CN107208035B - 含油酵母变体、其获得方法及其用于脂质生产的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及物种Rhodosporidium azoricum的含油酵母变体，其特征在于在已测定的条件下，相对于相同物种的野生型菌株而言，具有更高的生物质产量和细胞内脂质累积，从而可用于更高级的生物燃料的生产。本发明还涉及一种方法，通过该方法得到物种Rhodosporidium azoricum的所述含油酵母变体。本发明进一步涉及通过物种Rhodosporidium azoricum的含油酵母的所述变体菌株进行脂质生产。

Description

含油酵母变体、其获得方法及其用于脂质生产的用途
本发明涉及生物技术领域。具体而言，本发明涉及物种Rhodosporidium azoricum的含油酵母变体，其特征为相对于相同物种的野生型菌株而言，在确定的条件下具有更高的生物质产量和细胞内脂质累积。
此外，本发明涉及获得物种Rhodosporidium azoricum的所述含油酵母变体的方法。
本发明进一步涉及通过物种Rhodosporidium azoricum的所述含油酵母变体进行脂质的生产。
如此获得的脂质可以有利地用作合成中间体，特别是在所谓的“绿色化学”领域中或者在生物燃料生产(例如“生物柴油”或“绿色柴油”)中，其可以原样使用，或者在与其他发动机燃料的混合物中使用。
目前，通过微生物工艺的脂质生产是由可再生来源的生产方法的有利的备选方法。与由植物进行脂质提取相比，由经济观点来看，微生物过程更廉价，因为它们能以更容易的方式按规模扩大，它们需要较少的人力，并且它们利用了在低成本的底物上进行快速繁殖的微生物有机体的性质，例如由木质纤维素材料水解得到的衍生物。此外，它们不受气候因素影响，并且不会与为食品目的进行土壤的农业开发形成竞争。
鉴于此，含油酵母是特别有前景的，换言之，其是能够在特定的培育条件下以超过其干重的25％的水平累积脂质(特别是甘油三酯)的酵母。含油酵母用于脂质生产的用途是本领域已知的[Meng X.,Yang J.,Xu X.,Zhang L.,Nie Q.,Xian M.(2009),“Biodieselproduction from oleaginous microorganisms”,Renewable Energy,vol.34,p.1-5；Galafassi S.,Cucchetti D.,Pizza F.,Franzosi G.,Bianchi D.,Compagno C.(2012),“Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeastRhodotorula graminis”.Bioresource Technol.,vol.111,p.398-403]。
但是，已经描述了含油酵母的使用一些局限，这些局限涉及它们代谢控制的机制。已证明含油酵母的一些物种可以累积脂质至高达它们重量的60％，但是这种累积受到培养介质中正常包含的用于促进生物质生产的一些营养物(例如氮、硫和磷源)的高浓度的抑制。事实上，本领域公开了随着这些含油酵母的培养的进展，由于培养介质平衡的碳与氮(C/N)、或者碳与硫(C/S)、或者碳与磷(C/P)之间的摩尔比偏向碳，脂质的胞内累积显著增加[Granger L.-M.,Perlot P.,Goma G.,Pareilleux A.(1993)“Effect of variousnutrient limitations on fatty acid production by Rhodotorula glutinis”.Applied Microbiology and Biotechnology,vol.38(6),p.784-789；Wu S.,Hu C.,JinG.,Zhao X.,Zhao Z.K.(2010)“Phosphate-limitation mediated lipid production byRhodosporidium toruloides”.Bioresource Technol.,vol.101,p.6124-6129；Wu S.,Zhao X.,Shen H.,Wang Q.,Zhao Z.K.(2011),“Microbial lipid production byRhodosporidium toruloides under sulfate-limited conditions”.BioresourceTechnol.,vol.102,p.1803-1807]。
为了克服这种局限，并由此支持在这些酵母细胞中的脂质累积，已研发出在培养介质中提供有限浓度的氮的发酵设置(fermentative set-up)和培养条件[Zhao X.,HuC.,Wu S.,Shen,H.,Zhao Z.K.(2011),“Lipid production by Rhodosporidiumtoruloides Y4using different substrate feeding strategies”,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,vol.38(5),p.627-632；Li Y.,Zhao Z.K.,Bai F.(2007),“High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4infed-batch culture”,Enzyme Microbial Technology,vol.41p.312-317]。
在所引用的文件中，为了对比营养物来源的缺陷对生物质产量的不利影响，作者使用极为费力的发酵过程，其中使用具有确定组成和高成本的培养介质。所有这些都限制了这些过程为工业目的的开发利用。
因此，申请人面临着这样的问题：无论发酵方法及使用得自非所选来源(例如木质纤维素材料的水解产物)的培养介质如何，都能提供能够在细胞内显著累积脂质的含油酵母，使得所述酵母的培育可以获得高产率的脂质，而无需使用费力的且不经济的培养方法。
申请人现在已发现了能够克服现有技术中的局限的含油酵母。
