CN114907988A - 一株裂殖壶菌、其发酵液及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种裂殖壶菌及其应用。该裂殖壶菌的分类命名为裂殖壶菌(Schizochytrium sp)LA5，所述裂殖壶菌已于2021年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.40014。所述裂殖壶菌应用于制备二十二碳六烯酸中。本发明涉及的裂殖壶菌具有适应温度范围大、生长速度块的特点，整个生产过程的调温成本更低，DHA的生产效率显著提高，具有很好的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株裂殖壶菌及其应用。
背景技术
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)是一种超长链多不饱和脂肪酸，其分子式为C22H32O2，属于ω-3型不饱和脂肪酸。DHA是一种人体必不可缺的脂肪酸，在人体内发挥多重生理功能。但是人体自身并不能直接合成DHA，绝大部分的DHA是以食物摄入的形式进入人体，还有一少部分通过亚麻酸转化形成。因此人们需要通过膳食补充足够的DHA来维持身体健康。在人体中，DHA仅存在于特定的组织中，如大脑皮层、视网膜、神经系统、母乳等，具有健脑、提高记忆力和视力的功能，尤其可以促进胎儿和婴幼儿脑细胞发育生长，提高青少年记忆力，防治老年性痴呆等。
当前DHA的生产主要是采用裂殖壶菌(Schizochytrium sp)发酵的方法，裂殖壶菌细胞中的油脂组成较为简单，主要由不饱和的DHA和DPA，以及饱和的棕榈酸(C16:0)三种脂肪酸组成。目前，裂殖壶菌已被广泛的应用于DHA的商业化生产中。
中国专利CN104593270A公开了一株裂殖壶菌及粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法，该菌株为裂殖壶菌经紫外诱变获得，与原菌株相比，棕榈酸含量提高50％而DHA降低30％，不仅能以生物柴油副产品粗甘油为碳源快速生长和积累油脂，而且其油脂组成更适宜用于生产生物柴油。
中国专利CN103882072A公开了一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，该发明应用于大规模发酵生产二十二碳六烯酸，能提高裂殖壶菌的生物量和DHA含量，使DHA油脂产品品质大大提高，进一步提高油脂品质，降低能量消耗及生产成本。
中国专利CN105420122A公开了一种可高密度培养的裂殖壶菌及其生产富含DHA的油脂的方法，该发明利用裂殖壶菌生产富含DHA油脂的特性，以该裂殖壶菌为出发菌株，经高密度发酵收集菌体，提取富含DHA的油脂，最终生物量可达170-190g/L，其中DHA产量可达25g/L。
但是目前如何筛选高产DHA的菌种仍然是困扰产业发展的主要问题，因为油脂组成对微生物抵抗温度胁迫具有重要的作用，低温耐受条件下会过表达不饱和脂肪酸，只有在较高温度下不饱和脂肪酸表达量才会恢复正常。
因此，发明人在载体温度较低的海洋水域取样、筛选裂殖壶菌，期望得到能够在低温下生长速度快且高产DHA的菌种。
发明内容
本发明提供一株裂殖壶菌、其发酵液，以及该菌株在二十二碳六烯酸制备中的应用，能够解决上述现有技术问题中的一种或多种。
根据本发明的一个方面，提供了一株裂殖壶菌(Schizochytrium sp)LA5，该菌株已于2021年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.40014。
该裂殖壶菌的形态为：呈圆球形，直径为3-15μm，胞内有颗粒状的油脂。
该菌在较广的生长温度下都能够生长，最适的生长温度10-35℃，可以满足不同季节、温度条件下的生产需求，冬季可以在10-15℃的低温下发酵，而夏季则可以在30-35℃条件下发酵，能够减少生产过程中用于调节温度的能源消耗。
根据本发明的另一个方面，提供了上述裂殖壶菌的发酵液，该发酵液通过以下步骤制得：
A1菌种培养：将裂殖壶菌接入种子培养基，培养得种子液；
A2发酵：将A1中的种子液转接入发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液。
在一些实施方式中，种子培养基的配比为：碳源15-45g/L，酵母浸提物1-5g/L，蛋白胨1-5g/L，海水晶10-30g/L；发酵培养基的配比为：碳源50-100g/L，酵母浸提物2-8g/L，蛋白胨2-8g/L，海水晶10-30g/L，MgSO4·7H2O1-10g/L，MgCl2·6H2O 1-10g/L，CaCl2·2H2O1-10g/L，KCl 1-10g/L，KH2PO4 0.1-10g/L。
