CN110885765B - 红酵母及其培养方法和在生产生物油脂中的应用 - Google Patents

红酵母及其培养方法和在生产生物油脂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株红酵母及其培养方法和在生产生物油脂中的应用。本发明的红酵母U13N3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019503。红酵母U13N3典型特征为产胡萝卜素能力缺失，在酵母提取物‑蛋白胨‑葡萄糖‑琼脂培养基上菌落呈类白色。红酵母U13N3能够利用多种碳源发酵，以甘油为碳源于37℃培养时，胞内油脂含量可达菌体干重65％。本发明的红酵母U13N3环境适应性广，能够利用多种廉价碳源高产生物油脂，胞内不含色素，有利于降低油脂提取时的杂质含量，提高油脂质量，具有良好的应用前景。

Description

红酵母及其培养方法和在生产生物油脂中的应用
技术领域
本发明涉及一株红酵母，其培养方法以及在生产生物油脂中的应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
生物柴油是以生物油脂为原料，经简单化学加工制成的可再生燃料，其与石化柴油热值相近，但污染物排放量低于后者，是较为理想的生物燃料之一。当前生产生物柴油的原料主要来自于植物油和部分动物脂肪。油脂原料供应受气候、环境的影响较大，数量和质量存在波动，不利于生物柴油的规模化生产。产油微生物(Oleaginous microorganisms)在一定条件下能将碳水化合物、碳氢化合物以及普通油脂等作为碳源转化为菌体内大量储存油脂，且储存的量超过生物量的20％，主要有酵母、霉菌、丝状真菌、藻类和细菌等。产油微生物生长环境可控，受外界影响较小，是今后油脂生产的发展方向之一。其中酵母、霉菌和藻类合成的甘油三酯与植物油脂组成相似，更有利于与现有生物柴油生产工艺结合。因此，已报道的产油微生物以酵母菌和霉菌类真菌居多。
红酵母属真菌(Rhodotorula spp.)作为一类可以大量积累生物油脂的微生物，具有培养条件简单、油脂转化率高、发酵成本低、周期短、发酵过程易于控制等优点，是目前研究最广泛的菌种之一。例如Li等发现圆红冬孢酵母Y4菌株在合适培养条件下能累积超过自身干重70％以上的油脂(Li YH,Liu B,Zhao ZB.Optimization of culture conditionsfor lipid production by Rhodosporidiumtoruloides[J].Chin J Biotechnol,2006,22(4):650-656.)。但是，红酵母细胞在合成生物油脂同时还会积累一定量的胡萝卜素类色素，菌株呈橙色至深红色。在油脂提取过程中，色素会不可避免的溶于提取产物中，造成产物杂质含量增加、感官和质量下降。这一缺陷使得油脂后提取工艺复杂成本增加，不利于红酵母的工业化应用。另外，红酵母菌株发酵最适温度通常在28～33℃，发酵过程中将消耗大量冷却水，造成水资源浪费、成本增加，特别是夏季在部分气温较高地区无法进行正常生产。寻找耐高温、合成胡萝卜素能力弱化或者缺失的红酵母将极大程度地克服上述缺点，提高工业化应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐高温、高效产油且不产生色素的红酵母U13N3及其培养方法以及在生产生物油脂中的应用。
发明人从一株马铃薯茎上分离筛选得到一株高产油脂的红酵母(Rhodotorulasp.)菌株。该红酵母菌株在30℃的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖-琼脂(YPD)培养基上培养3天后，菌落呈近圆形，表面光滑有光泽，中部略隆起，边缘整齐，菌落类白色。将菌落分散后在扫描电子显微镜下观察，菌体呈卵圆形，多个菌体连接成长链。将菌落悬浮在生理盐水中，长时间涡旋振荡，菌体长链不易分散。
发明人提取上述菌株的基因组DNA(包含部分SSU，ITS1，5.8S，ITS2和部分LSU)，使用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，将得到的PCR碱基序列(SEQ ID NO.1所示)在NCBI数据库中进行同源序列分析，所得结果被鉴定为一株新的红酵母，命名为红酵母(Rhodotorula sp.)U13N3。
本发明的高产油脂的红酵母(Rhodotorula sp.)U13N3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019503，保藏日期为2019年6月28日，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
本发明提供上述红酵母的培养方法，包括以下步骤：将红酵母U13N3种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5％～20％，于100～300rpm，pH3.5～7.5，20～42℃条件下发酵培养。
本发明还提供上述红酵母在生产生物油脂中的应用，包括以下步骤：
步骤1，发酵培养：将红酵母U13N3种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5％～20％，于100～300rpm，pH3.5～7.5，20～42℃条件下培养，得到发酵培养液；
步骤2，油脂提取：将发酵培养液经离心或者过滤处理，收集红酵母菌体，先用盐酸溶液将湿的红酵母菌体充分悬浮分散，再依次经65℃和100℃水浴处理，得到细胞破碎液，然后加入氯仿-甲醇混合溶剂，充分振荡并收集下层有机相，减压蒸发除去有机溶剂后，得到生物油脂。
本发明所述的发酵培养基中，碳源选自甘油、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的一种或几种，氮源选自蛋白胨、酵母粉、硝酸盐和铵盐中的一种或几种。
优选地，步骤1中，所述的培养时间为3～10天。
优选地，步骤1中，所述的发酵温度为35～37℃。
优选地，步骤1中，所述的发酵pH为4.5～6.5。
优选地，步骤2中，所述的氯仿-甲醇混合溶剂中，氯仿与甲醇的体积比为2:1。
优选地，步骤2中，所述的细胞破碎液与氯仿-甲醇混合溶剂的体积比为1:1。
优选地，步骤2中，采用6mol/L的盐酸溶液将湿的红酵母菌体充分悬浮分散，使得分散液中盐酸的终浓度为4mol/L。
优选地，步骤2中，65℃水浴处理时间为30min，100℃水浴处理时间为10min。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的红酵母U13N3颜色为类白色，而传统红酵母为红色，与传统红酵母相比，红酵母U13N3生产出的油脂色素含量显著降低，降低了后处理难度，提高生物油脂品质。
(2)本发明的红酵母U13N3环境适应性好，在35～37℃培养生长迅速，不仅有利于降低生产水耗、电耗，提高生产效率，而且又能节约大量冷却水的使用，保证了夏季的正常生产。