具体而言，本发明涉及一种Rhodosporidium azoricum变体，根据布达佩斯条约于2014年10月10日在Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH-Inhoffenstraβe 7B 38124Braunschweig(Germany)以保藏编号DSM29495进行了保藏，其显示在富含氮源的培养介质中培育时，脂质的细胞内累积产率显著高于Rhodosporidium azoricum相同物种的野生型菌株。
根据第二个方面，本发明涉及用于获得诱变的含油酵母的方法，该方法可以选择变体Rhodosporidium azoricum DSM 29495。该方法可以有利地用于通过随机诱变技术生产并分离含油酵母菌株的超累积菌变体。
本发明的另一个方面涉及通过所述变体Rhodosporidium azoricum DSM 29495的培育而生产脂质的方法。根据本发明的一个优选的实施方案，所述的方法在分批供料发酵罐中实施，其中木质纤维素材料水解的衍生物被用作底物。
就本申请的说明书和所附的权利要求书的目的而言，数值范围的定义总是包含端点，除非另外说明。
就本申请的说明书和所附的权利要求书的目的而言，术语“包含”还包括术语“基本上由……组成”或“由……组成”。
就本发明的目的而言，术语“生物柴油”是指用于柴油发动机的燃料，包括衍生自生物来源的长链脂肪酸的烷基酯(例如甲酯、丙酯或乙酯)。
就本发明的目的而言，术语“绿色柴油”是指用于柴油发动机的燃料，其包括在氢气和至少一种催化剂存在下衍生自生物来源的脂质发生氢化作用或脱氧作用的产物。
就本发明的目的而言，词语“含油酵母”是指如下酵母物种，其包括但不绝对限于以下属的物种：亚罗酵母属,假丝酵母属,隐球菌属,丝孢酵母属,光滑球拟酵母属,油脂酵母属,红酵母属和红冬孢酵母属，并且能够以等于或高于其细胞干重的25％的量累积脂质。
就本发明的目的而言，术语“超累积菌”是指能够以等于或高于其细胞干重的40％的百分率累积脂质的含油酵母变体。
就本发明的目的而言，词语“培育”和“培养”是指在人类控制的条件下微生物细胞进行生长和繁殖的工艺。在通过上述表述定义的工艺中，其由在本发明的一些实施方案下实施的、含油酵母的“发酵”构成。
就本发明的目的而言，词语“培养介质”是指为了支持微生物(例如含油酵母的细胞)生长而制备的液体或凝胶。培养介质可以具有确定的组成(例如“YEPD”介质、“B”介质等)，或者可以衍生自非选择来源的处理，例如废水、市场垃圾或木质纤维素材料的水解产物。
就本发明的目的而言，词语“分批供料系统”是指含油酵母的半连续发酵模式，其可以在达到静止状态前通过将新鲜介质根据预定的参数加入至培养物中来延长细胞生长的时间。
就本发明的目的而言，词语“碳源”、“氮源”、“硫源”和“磷源”分别是指培养介质中包含的基于碳、基于氮、基于硫的物质(例如硫酸盐)和磷(例如磷酸盐)的有机或无机物质或者组合物，微生物可以代谢所述的物质用于得到能量。
就本发明的目的而言，术语“生物质”是指在发酵过程中或者在其他的培养模式下生产的所有细胞。根据本发明的一些实施方案，生物质可以通过离心或微过滤由培养介质中分离。
就本发明的目的而言，术语“木质纤维素材料”和“木质纤维素生物质”是指包含纤维素、半纤维素和木质素的植物来源的复杂结构。由这种材料通过现有技术中已知的化学-物理和酶处理，可以获得糖，其可以在微生物发酵中作为碳源用于生产醇和/或脂质。例如，根据国际专利申请WO 2012/042544中公开的方法，木质纤维素材料在压碎和磨碎后，在使用水蒸气加压的反应器中预处理预定的时间。在结束时，在缓慢解压后，分离富含有半纤维素水解衍生的糖的液相。剩余的固相在加压反应器中经历水蒸气的新处理。在该第二步结束时，反应器中建立的压力被立即释放，导致木质纤维素生物质细胞发生蒸汽爆破，从而解脱木质素和纤维素的结构。然后，将所得的材料，结合之前获得的液相，与酶悬液一起转移至生物反应器中，其中由于之前的预处理而使得所述的酶悬液更易接触所述的材料，由此完成多糖水解的工艺。所得的制备物可以称为“木质纤维素水解产物”。
通过以下的发明详述，本发明的其他特征和益处将变得显而易见。
因此，本发明涉及于2014年10月10日在Leibniz-Institut DSMZ-DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ),Inhoffenstraβe 7B38124Braunschweig(Germany)以保藏编号DSM 29495保藏的含油酵母物种Rhodosporidiumazoricum的变体，其特征为细胞内脂质的累积。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述酵母的特征为，当在富含氮源的培养介质中培养时，细胞内脂质累积的量高于或等于其细胞干重的60％，优选62％至70％。
根据一个优选的实施方案，所述酵母的特征为，当使用木质纤维素材料的水解产物作为营养物来源培养时，优选当所述的底物为得自芦竹(Arundo donax)(常见的甘蔗)的水解产物时，细胞内脂质累积的量高于或等于其细胞干重的40％，优选45％至60％。
变体菌株DSM 29495的基因型通过比较基因组DNA的序列与Rhodosporidiumazoricum的野生型菌株的序列来鉴定，如下文报告的实施例2所述。
发现有124个突变。其中，116个突变在基因组编码区或者在与编码区相邻的区域，因此，它们可能涉及所述编码区的表达和翻译过程(例如启动子或内含子序列)，而8个突变在基因组推定的非编码区中。基于与野生型菌株的转录DNA(或者“转录组”)的比较，可以将这些突变归因于49个基因转录物，观察到其中的一些与涉及泛素化、糖基化、核糖基化、氧化还原辅酶再生(NADH脱氢酶)过程的基因以及一些膜载体的基因有同源性。
不被任何理论所束缚，所述的突变(其中，特别是纯合形式的突变)可以解释变体DSM 29495相对于野生型菌株而言的不同行为，其干预了负责核苷酸辅酶再氧化的酶以及发挥转录或转录后调节器作用的系统，它们可以间接作用于涉及脂质生产的生物合成途径。
在下表I中，报告了相对于野生型菌株而言在变体菌株DSM 29495的基因组DNA中检测到的突变。就各突变而言，显示了所谓的“毗连群”的位置，即在基因组DNA的毗连区之一上的位置，这些毗连群根据它们的核苷酸序列装配时可以实现基因组重建。此外，在表中还显示了：野生型菌株和菌株DSM29495基因组中突变类型(SNV：“单核苷酸改变”，单核苷酸突变；MNV：“多核苷酸改变”，序列中多个核苷酸突变；Ins：一个或多个核苷酸的插入；Del：一个或多个核苷酸的缺失)，所涉及的核苷酸数，改变的核苷酸或多个核苷酸(突变、插入或缺失)，在基因组中以单一拷贝(纯合的)或更多拷贝(杂合的)存在的基因中观察到突变的迹象。