根据本发明的再一个方面，提供了利用上述裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法。具体地，以所述裂殖壶菌为出发菌株，在发酵培养基中高密度发酵，获得菌体细胞，经过细胞破碎、提取而制备DHA油脂。
该裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法包括以下步骤：
S1菌种培养：将裂殖壶菌接入种子培养基，培养得种子液；
S2发酵：将S1中的种子液转接入发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液；
S3提取：发酵结束后，获得菌体细胞，经过细胞破碎、提取，制备DHA油脂。
在一些实施方式中，种子培养基的配比为：碳源15-45g/L，酵母浸提物1-5g/L，蛋白胨1-5g/L，海水晶10-30g/L；发酵培养基的配比为：碳源50-100g/L，酵母浸提物2-8g/L，蛋白胨2-8g/L，海水晶10-30g/L，MgSO4·7H2O1-10g/L，MgCl2·6H2O 1-10g/L，CaCl2·2H2O1-10g/L，KCl 1-10g/L，KH2PO4 0.1-10g/L；其中，碳源为葡萄糖或蔗糖。
在一些实施方式中，种子液的制备方法为：将裂殖壶菌接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在15-30℃的温度条件下，以100-200rpm的转速培养12-48h，获得种子液。
在一些实施方式中，种子液的制备还包括扩大培养步骤，其具体方法为：将裂殖壶菌接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在15-30℃的温度条件下，以100-200rpm的转速培养12-48h，获得摇瓶种子液；再将摇瓶种子液接入种子培养基中，接种量为0.5％-10％，温度15-30℃，通气量0.1-1.5vvm，以10-300rpm的转速培养12-48h，获得一级种子液。
在一些实施方式中，一级种子液还可以按照相同步骤继续扩大培养，以获得二级种子液或三级种子液。
在一些实施方式中，采用两阶段变温的发酵方式：种子液用量为发酵培养基体积的5-10％，接种后培养条件为通气量0.1-1.5vvm，搅拌转速10-300rpm，温度为20-30℃，进行第一阶段发酵，持续24-48h；之后将温度调节为10-20℃，进行第二阶段发酵，持续48-96h。由此，为裂殖壶菌的发酵提供优良的环境条件，菌体可以有效利用培养基中的营养成分，一方面促进菌体的生长和繁殖，另一方面也有利于促进DHA油脂的生产。
在一些实施方式中，第一阶段发酵的温度条件为25℃，第二阶段发酵的温度条件为15℃。
本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果：
1、本发明筛选得到一株可在较低温度下高产DHA油脂的裂殖壶菌，该菌株能在10-35℃条件下快速生长，并大量积累二十二碳六烯酸；
2、本发明所得菌株生长速度快，利用裂殖壶菌菌株高密度发酵，结合两阶段变温的发酵方式，最终得到的细胞干重及油脂量更大，DHA含量更高；
3、本发明所得菌株从海南省东寨港红树林旅游区周边海域中筛选得到，该菌株在较广的生长温度下都能够生长，能够减少生产过程中用于调节温度的能源消耗，显著降低DHA的生产成本，具有很好的工业应用价值。
附图说明
图1为本发明提供的裂殖壶菌LA5菌株在显微镜下的形态；
图2为本发明实施例2发酵结果的气相图；
图3为本发明实施例3发酵结果的气相图；
图4为本发明实施例4发酵结果的气相图；
图5为本发明实施例5发酵结果的气相图。
具体实施方式
实施例1(菌种鉴定)
本实施例提供了一种裂殖壶菌，其分类命名为裂殖壶菌(Schizochytrium sp)LA5，该菌株已于2021年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.40014。
该裂殖壶菌菌株是从海南省东寨港红树林旅游区周边海域收集的腐叶上采用松花粉垂钓法分离得到。在光学显微镜下观察：菌体呈圆球形，直径为3-15μm，胞内有颗粒状的油脂(参见图1)。气相分析后发现，其多不饱和脂肪酸油脂主要是由二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸组成(DPA)，其中DHA含量在40-55％左右，由此可见该菌含有较高的DHA组成。提取菌种基因组，用分子生物学手段对其18S rDNA序列进行比对，发现该菌株与裂殖壶菌的18S rDNA序列的同源性大于99％，因此判定本菌株属于裂殖壶菌，该菌株的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2(发酵温度为35℃)