(3)本发明的红酵母U13N3能够利用甘油等廉价碳源高产生物油脂，油脂含量可达菌体干重75％，生产效率高、成本低，具有产业化潜力。
附图说明
图1为红酵母U13N3菌落形态图；
图2为红酵母U13N3菌体在扫描电子显微镜下的形态图；
图3为根据基因序列同源性比对结果构建的发育树图；
图4为从红酵母U13N3发酵液中提取的生物油脂实物图；
图5为从圆红酵母CBS:6016发酵液中提取的生物油脂实物图。
具体实施方式
下面结合实施例、对比例和附图对本发明作进一步的说明。
下述实施例中，油脂提取参考文献：【孔凡敏，赵祥颖，田延军，等.酸热法提取酵母油脂条件的研究[J].中国酿造，2010(5):143—146.】。
实施例1
发明人从一株马铃薯茎上分离筛选得到初始菌株。挑取生长在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖-琼脂(YPD)固体培养基上的单菌落，用生理盐水稀释涂布于新鲜YPD培养基，待生长出单菌落后，按照上述方法重新稀释涂布。经10次重复后，菌落与细胞形态保持一致，性状稳定。酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖-琼脂(YPD)固体培养基的组成为：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂粉。
该菌株在30℃的YPD固体培养基上培养3天后，菌落呈近圆形，表面光滑有光泽，中部略隆起，边缘整齐，菌落类白色(图1)。将菌落分散后在扫描电子显微镜下观察，菌体呈卵圆形，多个菌体连接成长链(图2)。将菌落悬浮在生理盐水中，长时间涡旋振荡，菌体长链不易分散。
提取该菌株的基因组DNA，采用引物：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后回收纯化PCR产物，交由苏州金唯智生物科技有限公司测序。测序得到有效序列长度为589bp，其序列如SEQ IDNO.1所示，测序结果与GenBank中的ITS序列进行同源性比对，然后构建系统发育树(图3)。同源性分析结果表明，该序列与红酵母属真菌序列具有较高的相似度，与圆红酵母模式菌CBS:6016(RhodotorulatoruloidesCBS:6016)具有最高的序列相似度，达98％。结合菌体形态特征、生长条件确定该菌株为红酵母属的一株新菌株，命名为红酵母U13N3(Rhodotorulasp.U13N3)。
实施例2
挑取1环生长在YPD固体培养基上的红酵母U13N3单菌落接种到20mL含有种子培养基的100mL摇瓶中，25℃培养48h，摇瓶转速100rpm，得到种子培养液。种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，K2HPO42g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO41.2g/L，pH为4.5。
取20mL种子液接种到含有80mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为10％，于100rpm，25℃条件下培养6d，得到发酵培养液。发酵培养基组成为：甘油30g/L，K2HPO42g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO41.2g/L，pH为6.5。
将所得的发酵液经离心处理，得到红酵母菌体。然后加入6mol/L盐酸至盐酸终浓度为4mol/L，随后65℃水浴处理30min，沸水浴处理10min，得到细胞破碎液。然后向该液体中加入等体积氯仿-甲醇(体积比2：1)混合液，充分振荡、离心收集含有油脂的下层有机相。减压蒸发除去有机溶剂后，回收剩余油脂(图4)。称重计算油脂在发酵液中浓度为5.8g/L。
对比例1
根据实施例2所述的方法，培养圆红酵母CBS:6016(I.Banno Q.M.Wang,F.Y.Bai,M.Groenew.&Boekhout,2015)，从所得的发酵菌体中提取得到红色油脂(图5)。称重计算油脂浓度为4.6g/L。所得产物感官和浓度均弱于红酵母U13N3所得产物。
实施例3
根据实施例2的方法将红酵母U13N3接种到种子培养基中，35℃培养24h，摇瓶转速300rpm，得到种子培养液。种子培养基组成为：甘油30g/L，K2HPO42g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO41.2g/L，pH为5.9。
所得到的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5％，于300rpm，37℃条件下培养9d，得到发酵培养液。发酵培养基组成为：甘油60g/L，K2HPO42g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO41.2g/L，pH为5.6。所得的发酵培养液经固液分离，得到红酵母菌体。
用生理盐水洗涤红酵母菌体1次，并根据实施例2所述的方法提取油脂，最终得到淡黄色产物。经计算油脂产量为19.8g/L，油脂含量为菌体干重的75.4％。
序列表
<110> 南京理工大学
<120> 红酵母及其培养方法和在生产生物油脂中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 589
<212> DNA
<213> 红酵母(Rhodotorula)
<400> 1
cctgcggaag gatcattagt gaatattagg gtgtccaact taacttggag cccgaccctc 60
actttctaac cctgtgcatt tgtcttgggt agtagcttgc gtcagcgagc gaatcccatt 120
tcacttacaa acacaaagtc tatgaatgta acaaatttat aacaaacaaa actttcaaca 180
acggatctct tggctctcgc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgatac gtaatgtgaa 240
ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacct tgcgctccat ggtattccgt 300
ggagcatgcc tgtttgagtg tcatgaattc ttcaacccac ctctttctta gtgaatcagg 360
cggtgtttgg attctgagcg ctgctggcct cacggcctag ctcgctcgta atgcattagc 420
atccgcaatc gaacttcgga ttgactcggc gtaatagact attcgctgag gattctggtc 480
tctgactgga gccgggtaag attaaaggaa gctactaatc ctcatgtcta tcttgagatt 540
agacctcaaa tcaggtagga ctacccgctg aacttaagca tatcaataa 589

