes Oligonukleotid mit der Sequenz Cy3- CTTCATGCGAAAATGTAA (angegeben in 5"→ 3" Richtung). Die Oligonukleotide trugen als Markierung jeweils am 5"-Ende den Farbstoff Indocarbocyanin (Cy3). Die angegebenen markierten Oligonukleotide können auch als Hybridisierungssonden verwendet werden, um die Anwesenheit der entsprechenden Arten von Mikroorganismen in einer Probe nachzuweisen. Versuche mit Reinkulturen der Mikroorganismen Clostridium sartagoformum, Paenibacillus macerans und Clostridium sporosphaeroides sowie mit Mischkulturen zeigten, dass der Zusatz zum stark zähflüssigen, viskosen Carboxymethylcellulose-haltigen Selektionsmedium zu einer sukzessiven Verflüssigung des Mediums führt.
Bakterien der Art Clostridium sartagoformum wurden mit den Stämmen Clostridium sartagoformum SBG1 und Clostridium sartagoformum SBGIa, Bakterien der Art Clostridium sporosphaeroides mit dem Stamm Clostridium sporosphaeroides SBG3 und Bakterien der Art Paenibacillus macerans mit dem Stamm Paenibacillus macerans SBG2 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt. Clostridium sartagoformum SBG1 trägt die Hinterlegungsnummer DSM 19861 , Clostridium sartagoformum SBGIa die Hinterlegungsnummer DSM 22578, Clostridium sporosphaeroides SBG3 die Hinterlegungsnummer DSM 22577 und Paenibacillus macerans SBG2 die Hinterlegungsnummer DSM 22569.
Die Verflüssigung eines Gärsubstrates mit hohem Trockensubstanzgehalt bzw. die Aufrechterhaltung einer flüssig-breiigen Konsistenz in einem Nassgärverfahren ist essentiell, um einen reibungslosen und kostengünstigen Ablauf des technischen Prozesses zu gewährleisten. Teilweise kommt es im kontinuierlichen Betrieb auch zu einer zunehmenden „Verschleimung" des Fermenterinhalts, was sich ebenfalls negativ auf den Prozess der Biokraftstofferzeugung auswirkt.
Während einer Verflüssigung von Biomasse in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 I unter realistischen Anlagenbedingungen wurde über einen Zeitraum von mehreren Monaten der zeitliche Verlauf der Viskosität bestimmt. Die Verflüssigung der Biomasse lief unter ansonsten identischen Bedingungen einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und jeweils unter mehrfacher Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans oder der Art Clostridium sporosphaeroides. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Mikroorganismen der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans oder der Art Clostridium sporosphaeroides eine Verringerung der Viskosität des Substrats auf weniger als 2/3 des ursprünglichen Wertes bewirkt. Durch visuelle Inspektion des Fermenterinhalts konnte festgestellt werden, dass eine „Verschleimung" des Gärsubstrats ebenfalls in viel geringerem Maße auftrat.
Der Effekt, den die Zugabe von Mikroorganismen auf die Konsistenz des Gärsubstrates ausübt, wurde mit einem Test bestimmt, in dem das Fließverhalten von Substratproben auf einer schiefen Ebene gemessen wurde (Substratfließtest).
Ausgangsmaterial für den nachfolgend im Zusammenhang mit der Figur 1 diskutierten Substratfließtest war Material aus einer Biogasanlage mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 8-12 %, die mit Maissilage betrieben wurde. Jeweils 500 ml Material aus einem Fermenter wurde in 1 I Schott-Flaschen abgefüllt und 1 Tag lang bei 40 0C inkubiert. Anschließend wurde jeweils die Bakterienzellmasse aus einer 500 ml Vorkultur (entspricht ungefähr 4 x 1011 Zellen) von Clostridium sporosphaeroides SBG3, Clostridium sartagoformum SBGIa, Paenibacillus macerans SBG2 oder einer Mischung der drei Bakterien zu gleichen Anteilen in 1 ml Medium resuspendiert, zugegeben und für weitere 5 Tage bei 40 0C unter Schütteln inkubiert. Für die Kontrollprobe wurde nur 1 ml Medium zugegeben. Jeweils 1 ,3 g der Proben wurden an den Startpunkt der schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala die Fließgeschwindigkeit (zurückgelegte Strecke pro 10 min) der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Die Ergebnisse des Substratfließtests sind in der Figur 1 dargestellt.