表I
Figure BDA0001338279350000071
Figure BDA0001338279350000081
Figure BDA0001338279350000091
Figure BDA0001338279350000101
Figure BDA0001338279350000111
通过多个试验来检验与野生型菌株相比而言变体Rhodosporidium azoricum DSM29495的脂质累积能力，其中一些试验在下文报告的实施例中描述，其中测定发酵过程中的生物质产量和累积的脂质的量。
本发明的另一个方面涉及用于获得含油酵母变体的方法，其优选地选自包括亚罗酵母属的物种,假丝酵母属的物种,隐球菌属的物种,丝孢酵母属的物种,光滑球拟酵母属的物种,油脂酵母属的物种,红酵母属的物种和红冬孢酵母属的物种，所述的方法包括以下步骤：
i.将含油酵母菌株的细胞暴露于诱变剂，从而在基因组DNA中产生随机突变；
ii.将经过诱变剂处理的细胞接种于培养介质中并培育，所述的培育介质的特征为存在浓度为20g/L至100g/L、优选为30g/L至50g/L的至少一种碳源，并且其中存在至少一种氮源，其浓度优选为3g/L至40g/L、更优选为5g/L至20g/L；
iii.将特征为较低密度的酵母细胞与细胞培养物分离。
上述方法的所有步骤优选在无菌条件下实施，以避免培养物被环境中存在的微生物污染，并且更优选的是以所述的顺序实施。
根据一个优选的实施方案，所述方法的培育步骤ii可以在10℃至40℃、更优选为20℃至30℃的温度下实施16-48小时之间的一定时间。
根据一个优选的实施方案，所述方法的步骤iii可以包括以下子步骤：
a)由培养物收集样品，并加入适量的至少一种增稠剂；
b)在低速下离心如此获得的细胞悬液；
c)收集离心上清液的上部级份，以便将特征为较低密度的细胞与细胞培养物的其他部分分离；
d)在培养介质中接种在所述方法的子步骤c)中分离的上清液级份，并培育，其中所述培养介质的特征为存在浓度为20g/L至100g/L、优选为30g/L至50g/L的至少一种碳源，并且其中存在至少一种氮源，优选浓度为3g/L至40g/L、更优选为5g/L至20g/L；
e)重复a)至d)的子步骤至少2次，优选至少5至20次；
f)分离单个突变体集落。
用于本发明的目的的合适的增稠剂为适用于通过离心创建密度梯度并且与经处理的微生物的生存相容的产物及产物的混合物。此类产物优选地包括多羟基化合物，例如甘油、糖、山梨醇和右旋糖苷，所述的化合物根据本领域已知的方法用于通过密度梯度离心来分离原核细胞、真核细胞以及它们的亚细胞成分。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，上述子步骤a)可以通过将山梨醇作为增稠剂以高达1M至3M的浓度加入至培养物样品中来实施。
值得注意的是，本发明的此优选实施方案的方法利用了相对于累积较少量脂质的细胞而言累积了大量脂质的细胞的较低密度的特征来选择含油酵母菌株的变体，其中鉴于含油酵母菌株的变体能够在富含碳源的所述介质上生长和累积、以及相对于野生型菌株细胞中的情况而言具有更高程度的其他营养物的事实，该变体不同于野生型的菌株。
根据一个优选的实施方案，所述方法的子步骤d)的培育可以在10℃至40℃的温度下、更优选在20℃至30℃的温度下实施16至48小时之间的一段时间。
单个的突变体集落的分离[子步骤f]可以通过现有技术中已知的过程来实施，例如系列稀释，或者将细胞悬液分布在包含琼脂或其他固化剂的介质上。
根据本发明的一个优选的实施方案，使用的含油酵母可以为Rhodosporidiumazoricum。
根据本发明的另一个优选的实施方案，通过使用所述的方法而获得的含油酵母变体可以为菌株Rhodosporidium azoricum DMS 29495的变体。
事实上，需要指出的是，所述的方法被有利地用于获得菌株Rhodosporidiumazoricum DMS 29495的变体。
上述方法可以有利地用于选择变体，该变体在不仅富含氮源、而且还富含磷源和硫源(无机的和有机的)、以及其他营养物成份的介质中累积脂质(根据现有技术的教导，类似于氮源存在时发生的情况，当这些营养物成份以适合于酵母培育的浓度存在时、甚至刺激生物质生长的浓度存在时，显示对微生物内脂质累积过程有抑制作用)。
根据本发明的一个优选的实施方案，在所述的方法中使用的培养介质中，所述的至少一种氮源可以被浓度为3g/L至40g/L、优选5g/L至20g/L的至少一种硫源(无机的或有机的)替代。
根据本发明的一个优选的实施方案，在所述的方法中使用的培养介质中，所述的至少一种氮源可以被浓度为3g/L至40g/L、优选5g/L至20g/L的至少一种磷源(无机的或有机的)替代。
根据所述方法的诱变过程可以根据用于上述目的的任意一种已知的技术来实施。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，诱变工艺可以通过物理方式，通过将所述的酵母菌株暴露于波长为230nm至260nm的紫外线辐射(UV)来实施。
通过暴露于UV辐射的诱变可以如现有技术所述来实施[Winston F.(2008)“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley&Sons]，例如，其可以通过将在Petri平皿中琼脂固化的介质上放置的酵母细胞暴露于放置在距Petri平皿10cm至50cm距离的UV辐射源(通过至少一个灯来代表，功率为8至15W，波长为230nm至260nm)5秒至5分钟的时间来实施。
根据本发明的另一个优选的实施方案，根据所述方法的诱变过程可以通过化学方法实施，即，将浓度为0.1％至10％(vol/vol)的甲磺酸乙酯(EMS)加入至接种有所述的待处理菌株的培养介质中，并在所述的诱变剂存在下将培养物保持10分钟至12个小时的时间，优选为1小时至8小时。
如本领域的技术人员已知的那样，可以通过测量培养物本身在660nm下的混浊度或光学密度(光学密度,OD660)而获得培养物中的细胞数量的指示；因此，为了实际目的，根据OD660来定义培养物中的测定细胞量或此类培养物的体积是有利的。
根据本发明的一个优选的实施方案，在所述方法的子步骤a)过程中收集的培养物的量可以相当于50OD660至200OD660的光密度，优选为80OD660至150OD660。