本实施例提供了一种裂殖壶菌在制备二十二碳六烯酸中的应用，采用的菌株为实施例1中的裂殖壶菌(Schizochytrium sp)LA5。
本实施例的具体步骤如下：
(1)将菌株接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，种子培养基的配比为：葡萄糖15g/L，酵母浸提物1g/L，蛋白胨1g/L，海水晶10g/L。接种后置于恒温摇床上，控制温度为30℃，转速为200rpm，培养36h，获得种子液。
(2)将步骤(1)中的种子液按10％(v/v)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基的配比为：葡萄糖50g/L，酵母浸提物2g/L，蛋白胨2g/L，海水晶10g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MgCl2·6H2O 1g/L，CaCl2·2H2O1g/L，KCl 1g/L，KH2PO4 0.1g/L。接种后通入无菌空气培养，通气量为1.5vvm，搅拌转速10rpm，在罐温35℃的条件下进行发酵培养。
发酵144小时后，测得发酵罐中菌体干重达到139g/L，获得油脂40.05g/L，DHA产量为15.61g/L，占总脂肪酸的比例为39％。
实施例3(发酵温度为25℃)
本实施例提供了一种裂殖壶菌在制备二十二碳六烯酸中的应用，采用的菌株为实施例1中的裂殖壶菌(Schizochytrium sp)LA5。
本实施例的具体步骤如下：
(1)将菌株接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，种子培养基的配比为：蔗糖45g/L，酵母浸提物5g/L，蛋白胨5g/L，海水晶30g/L。接种后置于恒温摇床上，控制温度为25℃，转速为200rpm，培养36h，获得摇瓶种子液。
(2)将步骤(1)中的摇瓶种子液接入种子培养基中，接种量为培养基体积0.5％，温度25℃，通气量1.5vvm，以300rpm的转速培养12h，获得一级种子液。
(3)将步骤(2)中的一级种子液按10％(v/v)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基的配比为：蔗糖100g/L，酵母浸提物8g/L，蛋白胨8g/L，海水晶30g/L，MgSO4·7H2O 10g/L，MgCl2·6H2O 10g/L，CaCl2·2H2O10g/L，KCl 10g/L，KH2PO4 10g/L。接种后通入无菌空气培养，通气量为1.5vvm，搅拌转速100rpm，在罐温25℃的条件下进行发酵培养。
发酵144小时后，测得发酵罐中菌体干重达到112g/L，获得油脂60.48g/L，DHA产量为27.2g/L，占总脂肪酸的比例为49％。
实施例4(发酵温度为15℃)
本实施例提供了一种裂殖壶菌在制备二十二碳六烯酸中的应用，采用的菌株为实施例1中的裂殖壶菌(Schizochytrium sp)LA5。
本实施例的具体步骤如下：
(1)将菌株接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，种子培养基的配比为：葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，酵母浸提物3g/L，蛋白胨2g/L，海水晶20g/L。接种后置于恒温摇床上，控制温度为25℃，转速为180rpm，培养60h，获得种子液。
(2)将步骤(1)中的种子液按10％(v/v)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基的配比为：葡萄糖35g/L,蔗糖35g/L，酵母浸提物5g/L，蛋白胨6g/L，海水晶20g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，MgCl2·6H2O 5g/L，CaCl2·2H2O 5g/L，KCl 5g/L，KH2PO4 4g/L。接种后通入无菌空气培养，通气量为2vvm，搅拌转速200rpm，在罐温15℃的条件下进行发酵培养。
发酵144小时后，测得发酵罐中菌体干重达到98.9g/L，获得油脂40.43g/L，DHA产量为22.2g/L，占总脂肪酸的比例为55％。
实施例5(两阶段变温发酵)
本实施例提供了一种裂殖壶菌在制备二十二碳六烯酸中的应用，采用的菌株为实施例1中的裂殖壶菌(Schizochytrium sp)LA5。
本实施例的具体步骤如下：