In der Figur 1 sind folgende Spuren gezeigt: Spur 1 : Kontrolle ohne Zugabe von Mikroorganismen; Spur 2: Clostridium sartagoformum SBGIa; Spur 3: Clostridium sporosphaeroides SBG3; Spur 4: Paenibacillus macerans SBG2; Spur 5: Mischung aus Clostridium sartagoformum SBGIa, Clostridium sporosphaeroides SBG3 und Paenibacillus macerans SBG2 zu gleichen Teilen. Figur 1A zeigt die Spuren direkt nach dem Auftrag der Proben, Figur 1 B nach 2 min. und Figur 1 C nach 18 min.
Es zeigte sich, dass die Viskosität des Fermenterinhalts durch die Zugabe von lebenden Bakterien des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 sehr stark abnahm, während die Zugabe der Organismen Clostridium sartagoformum
SBGIa und Paenibacillus macerans SBG2 ebenfalls einen deutlichen, aber weniger ausgeprägten Effekt bewirkten. Auch durch den Zusatz einer Mischung der 3 Mikroorganismen konnte eine signifikante Verflüssigung des Substrates erzielt werden.
In einem weiteren Versuch konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von toten Zellen (totautoklaviert) praktisch keinen Effekt bewirkte. Eine visuelle Inspektion der Proben ergab auch, dass bei Zusatz lebender Zellen des Stammes Clostridium sporosphaeroides SBG3 der Anteil schleimiger Substanzen abnahm. Überraschenderweise bewirken die zugesetzten Bakterien auch bei Substrat, das schon einen Fermenter und damit einen durch Mikroorganismen bewirkten Fermentierungsprozess durchlaufen hat, noch eine weitere Verflüssigung des Fermenterinhalts. Dies bedeutet, dass in einem Fermentierungsprozess ohne externe Zugabe von Mikroorganismen das Substrat nicht vollständig abgebaut wird, sondern zusätzliches energetisches Potential im dem Gärsubstrat vorhanden ist, welches durch den Zusatz der erfindungsgemäßen Mikroorganismen genutzt werden kann.
Ausgangsmaterial für weitere Substratfließtests waren die Substrate Grassilage, Rindergülle und Stroh. Die Grassilage wies einen Gehalt an organischer Trockensubstanz (oTS) von 18,5 %, Stroh von 85,0 % und Rindergülle von 4,9 % auf. Jeweils 25 ml Biomasse aus einem Nachgärer der Biogasproduktion (oTS zwischen 6 % und 10 %) wurden für die Versuchsansätze in 50 ml Plastikgefäße abgefüllt, mit jeweils 5 g Grassilage oder 1 g Stroh als Substrat versetzt und 1 Tag lang bei 40 0C inkubiert. Rindergülle als Substrat wurde direkt eingesetzt (je 25 ml) ohne sie mit Biomasse aus einem Nachgärer zu vermischen. Anschließend wurden jeweils Bakterien aus einer Vorkultur in einer Menge von 6 x 1010 Zellen pro Versuchsansatz für Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides, bzw. je 3 x 1010 Zellen für eine Mischung zu gleichen Teilen aus den beiden Bakterienspezies zugegeben und die Versuchsansätze für weitere 5 Tage bei 40 0C unter Schütteln inkubiert. Als Kontrollproben mit toten Bakterienzellen wurden jeweils dieselben Mengen an totautoklavierten Bakterien (20 min bei 121 0C) zugegeben, die Versuchsansätze jedoch genauso inkubiert. Für die Kontrollen ohne Bakterienzusatz wurde statt der Bakterienzellen die entsprechende Menge Wasser zugegeben. Jeweils 1 ,3 g des Probenmaterials aus den Versuchsansätzen wurden an den Startpunkt einer schiefen Ebene aus Metall gesetzt und auf einer cm-Skala (in den Abbildungen sichtbar als kleine dunkle Striche) die Fließgeschwindigkeit der jeweiligen Proben abgelesen, die ein Maß für die Verflüssigung bzw. die Viskosität des Gärsubstrates darstellt. Die Ergebnisse der Fließtests sind in den Figuren 2, 3 und 4 dargestellt.