应该注意的是，在所述方法的子步骤a)中，作为将增稠剂直接加入收集的培养物中的一种备选方法，可以通过离心回收样品细胞，将它们再次悬浮于新鲜培养介质中，并且可以将所需量的增稠剂加入至所述的悬液中。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述方法的子步骤b)中的离心可以在500g至1000g的加速下进行1至5分钟的时间。
应该注意的是，通过将所述方法的a)至d)步骤重复多次，可以获得多代(达到几十代的级别)的突变体菌株，这增加了脂质累积不受限于与培养条件有关的蛋白质表达的再调节的可能性，而且其是印记在基因水平的行为。此外，按照这种方式，促进了具有更有效超累积菌的可能突变体群的富集。
使用上述方法获得的变体菌株Rhodosporidium azoricum DSM 29495可以有利地用于在促进生物质生产的条件下通过发酵工艺进行脂质的微生物生产。
因此，通过培育含油酵母变体Rhodosporidium azoricum DSM 29495生产脂质的方法是本发明的另一个实施方案，所述的方法包括以下步骤：
i.制备培养介质，其包含：
○浓度为20g/L至100g/L、优选30g/L至50g/L的至少一种碳源；
○至少一种氮源，其浓度优选为3g/L至40g/L、更优选为5g/L至20g/L；
ii.在所述的培养介质中培育所述的含油酵母变体；
iii.将所述的酵母细胞与所述的培养介质分离；
iv.提取在所述的酵母细胞内累积的细胞内脂质。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述的培养可以在10℃至40℃、优选20℃至30℃的温度下实施。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述的培养可以实施50小时至200小时的时间，优选90小时至150小时的时间。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述的培养可以通过注入无菌空气并且通过在600rpm至900rpm之间(采用通气量调节)变化的搅拌在需氧条件下实施，从而将溶氧浓度(DO2)保持为等于饱和值的30％。
根据本发明的一个优选的方面，所述的培养可以在4.5至7.0的pH值下实施，优选为5.0至6.5。为了保持pH在所需的范围内，可以将至少一种无机碱(例如NaOH,KOH,Ca(OH)2,Mg(OH)2或它们的混合物，优选为KOH)的水性溶液或者至少一种无机酸(例如H3PO4,H2SO4,HCl或它们的混合物，优选为H2SO4)的水性溶液加入至用于发酵的培养介质中，其用量得以获得所需的pH。
在发明的一个优选的实施方案中，所述的培养可以由量为介质总体积的1％至5％(vol/vol)的接种物开始实施，其中所述的接种物得自所述的酵母菌株的之前的培养物，其是在相同的介质中培养6至24小时得到的。
所述的之前的培养物可以由早先的培养物接种而来，或者可以由所述在-80℃下保持在包含15％(vol/vol)甘油的悬液中的酵母菌株样品开始而接种的。
根据本发明的一个优选的实施方案，培养介质可以包含葡萄糖作为碳源，(NH4)2SO4作为氮源。
根据本发明的一个优选的实施方案，根据所述方法的培养介质可以包含木质纤维素水解产物作为碳源。
根据本发明的另一个优选的实施方案，所述的木质纤维素水解产物可以衍生自以下的处理：
a.衍生自明确为能源用途而培养的培养物的产物，例如芦竹属、芒属、黍属的物种，包括衍生自所述的产物或由它们的处理而得到的泔脚、残余物和废物；
b.衍生自农业的产物，例如飞廉属、银胶菊属、玉米属、大豆属、棉属、亚麻属、芸苔属、甘蔗属、油棕属、椰子属的物种，包括衍生自所述的产物或由它们的处理而得到的泔脚、残余物和废物；
c.衍生自造林或林业的产物，包括衍生自所述的产物或由它们的处理而得到的泔脚、残余物和废物；
d.用于人类营养或畜牧学的食品和农业产物的泔脚；
e.造纸工业残余物，非化学处理的；
f.衍生自城市固体废物的再循环收集的废物(例如植物来源、纸的废物)；
g.藻类，例如微藻类或大型藻类，特别大型藻类。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述的木质纤维素水解产物可以衍生自物种芦竹(常见的甘蔗)的样本的处理，包括衍生自它们的处理的泔脚、残余物和废物。
根据本发明的另一个优选的实施方案，可以通过水热处理(“蒸汽喷发”)和随后的酶水解来获得芦竹(常见的甘蔗)的所述木质纤维素水解产物。
在脂质生产进入发酵罐的试验过程中，根据所述方法的培养可以以“分批供料”的方式实施。
根据本发明的一个优选的实施方案，根据所述的方法实施的培养(在接种后生长时间为12小时至24小时)可以通过加入葡萄糖的水性溶液达到介质中25g/L至50g/L葡萄糖的稳定浓度，以“分批供料”的方式进一步实施，优选实施90小时至200小时、更优选为100小时至150小时的时间。
在一个优选的实施方案中，根据所述的方法实施的培养(在接种后生长时间12小时至24小时)可以通过加入木质纤维素水解产物达到介质中25g/L至50g/L总糖的稳定浓度，以“分批供料”的方式进一步实施，优选实施90小时至200小时、更优选为100小时至150小时的时间。
培养物中的细胞生长可以通过测定660nm(OD660)下培养物样品的混浊度或光学密度(OD)的分光光度法来测量。
在培养结束时，在发酵中使用的含油酵母Rhodosporidium azoricum DSM 29495的变体菌株细胞可以通过本领域已知的方法由培养介质分离，例如过滤、加压过滤、微过滤或超滤、离心。
为了进一步浓缩分离后获得的含油细胞生物质的水性悬液，所述的生物质水性悬液可以进一步经历离心。所述的离心可以在3000rpm至9000rpm的转速下、优选在4000rpm至8000rpm的转速下实施5分钟至30分钟、优选15分钟至25分钟。
所生产的生物质可以以克/升培养物来测量，测定以预定间隔和在发酵结束时收集的已知量的培养物样品的酵母细胞干重。
为了回收脂质，根据现有技术已知的以及例如在国际专利申请WO2014/102254中所述的操作，对所获得的包含含油酵母细胞的生物质进行细胞裂解，其中包括例如加压反应器中的热处理、使用匀浆器的机械处理或者使用微波的处理。