(1)将菌株接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，种子培养基的配比为：葡萄糖45g/L，酵母浸提物5g/L，蛋白胨5g/L，海水晶30g/L。接种后置于恒温摇床上，控制温度为25℃，转速为180rpm，培养48h，获得种子液。
(2)将步骤(1)中的种子液按10％(v/v)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基的配比为：蔗糖100g/L，酵母浸提物8g/L，蛋白胨8g/L，海水晶30g/L，MgSO4·7H2O 10g/L，MgCl2·6H2O 10g/L，CaCl2·2H2O10g/L，KCl 10g/L，KH2PO4 10g/L。接种后通入无菌空气培养，通气量为1.5vvm，搅拌转速300rpm，在罐温25℃的条件下进行发酵48小时；之后将罐温调整到15℃，再发酵96小时。
发酵结束后，测得发酵罐中菌体干重达到121g/L，获得油脂78.7g/L，DHA产量为40.92g/L，占总脂肪酸的比例为52％。
根据上述测试结果可知，本发明提供的裂殖壶菌(Schizochytrium sp)LA5的温度适应性较强，可在较大的温度范围内持续生长，使用该菌株制备DHA能够减少生产过程中用于调节温度的能源消耗，显著降低生产成本，具有很好的工业应用价值。
在优选的实施例5中，采取两阶段变温的发酵方式，可进一步地提高油脂产量，以获得更多的DHA产品。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏远大仙乐药业有限公司、浙江仙居仙乐药业有限公司
<120> 一株裂殖壶菌、其发酵液及其应用
<130> 348
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 867
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌（Schizochytrium sp）
<400> 1
taggggctcc ttattagatt gagccgattt tattggtgaa tcatgataat tgagcagatt 60
gacttttttg gtcaatgaat cgtttgagtt tctgccccat cagttgtcaa cggtagggta 120
ttggactacg gggactataa cgggggacgg aaagttaggg ctcgactccg gaaagggagc 180
ctgaaaaacg gctaccatat ccaaggatag caccaggcgc gtaaattacc cacgggggac 240
tccccaaggt agggacaaaa aatatcaatg caaaccgggt atgcgttttg ctatcggaat 300
gaaagcaatg taaaaccctc ttcaaggatc aactggaggg caagtctggg gccagcagcc 360
gcggtaattc cagctccaaa agcatatgct aaagttgttg cagttaaaaa gctcgaagtt 420
gaatttctgg catgggcgac cggggctttc cctgaatggg gattgattgc ctgggttgcc 480
ttggccatct ttttctttcc tttttgggga aaaaatcttt cccggaaatc aaagcaaagg 540
gttccaagca ggccgaataa ccggtatgtt tattatggga tgataaaata ggatttgggg 600
gctattttgt tggtttgccc ccctgattaa gggttaatag gaacagttgg gggtattcgt 660
atttaggacc taaaggtgaa attcttggaa tttccaaaga acaaactaaa gcgaaggctt 720
ttaccaagct tgttttcttt attcaggacc gaaagtctgg ggaatcaaaa atgattagat 780
cccttcgtaa tcctaaaccg taaaccaatg cccaacttgg cgattggtgg ggggcttttt 840
ttatggggcc cctcaaggag ccccttg 867
Claims (10)
1.一株裂殖壶菌，其特征在于，其分类命名为裂殖壶菌(Schizochytrium sp)LA5，所述裂殖壶菌已于2021年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.40014。
2.权利要求1所述裂殖壶菌的发酵液，其特征在于，该发酵液通过以下步骤制得：