In der Figur 2 ist das Ergebnis der Verflüssigung von Stroh als Ausgangssubstrat für die Biokraftstoffherstellung dargestellt. Es sind folgende Spuren gezeigt: Spur 1 : Kontrolle ohne Zugabe von Mikroorganismen; Spur 2: Clostridium sartagoformum; Spur 3: Mischung aus Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zu gleichen Teilen; Spur 4: Clostridium sporosphaeroides ; Spur 5: Kontrolle ohne Zugabe von Mikroorganismen; Spur 6: Clostridium sartagoformum, tote Zellen; Spur 7: Mischung aus Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zu gleichen Teilen, tote Zellen; Spur 8: Clostridium sporosphaeroides, tote Zellen. Figur 2A zeigt die Spuren direkt nach dem Auftrag der Proben, Figur 2B 5 min nach dem Probenauftrag.
Es zeigte sich, dass die Viskosität der Stroh haltigen Gärsubstrate durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Arten Clostridium sporosphaeroides und Clostridium sartagoformum sowie einer Mischung der beiden Arten stark abnahm (Spuren 2, 3, 4), wobei die Viskositätsabnahme in den Proben, die Clostridium sartagoformum enthielten (Spur 2 und 3) etwas stärker war als in der Probe, die nur Zellen der Art Clostridium sporosphaeroides erhalten hatte (Spur 4). Die Zugabe von toten Bakterienzellen der beiden Arten (Spuren 6, 7, 8) bewirkte keinen zusätzlichen Verflüssigungseffekt gegenüber der Kontrollprobe, die nur Wasser enthielt (Spuren 1 , 5). Der Versuch zeigte, dass sowohl Bakterien der Art Clostridium sartagoformum als auch der Art Clostridium sporosphaeroides sowie Mischungen dieser beiden Bakterienarten geeignet sind, strohhaltige Gärsubstrate zu verflüssigen und damit die Viskosität dieser Substrate herunterzusetzen.
In der Figur 3 ist das Ergebnis der Verflüssigung von Grassilage als Ausgangssubstrat für die Biokraftstoffherstellung dargestellt. Es sind folgende Spuren gezeigt: Spur 1 : Kontrolle ohne Zugabe von Mikroorganismen; Spur 2: Clostridium sartagoformum; Spur 3: Mischung aus Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zu gleichen Teilen; Spur 4: Clostridium sporosphaeroides; Spur 5: Kontrolle ohne Zugabe von Mikroorganismen; Spur 6: Clostridium sartagoformum, tote Zellen; Spur 7: Mischung aus Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zu gleichen Teilen, tote Zellen; Spur 8: Clostridium sporosphaeroides, tote Zellen. Figur 2A zeigt die Spuren direkt nach dem Auftrag der Proben, Figur 2B 5 min nach dem Probenauftrag.
Es zeigte sich, dass die Viskosität der Grassilage-haltigen Gärsubstrate durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Arten Clostridium sporosphaeroides und Clostridium sartagoformum sowie einer Mischung der beiden Arten stark abnahm (Spuren 2, 3, 4), wobei die Viskositätsabnahme in der Probe, die die Bakterienmischiung aus Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides enthielt (Spur 3) am stärksten war und bei der Probe, die Bakterien der Art Clostridium sporosphaeroides enthielt (Spur 4), etwas stärker war als in der Probe, die nur Zellen der Art Clostridium sartagoformum erhalten hatte (Spur 2). Die Zugabe von toten Bakterienzellen der beiden Arten (Spuren 6, 7, 8) bewirkte keinen zusätzlichen Verflüssigungseffekt gegenüber der Kontrollprobe, die nur Wasser enthielt (Spuren 1 , 5). Alle Versuchsansätze ohne lebende Bakterien waren auch nach 5 Tagen Inkubation noch sehr viskos und blieben über 5 min an der Startlinie der schiefen Ebene liegen, ohne abzurutschen. Der Versuch zeigte, dass sowohl Bakterien der Art Clostridium sartagoformum als auch der Art Clostridium sporosphaeroides sowie Mischungen dieser beiden Bakterienarten geeignet sind, Grassilage-haltige Gärsubstrate zu verflüssigen. In der Figur 4 ist das Ergebnis der Verflüssigung von Rindergülle als Ausgangssubstrat für die Biokraftstoffherstellung dargestellt. Es sind folgende Spuren gezeigt: Spur 1 : Kontrolle ohne Zugabe von Mikroorganismen; Spur 2: Clostridium sartagoformum; Spur 3 Mischung aus Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zu gleichen Teilen; Spur 4: Clostridium sporosphaeroides; Spur 5: Kontrolle ohne Zugabe von Mikroorganismen; Spur 6: Clostridium sartagoformum, tote Zellen; Spur 7: Mischung aus Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zu gleichen Teilen, tote Zellen; Spur 8: Clostridium sporosphaeroides, tote Zellen. Figur 2A zeigt die Spuren direkt nach dem Auftrag der Proben, Figur 2B 5 min nach dem Probenauftrag.