在所述的细胞裂解结束时，根据现有技术已知的以及例如在国际专利申请WO2014/102254中所述的操作，通过使用极性或非极性有机溶剂的萃取，由所得的悬液回收脂质。
可以通过直接在酵母细胞悬液的样品(例如使用硫-磷-香兰素，例如Totallipids-sulpho-phospho vanillin”kit marketed by Spinreact S.A.U.,Ctra.SantaColoma,7E-17176St.Esteve d’en Bas(GI),Spain)中采用现有技术已知的比色方法来测量培养物中细胞的脂质生产。
此外，可以对使用有机溶剂的混合物(例如氯仿:甲醇2:1,vol/vol[Folch J.,Lees M.,Sloan-Stanley G.H.(1957),“A simple method for the isolation andpurification of total lipids from animal tissues”,J.Biol.Chem.,vol.226,p.497-509]或者使用正己烷:异丙醇3:2vol/vol[Hara A.,Radin N.S.(1978),“Lipidextraction of tissues with a low-toxicity solvent”,Anal.Biochem.,vol.90,p.420-426])提取的级份，使用比重法由冻干的生物质的样品测定所生产的脂质的量。
为了评估变体Rhodosporidium azoricum DSM 29495的发酵相对于野生型菌株的脂质累积的性能，可以通过上述列举的方法测定在培养结束时的生物质干重(以g/L表示)和脂质的量(以g/L表示)，并且测量这两个参数之间的百分率。
应该注意的是，在根据本发明所请求保护的方法的发酵条件下，物种Rhodosporidium azoricum DSM 29495的变体相对于相同物种的野生型菌株而言，在生物质(增加13％至58％)和累积的脂质(增加37％至65％)方面有更高的产率。
根据现有技术的操作，通过层析技术(例如气相色谱或高效液相色谱(HPLC))来分析脂质级份。
通过所述的分析方法，检测到在含油酵母细胞中累积的脂质中90％为甘油三酯，优选具有8至24个碳原子的脂肪酸(软脂酸、硬脂酸、油酸和α-亚油酸)的甘油酯。
可能存在的其他脂质为：磷脂、单甘油酯、甘油二酯、游离脂肪酸或它们的混合物。
根据本发明的方法目的而获得的脂质可以有利地用作合成中间体，特别是在所谓的“绿色化学”领域中。此外，可以在至少一种醇(具有1至4个碳原子，优选为甲醇或乙醇)和至少一种酸或碱催化剂存在下对它们进行酯基转移反应，从而产生甘油和烷基酯，特别是甲基酯或乙基酯(“生物柴油”)。
备选地，可以在氢和至少一种催化剂存在下对所述的脂质进行氢化作用/脱氧作用，从而产生“绿色柴油”。氢化作用/脱氧作用工艺是现有技术中已知的，并且在例如欧洲专利申请EP 1,728,844中公开。
为了实现本发明并且更好地说明本发明，下文报告一些非限定性实例。
实施例1(变体Rhodosporidium azoricum DSM 29495的获得)
接着报告用于获得物种Rhodosporidium azoricum的野生型菌株的变体菌株的方法的实践实施例，通过该方法，得到了保藏在Leibniz-Institut DSMZ的变体，保藏编号为DSM 29495。
在本实施例中，通过UV辐射得到随机诱变。
将物种Rhodosporidium azoricum的野生型菌株的细胞样品接种于“YEPD”介质(酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L)中，直至达到生长指数期(10OD660)。此后，通过在1500g下离心5分钟来收集细胞，在无菌水中洗涤，然后再次悬浮于1mL无菌水中，并放置在空的Petri平皿的底部。
将放置在平皿上的细胞暴露于放置在30cm距离的紫外辐射源(以15瓦的UV灯表示，波长254nm)20秒的时间，以便得到10％的残余存活率。此后，由平皿上收集细胞，并用于接种包含(NH4)2SO4 5g/L的介质“B”(酵母提取物1g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L,NaCl0.01g/L CaCl2·2H2O 0.01g/L)中酵母细胞的液体培养物，并将此类培养物在30℃下培养24小时。
此外，收集量相当于100OD660的培养物，并且将通过离心回收的细胞再次悬浮于5mL介质“YEPD”中。向该量的培养物中加入2M山梨醇的5mL无菌溶液，并将如此获得的细胞悬液在500g下离心1分钟。离心后，由上清液的上部级分无菌收集1mL悬液，由此方式分离出与不具有脂质(或者脂质累积量较低)，因此位于上清液的较低部分和离心沉淀物中的那些细胞相比具有最高脂质含量、较低密度的那些细胞。所收集的样品用于接种新的液体培养物。将这种培养系列和通过离心在密度梯度中分离较低密度级份重复8个循环，由此培养物在包含琼脂的“YEPD”介质上铺板，以便分离单个酵母集落。
实施例2(变体Rhodosporidium azoricum DSM 29495的基因型表征)
在本实施例中，通过测定基因组DNA序列，并且与相同酵母物种的野生型菌株的基因组DNA序列比较来进行突变的生物信息学分析，由此描述变体Rhodosporidium azoricumDSM 29495的鉴定过程。
由在介质“YEPD”(酵母提取物10g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L)中进行一夜的2种菌株(变体DSM 29495和野生型菌株)的培养物提取基因组DNA，并使用市售可得的试剂盒DNeasy Blood&Tissue kit(得自Quiagen(编号69504))根据生产商提供的说明书进行纯化。