Claims (10)

1.高产油脂的红酵母U13N3，保藏编号为CCTCC NO：M 2019503。
2.根据权利要求1所述的红酵母的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将红酵母U13N3种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5%～20%，于100～300rpm，pH3.5～7.5，20～42℃条件下发酵培养。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的发酵培养基中，碳源选自甘油、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的一种或几种，氮源选自蛋白胨、酵母粉、硝酸盐和铵盐中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的红酵母在生产生物油脂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，发酵培养：将红酵母U13N3种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5%～20%，于100～300rpm，pH3.5～7.5，20～42℃条件下培养，得到发酵培养液；
步骤2，油脂提取：将发酵培养液经离心或者过滤处理，收集红酵母菌体，先用盐酸溶液将湿的红酵母菌体充分悬浮分散，再依次经65℃和100℃水浴处理，得到细胞破碎液，然后加入氯仿-甲醇混合溶剂，充分振荡并收集下层有机相，减压蒸发除去有机溶剂后，得到生物油脂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤1中，所述的发酵培养基中，碳源选自甘油、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的一种或几种，氮源选自蛋白胨、酵母粉、硝酸盐和铵盐中的一种或几种。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤1中，培养时间为3～10天，发酵温度为35～37℃，发酵pH为4.5～6.5。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2中，所述的氯仿-甲醇混合溶剂中，氯仿与甲醇的体积比为2:1；所述的细胞破碎液与氯仿-甲醇混合溶剂的体积比为1:1。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2中，采用6 mol/L的盐酸溶液将湿的红酵母菌体充分悬浮分散，使得分散液中盐酸的终浓度为4mol/L。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2中，65℃水浴处理时间为30min，100℃水浴处理时间为10min。
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高产油脂红酵母的选育及培养条件优化;徐振杰等;《食品科学》;20110615(第11期);全文 *

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