Es zeigte sich, dass die Viskosität der Rindergülle als Gärsubstrat durch die Zugabe von lebenden Bakterien der Arten Clostridium sporosphaeroides und Clostridium sartagoformum sowie einer Mischung der beiden Arten deutlich abnahm (Spuren 2, 3, 4), wobei die Viskositätsabnahme in der Probe, die die Bakterienmischiung aus Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides enthielt (Spur 3) am stärksten war und bei der Probe, die Bakterien der Art Clostridium sporosphaeroides enthielt (Spur 4), etwas stärker war als in der Probe, die nur Zellen der Art Clostridium sartagoformum enthielt (Spur 2). Die Zugabe von toten Bakterienzellen der beiden Arten (Spuren 6, 7, 8) bewirkte keinen zusätzlichen Verflüssigungseffekt gegenüber der Kontrollprobe, die nur Wasser enthielt (Spuren 1 , 5). Auch die Versuchsansätze mit toten Bakterien sowie Wasser als Kontrollprobe rutschten nach 5 Tagen Inkubation etwas von der Startlinie der schiefen Ebene ab. Dies liegt vermutlich daran, dass reine Rindergülle an sich schon eine große Zahl anaerob lebender Bakterien enthält, die prinzipiell organische Trockensubstanz abbauen. Aus diesem Grund wird Rindergülle häufig auch als Startersubstrat für Biogasanlagen verwendet. Man sieht jedoch auch in diesem Ausführungsbeispiel deutlich die stärkere Verflüssigung, welche zugesetzte Bakterien der Arten Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides bewirken.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Verflüssigung von Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass dem Biomasse-Substrat zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides in Form einer
Kultur von Mikroorganismen zugesetzt wird, wobei der Mikroorganismus zumindest 10"4% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10"2% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 1 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 10% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 50% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 75% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kultur von Mikroorganismen zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zumindest 90% der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht.
9. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reinkultur zumindest eines Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zugesetzt wird.
10. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides dem Biomasse-Substrat als Bestandteil zumindest einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen zugesetzt wird.
11. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Biomasse-Substrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides zwischen 10"4% und 90% der Gesamtzahl an in dem Biomasse-Substrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Biomasse-Substrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus zwischen 10"3% und 50% der Gesamtzahl an in dem Biomasse-Substrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Biomasse-Substrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus zwischen 10"2% und 20% der Gesamtzahl an in dem
Biomasse-Substrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum, der Art Paenibacillus macerans und/oder der Art Clostridium sporosphaeroides in einer Menge zu dem Biomasse-Substrat zugegeben wird, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus zwischen 10"1% und 10% der Gesamtzahl an in dem Biomasse-Substrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht.
15. Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sartagoformum zur Verflüssigung von Biomasse.
16. Verwendung eines Mikroorganismus der Art Paenibacillus macerans zur Verflüssigung von Biomasse.
17. Verwendung eines Mikroorganismus der Art Clostridium sporosphaeroides zur Verflüssigung von Biomasse.
18. Verwendung nach den Ansprüchen 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung von zwei oder drei Arten von Mikroorganismen verwendet wird.
19. Verwendung der durch ein Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 erhaltenen verflüssigten Biomasse zur Herstellung von Biokraftstoff.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die verflüssigte Biomasse zur Herstellung von Bioethanol verwendet wird.
21. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die verflüssigte Biomasse zur Herstellung von Biogas verwendet wird.
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