在通过电泳检查纯度和完整度后，使用试剂盒“TruSeq DNA LibraryPreparation Kit”(Illumina)，根据试剂盒具有的方案，分别处理各菌株的基因组DNA。简言之，对DNA进行处理，从而得到大小为200bp至400bp的片段，然后与试剂盒提供的寡核苷酸衔接子的3’和5’末端结合，并使用相同的寡核苷酸作为引物通过“Polymerase ChainReaction”(PCR)对它们进行扩增。对基因扩增的产物进行定量，并使用装置Bioanalyzer2100(Agilent Technology)检查。通过使用HiSeq2500测序仪(Illumina)测定所获得的各片段的DNA序列，并基于“phred”值优化所得的序列[Ewing B.,Hillier L.,Wendl M.C.,Green P.(1998),"Base-calling of automated sequencer traces usingphred.I.Accuracy assessment".Genome Res.8(3):175-185]。对总长度22,722,315bp而言，序列分析鉴定了大小为120至440,000bp的893个连续区域(“contig”)。该值符合遗传上类似于红冬孢酵母属的酵母的基因组DNA的大小，因此相信所得的文库代表了Rhodosporidium azoricum DSM 29495和相应的野生型菌株的完整基因组。通过使用软件“Map Reads to Reference”和“Quality-based Variant Detection”(CLCbio)来相互比较这2个基因组DNA的序列。
所鉴定的突变是通过证明它们在2个测序方向上都存在并通过“phred”值测定精确度而证实的。
总体而言，在Rhodosporidium azoricum DSM 29495变体的基因组DNA中发现了124个突变(包括取代、缺失和核苷酸插入)，报告于表I中。
实施例3(烧瓶中的培养)
在本实施例中评估酵母变体菌株Rhodosporidium azoricum DSM29495在富含氮源的介质中的生长和脂质累积方面与相同物种的野生型菌株相比的性能。在2个500mL的无菌烧瓶中，放入包含(NH4)2SO4 5g/L的100mL培养介质“B”(酵母提取物1g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4·7H2O0.05g/L,NaCl 0.01g/L CaCl2·2H2O 0.01g/L)，并通过加入缓冲剂MES 0.1M将其pH调节至pH6.0。
在2个烧瓶中，使用变体酵母菌株Rhodosporidium azoricum DSM29495或相同物种的野生型菌株的培养物接种培养介质，这2个物种均在介质“B”中预先培养了大约24小时，其又是由接种保持在-80℃下包含甘油15％(vol/vol)的悬液中的2个酵母菌株的样品而来。设定接种的培养物的量，从而最初获得0.1OD660。
在大约70小时后，在90小时后，然后在生长114小时后，由两个烧瓶收集培养物样品，并且对此类样品测定生物质(以g/L培养物表示细胞的干重)，以及累积的脂质的量(以培养物中g/L的脂质浓度，以及脂质重量与总细胞干重的百分比表示)。
分析结果报告于表II中。
表II
Figure BDA0001338279350000211
实施例4(“分批供料”培养)
在本实施例中评估在“分批供料”的发酵中，与相同物种的野生型菌株相比酵母变体菌株Rhodosporidium azoricum DSM 29495的生长和脂质累积。
为了制备发酵接种物，将100mL“YEPD”介质(酵母提取物1g/L,蛋白胨10g/L和葡萄糖20g/L)放置于2个500mL烧瓶中。
然后，使用变体酵母菌株Rhodosporidium azoricum DSM 29495或相同物种的野生型菌株的培养物接种培养介质，这2个物种均是在介质“B”中预先培养了大约12小时，其又是由保持在-80℃下包含甘油15％(vol/vol)的悬液中的这2个酵母菌株的样品接种而来。设定接种的培养物的量，从而最初获得0.1OD660。
在搅拌条件下，将培养物在30℃下温育24小时。
所得的细胞悬液用于分别接种20L发酵罐，其中放入6L介质，其包含葡萄糖50g/L,玉米浆固体5g/L,酵母提取物2g/L,KH2PO4 6g/L,MgSO4·7H2O 0.3g/L,NaCl 0.06g/L，CaCl2·2H2O 0.06g/L和(NH4)2SO4 5g/L。
用于各菌株的接种物的量为获得大约6L具有0,4OD660的细胞悬液的量。对于“分批供料”模式中的随后的生长阶段，根据2种酵母菌株的碳源的消耗动力学，向各发酵罐供入葡萄糖600g/L的水性溶液，从而保持培养物中葡萄糖的稳定浓度为30g/l。
生长在通过气流得到的需氧条件下、以600至900rpm的可变搅拌(其通过气通量调节)从而保持溶解氧(DO2)的浓度等于饱和值的30％，以及pH为大约5.0(需要时，通过滴加一些KOH 5M或H2SO4 10％(vol/vol)溶液来保持)。
在生长77小时后和140小时后，由2个发酵罐收集培养物样品，并且对这些样品进行实施例3所述的分析。
分析结果报告于表III中。
表III
Figure BDA0001338279350000231
该表中报告的数据清楚地证明了在所述的发酵条件下，Rhodosporidiumazoricum DSM 29495的变体会比野生型菌株生产和累积明显更高量的脂质。
实施例5(通过使用芦竹的木质纤维素水解产物作为营养物的“分批供料”培养)
在本实施例中评估与相同物种的野生型菌株相比，酵母Rhodosporidiumazoricum DSM 29495的变体菌株在“分批供料”发酵中的生物质生产和脂质的累积，其中使用衍生自芦竹的水热和酶处理的木质纤维素水解产物作为生长底物。
所用的芦竹的水解产物的组成包含葡萄糖224.75g/L,木糖107.19g/L,阿拉伯糖3.94g/L,纤维二糖16.65g/L,甘油4.24g/L,乙酸9.80g/L,5-羟甲基-糠醛0.74g/L，并且总氮浓度等于3.69g/L。分析过程类似于国际专利申请WO2014/102254中所述的那些。
通过装配有气体红外探测器(NDIR,非分散红外)并使用Shimadtzu研发的催化氧化方法来测定总氮。
为了制备发酵接种物，在2个2L烧瓶中，预先放置600mL介质，其由560mL“YEPD”介质(酵母提取物1g/L,蛋白胨10g/L和葡萄糖20g/L)和40mL得自芦竹的木质纤维素水解产物的混合物组成。
然后，使用10mL变体酵母菌株Rhodosporidium azoricum DSM 29495或相同物种的野生型菌株的培养物接种培养介质，这2个物种均是在“YEPD”介质中预先培养大约12小时，其又是由保持在-80℃下包含甘油15％(vol/vol)的悬液中的这2个酵母菌株的样品接种而来。
在搅拌条件下，将培养物在30℃下温育24小时。