A1菌种培养：将裂殖壶菌接入种子培养基，培养得种子液；
A2发酵：将A1中的种子液转接入发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液。
3.根据权利要求2所述的发酵液，其特征在于，所述种子培养基的配比为：碳源15-45g/L，酵母浸提物1-5g/L，蛋白胨1-5g/L，海水晶10-30g/L；所述发酵培养基的配比为：碳源50-100g/L，酵母浸提物2-8g/L，蛋白胨2-8g/L，海水晶10-30g/L，MgSO4·7H2O 1-10g/L，MgCl2·6H2O 1-10g/L，CaCl2·2H2O 1-10g/L，KCl 1-10g/L，KH2PO4 0.1-10g/L。
4.一种利用权利要求1所述裂殖壶菌的高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于，以CGMCC NO.40014菌株为出发菌株，在发酵培养基中高密度发酵，制得富含DHA的油脂。
5.根据权利要求4所述的高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1菌种培养：将裂殖壶菌接入种子培养基，培养得种子液；
S2发酵：将S1中的种子液转接入发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液；
S3提取：发酵结束后，获得菌体细胞，经过细胞破碎、提取，制备DHA油脂。
6.根据权利要求5所述的高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于，所述种子培养基的配比为：碳源15-45g/L，酵母浸提物1-5g/L，蛋白胨1-5g/L，海水晶10-30g/L；所述发酵培养基的配比为：碳源50-100g/L，酵母浸提物2-8g/L，蛋白胨2-8g/L，海水晶10-30g/L，MgSO4·7H2O 1-10g/L，MgCl2·6H2O 1-10g/L，CaCl2·2H2O 1-10g/L，KCl 1-10g/L，KH2PO40.1-10g/L。
7.根据权利要求5所述的高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于，步骤S1具体操作如下：
①将裂殖壶菌接入装有种子培养基的摇瓶中，在15-30℃的温度条件下，以100-200rpm的转速培养12-48h，获得摇瓶种子液；
②取①中所得摇瓶种子液接入种子培养基中，接种量为0.5％-10％，温度15-30℃，通气量0.1-1.5vvm，以10-300rpm的转速培养12-48h，获得一级种子液。
8.根据权利要求7所述的高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于，所述一级种子液可以按照步骤②继续扩大培养。
9.根据权利要求5所述的高密度发酵生产DHA油脂的方法，其特征在于，步骤S2采用两阶段变温的发酵方式：种子液用量为发酵培养基体积的5-10％，接种后培养条件为通气量0.1-1.5vvm，搅拌转速10-300rpm，温度为20-30℃，进行第一阶段发酵，持续24-48h；之后将温度调节为10-20℃，进行第二阶段发酵，持续48-96h。
10.通过权利要求4-9任一项所述方法获得的DHA油脂在食品或饲料制备领域中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN116555042A (zh) * | 2023-03-09 | 2023-08-08 | 安徽天凯生物科技有限公司 | 一株裂殖壶菌及其在发酵生产双低dha藻油中的应用 |
| CN117844646A (zh) * | 2023-12-14 | 2024-04-09 | 陕西海斯夫生物工程有限公司 | 一株高产dha的裂殖壶菌及其应用 |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN1916156A (zh) * | 2006-07-10 | 2007-02-21 | 温州大学 | 裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771及其在制备DHA粉末和油脂中的应用 |
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| CN116555042B (zh) * | 2023-03-09 | 2023-11-07 | 安徽天凯生物科技有限公司 | 一株裂殖壶菌及其在发酵生产双低dha藻油中的应用 |
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