将量等于550mL的各个细胞悬液分别接种于2个发酵罐中，其中预先放置了具有以下组成的发酵介质：芦竹的木质纤维素水解产物127mL/L,酵母提取物2g/L,玉米浆3g/L,KH2PO4 6g/L,MgSO4·7H2O 0.3g/L,NaCl 0,06g/L，CaCl2·2H2O 0.06g/L和(NH4)2SO4 4g/L。
对于生长的下一步而言，在各个发酵罐中供入由芦竹得到的木质纤维素水解产物(根据由这2种酵母菌株得到的碳源的消耗动力学)，从而保持培养物中葡萄糖的恒定浓度等于30g/L。由于得自芦竹的水解产物的总氮含量等于3.69g/L，所以供料还将此类营养源加入发酵罐中的培养物中。
生长在通过注气得到的需氧条件以及600至900rpm的搅拌(其通过空气通量调节从而保持溶解氧(DO2)的浓度等于饱和值的30％)以及pH等于6.0(需要时，通过滴加一些KOH 5M或H2SO4 10％(vol/vol)溶液来保持)的条件下进行。
在生长74小时后以及144小时后，由2个发酵罐收集培养物样品，并且对这些样品进行实施例3所述的分析。
分析结果报告于表IV中。
表IV
Figure BDA0001338279350000241

Claims (49)

1.物种Rhodosporidium azoricum的含油酵母变体，其特征在于具有细胞内脂质累积，其保藏在Leibniz-Institut DSMZ，保藏编号为DSM 29495。
2.根据权利要求1所述的含油酵母变体，其特征为当在富含氮源的培养介质中培养时，以高于或等于其细胞干重的60％的量在细胞内进行脂质累积。
3.根据权利要求2所述的含油酵母变体，其特征为当在富含氮源的培养介质中培养时，以其细胞干重的62％至70％的量在细胞内进行脂质累积。
4.根据权利要求1所述的含油酵母变体，当使用衍生自木质纤维素材料水解得到的底物作为氮源时，以高于或等于其细胞干重的40％的量累积脂质。
5.根据权利要求4所述的含油酵母变体，其中所述的底物为得自芦竹(Arundo donax)的水解产物。
6.根据权利要求4或5所述的含油酵母变体，其中以其细胞干重的45％至60％的量累积脂质。
7.一种用于获得含油酵母变体的方法，所述的方法包括以下步骤：
i.将含油酵母菌株的细胞暴露于诱变剂，从而在基因组DNA中产生随机突变；
ii.将经过所述诱变剂处理的细胞接种于培养介质中并培育，所述的培养介质的特征为存在浓度为20g/L至100g/L的至少一种碳源，并且其中存在至少一种氮源；
iii.将特征为较低密度的所述细胞与细胞培养物的培养介质分离；
其中在所述方法的步骤iii包括以下子步骤：
a)由所述的培养物收集样品，并加入适量的至少一种增稠剂；
b)在低速下离心如此获得的细胞悬液；
c)收集所得离心上清液的较高的级份，以便将特征为较低密度的细胞与所述的细胞培养物的其他部分分离；
d)在培养介质中接种在所述方法的子步骤c)中分离的所述上清液的较高的级份，并培育，其中所述培养介质的特征为存在浓度为20g/L至100g/L的至少一种碳源，并且其中存在至少一种氮源；
e)重复a)至d)的子步骤至少2次；
f)分离单个突变体集落；
其中所述的子步骤a)是通过向所述的培养物样品中添加山梨醇作为增稠剂，达到浓度至多为1M至3M。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的含油酵母变体选自：亚罗酵母属的物种(Yarrowia spp.),假丝酵母属的物种(Candida spp.),隐球菌属的物种(Cryptococcusspp.),丝孢酵母属的物种(Trichosporon spp.),光滑球拟酵母属的物种(Torulopsisspp.),油脂酵母属的物种(Lipomyces spp.),红酵母属的物种(Rhodotorula spp.)和红冬孢酵母属的物种(Rhodosporidium spp.)。
9.根据权利要求7所述的方法，其中步骤ii中所述的培养介质的特征为存在浓度为30g/L至50g/L的至少一种碳源。
10.根据权利要求7所述的方法，其中步骤ii中所述的至少一种氮源的浓度为3g/L至40g/L。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤ii中所述的至少一种氮源的浓度为5g/L至20g/L。
12.根据权利要求7所述的方法，其中步骤iii的子步骤d)中所述的培养介质的特征为存在浓度为30g/L至50g/L的至少一种碳源。
13.根据权利要求7所述的方法，其中步骤iii的子步骤d)中所述的至少一种氮源的浓度为3g/L至40g/L。
14.根据权利要求10所述的方法，其中步骤iii的子步骤d)中所述的至少一种氮源的浓度为5g/L至20g/L。
15.根据权利要求7所述的方法，其中步骤iii的子步骤e)中重复a)至d)的子步骤至少5至20次。
16.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法的步骤ii在10℃至40℃的温度下实施16至48个小时的时间。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法的步骤ii在20℃至30℃的温度下实施16至48个小时的时间。
18.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法的子步骤d)在10℃至40℃的温度下实施16至48个小时的时间。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述的方法的子步骤d)在20℃至30℃的温度下实施16至48个小时的时间。
20.根据权利要求7所述的方法，其中所用的含油酵母为Rhodosporidium azoricum。
21.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(i)的诱变过程是通过以下过程实施的：
i.通过将所述的酵母菌株暴露于波长为230nm至260nm的紫外辐射的物理方式；或者
ii.使用培养介质中浓度为0.1％至10％(vol/vol)的甲磺酸乙酯的化学方式，其中接种所述酵母菌株，并在所述的诱变剂存在下，将所述的培养物保持10分钟至12小时的时间。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在ii中在所述的诱变剂存在下，将所述的培养物保持1小时至8小时的时间。
23.根据权利要求7所述的方法，其中在所述方法的子步骤a)过程中收集的培养物体积相当于50OD660至200OD660的光密度。
24.根据权利要求7所述的方法，其中在所述方法的子步骤a)过程中收集的培养物体积相当于80OD660至150OD660的光密度。
25.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法的所述子步骤b)过程中的离心在500g至1000g的加速下实施1至5分钟的时间。
26.一种用于通过培养含油酵母变体Rhodosporidium azoricum DSM 29495来生产脂质的方法，其包括以下步骤：
i.制备培养介质，其包含：
○浓度为20g/L至100g/L的至少一种碳源；
○浓度为3g/L至40g/L的至少一种氮源；
ii.在所述的培养介质中培育所述的含油酵母变体；
iii.将所述的含油酵母变体的细胞与所述的培养介质分离；
iv.提取在所述酵母变体的细胞内累积的细胞内脂质。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述培养介质包含浓度为30g/L至50g/L的至少一种碳源。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述培养介质包含浓度为5g/L至20g/L的至少一种氮源。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述的培养是在以下条件下实施的：
i.在10℃至40℃的温度下；和/或
ii.进行50小时至200小时；和/或
iii.在需氧条件下，吹入无菌空气，并且在600至900转/分钟的搅拌下，并且采用气流调节，从而保持溶解氧的浓度等于饱和值的30％；和/或
iv.在4.5至7.0的pH下。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述的培养在20℃至30℃的温度下实施。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述的培养进行90小时至150小时。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述的培养在5.0至6.5的pH下进行。
33.根据权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述的培养是由量为所述介质总量的1vol/vol％至5vol/vol％的接种物开始的，该接种物得自在相同的介质中进行的所述酵母变体事先培养6至24小时的时间而得到的。
34.根据权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述的培养介质包含葡萄糖作为碳源，(NH4)2SO4作为氮源。
35.根据权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述的培养介质包含木质纤维素水解产物作为碳源。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述的木质纤维素水解产物衍生自以下的处理：
a.衍生自明确为能量应用而培育的培养物的产物，包括衍生自所述的产物或由它们的处理而得到的泔脚、残余物和废物；
b.衍生自农业的产物，包括衍生自所述的产物或其加工过程的泔脚、残余物和废物；
c.衍生自造林或林业的产物，包括衍生自所述产物或其加工过程的泔脚、残余物和废物；
d.用于人类营养或畜牧学的食品和农业产物的泔脚；
e.造纸工业残余物，经过非化学处理；
f.衍生自城市固体废物的再循环收集的废物；
g.藻类。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述明确为能量应用而培育的培养物是衍生自芦竹属(Arundo)、芒属(Miscanthus)或黍属(Panicum)的物种。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述衍生自农业的产物是衍生自飞廉属(Carduus)、银胶菊属(Parthenium)、玉米属(Zea)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、亚麻属(Linum)、芸苔属(Brassica)、甘蔗属(Saccharum)、油棕属(Elaeis)、椰子属(Attalea)的物种。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述衍生自城市固体废物的再循环收集的废物是衍生自植物来源、纸的废物。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述藻类是微藻类或大型藻类。
41.根据权利要求35所述的方法，其中所述的木质纤维素水解产物衍生自物种芦竹的处理，包括衍生自其加工过程的泔脚、残余物和废物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中芦竹的所述木质纤维素水解产物是通过水热处理以及随后的酶水解而获得的。
43.根据权利要求41所述的方法，其中芦竹的所述木质纤维素水解产物是通过蒸汽喷发以及随后的酶水解而获得的。
44.根据权利要求26-32中任一项所述的方法，其中培养物生长12至24小时，在接种物进一步以“分批补料”的方式实施后，然后加入水性葡萄糖溶液，从而所述介质中葡萄糖稳定浓度为25g/L至50g/L。
45.根据权利要求44所述的方法，其中在接种物进一步以“分批补料”的方式实施后进行90小时至200小时的时间。
46.根据权利要求44所述的方法，其中在接种物进一步以“分批补料”的方式实施后进行100至150小时的时间。
47.根据权利要求44所述的方法，其中培养物生长12至24小时，在接种物进一步以“分批供料”的方式实施后，此后加入木质纤维素水解产物，从而所述介质中总糖浓度稳定为25g/L至50g/L。
48.根据权利要求47所述的方法，其中在所述的接种物进一步以“分批供料”的方式实施后，进行90小时至200小时的时间。
49.根据权利要求47所述的方法，其中在所述的接种物进一步以“分批供料”的方式实施后，进行100至150小时的时间。
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